Una tecnica tridimensionale per la visualizzazione dei cambiamenti ultrastrutturali mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche

Summary

Questo protocollo descrive come ricostruire le creste mitocondriali per ottenere immagini 3D con elevata precisione, alta risoluzione e throughput elevato.

Abstract

Comprendere le caratteristiche dinamiche dell’ultrastruttura dell’organello cellulare, che non è solo ricca di informazioni sconosciute ma anche sofisticata da una prospettiva tridimensionale (3D), è fondamentale per gli studi meccanicistici. La microscopia elettronica (EM) offre una buona profondità di imaging e consente la ricostruzione di pile di immagini ad alta risoluzione per studiare la morfologia ultrastrutturale degli organelli cellulari anche su scala nanometrica; pertanto, la ricostruzione 3D sta acquisendo importanza grazie ai suoi incomparabili vantaggi. La microscopia elettronica a scansione (SEM) fornisce una tecnologia di acquisizione delle immagini ad alta produttività che consente di ricostruire grandi strutture in 3D dalla stessa regione di interesse in sezioni consecutive. Pertanto, l’applicazione del SEM nella ricostruzione 3D su larga scala per ripristinare la vera ultrastruttura 3D degli organelli sta diventando sempre più comune. In questo protocollo, suggeriamo una combinazione di sezione ultrasottile seriale e tecniche di ricostruzione 3D per studiare le criste mitocondriali nelle cellule tumorali pancreatiche. I dettagli di come vengono eseguite queste tecniche sono descritti in questo protocollo in modo dettagliato, incluso il metodo osmio-tiocarboidrazide-osmio (OTO), l’imaging seriale a sezione ultrasottile e il display di visualizzazione.

Introduction

I mitocondri sono uno degli organelli più importanti della cellula. Servono come hub centrale della bioenergetica cellulare e del metabolismo ^1,2 e svolgono un ruolo critico nel cancro³. Il cancro del pancreas (PC) è uno dei tumori più difficili^{da trattare 4} a causa della sua rapida diffusione e dell’alto tasso di mortalità. La disfunzione mitocondriale, causata principalmente da cambiamenti nella morfologia mitocondriale 3,5,6,7^, è stata collegata ai meccanismi patologici alla base del PC⁸. I mitocondri sono anche altamente dinamici, il che si riflette nei frequenti e dinamici cambiamenti nella loro connettività di rete e nella struttura della crisi⁹. Il rimodellamento della struttura delle cristae può avere un impatto diretto sulla funzione mitocondriale e sullo stato cellulare 10,11, che sono significativamente alterati durante la crescita delle cellule tumorali, le metastasi e i cambiamenti del microambiente tumorale ^12,13.

Negli ultimi anni, gli scienziati hanno studiato questo organello utilizzando l’osservazione EM^14,15,16,17; ad esempio, i ricercatori hanno analizzato le dinamiche mitocondriali utilizzando tecniche di ricostruzione 3D 6,7,18,19. Il concetto generale e il metodo per la ricostruzione 3D delle immagini di microscopia elettronica sono stati formalmente stabiliti già nel 1968²⁰ e prevedevano la combinazione di microscopia elettronica, diffrazione elettronica e elaborazione di immagini al computer per ricostruire la coda del fago T4. Fino ad ora, la tecnologia di imaging 3D al microscopio elettronico ha fatto progressi significativi in termini di risoluzione dell’immagine²¹, grado di automazione 22 e volume di elaborazione 23 ed è stata utilizzata su scala sempre più ampia nella ricerca biologica, dal livello del tessuto al livello dell’ultrastruttura dell’organello alla scala nanometrica²⁴. Negli ultimi anni, l’imaging 3D al microscopio elettronico è diventato anche una tecnologia promettente per una vasta gamma di applicazioni^25,26,27.

La crescente attenzione alle creste mitocondriali illustra in particolare i requisiti essenziali per l’imaging del volume ultrastrutturale. La microscopia elettronica a trasmissione (TEM) è stata utilizzata per visualizzare campioni raccolti su una griglia di rame (400 mesh)²⁸, con il fascio di elettroni che passa attraverso la sezione. Tuttavia, a causa della portata limitata della griglia di rame, è impossibile visualizzare completamente le fette continue dello stesso campione²⁹. Ciò complica lo studio delle strutture target durante l’imaging TEM. Inoltre, TEM si basa su attività manuali dispendiose in termini di tempo e soggette a errori, tra cui il taglio e la raccolta di più sezioni e l’imaging sequenziale²¹, quindi non è adatto per ricostruzioni ultrastrutturali di campioni di grandi volumi²³. Attualmente, la ricostruzione ad alta risoluzione dell’imaging di campioni di grandi volumi è ottenuta attraverso l’uso di apparecchiature specializzate, come il TEM camera array (TEMCA)³⁰ o due sistemi TEMCA di seconda generazione (TEMCA2)³¹, che consentono l’imaging automatizzato ad alta produttività in breve tempo. Tuttavia, questo tipo di imaging non ha il vantaggio di essere facile da ottenere e universale a causa della necessità di apparecchiature personalizzate.

Rispetto al TEM, il metodo per generare automaticamente migliaia di immagini volumetriche seriali per grandi aree basato su SEM ^32,33 migliora l’efficienza e l’affidabilità dell’imaging seriale e offre risoluzioni z più elevate³⁴. Ad esempio, la microscopia elettronica a scansione seriale a scansione a faccia bloccata (SBF-SEM) e la microscopia elettronica a scansione a fascio ionico focalizzato (FIB-SEM) hanno entrambi permesso di ottenere la ricostruzione 3D di ultrastrutture con alta velocità, efficienza e risoluzione^35,36. Tuttavia, è inevitabile che la superficie del blocco venga rasata meccanicamente dal coltello diamantato dell’SBF-SEM o mediante fresatura con il fascio ionico focalizzato di FIB-SEM^33,37. A causa della distruttività dei due metodi per i campioni, non è possibile ricostruire nuovamente la stessa struttura target per ulteriori analisi^38,39,40. Inoltre, pochi studi hanno tentato di ricostruire l’ultrastruttura dell’organello 3D delle cellule tumorali utilizzando EM per osservare i cambiamenti patologici¹². Per questi motivi, al fine di chiarire ulteriormente i meccanismi patologici delle cellule tumorali, come le cellule tumorali pancreatiche, proponiamo una nuova tecnologia per la ricostruzione 3D di immagini in sezione seriale utilizzando un ultramicrotomo e un microscopio elettronico a scansione ad emissione di campo (FE-SEM) per analizzare l’ultrastruttura mitocondriale a livello di cristae; Con questa tecnologia, i dati ad alta risoluzione possono essere acquisiti utilizzando un metodo efficiente e accessibile. Le sezioni ultrasottili seriali realizzate con un ultramicrotomo possono essere memorizzate in modo semi-permanente in una custodia a griglia e rivisualizzate più volte, anche dopo diversi anni⁴¹. FE-SEM è molto apprezzato come strumento in vari campi di ricerca grazie alla sua capacità di fornire immagini ad alta risoluzione, alto ingrandimento e versatilità⁴². Nel tentativo di visualizzare la struttura fine degli organelli in 3D, la tecnica per la produzione di pile di immagini seriali 2D con risoluzione utile utilizzando elettroni retrodiffusi prodotti da FE-SEM ^43,44 può anche essere utilizzata per ottenere immagini ad alta produttività e multiscala di regioni target o delle loro strutture associate senza attrezzature speciali ⁴⁵. La generazione di artefatti di carica influisce direttamente sulla qualità delle immagini acquisite, quindi è particolarmente importante mantenere breve il tempo di permanenza.

Pertanto, il presente studio elabora le procedure sperimentali impiegate in questa tecnica SEM per ricostruire la struttura 3D delle creste mitocondriali⁴⁶. In particolare, mostriamo il processo sviluppato per ottenere la segmentazione semi-automatica delle regioni mitocondriali e digitalizzare la ricostruzione 3D utilizzando il software Amira, che prevede anche la realizzazione di campioni di fette utilizzando il metodo convenzionale di preparazione dei campioni OTO^44,47, il completamento della raccolta di sezioni utilizzando il taglio ultramicrotomo e l’acquisizione di dati 2D sequenziali tramite FE-SEM.

Protocol

1. Preparazione del materiale Coltura 2 x 106 cellule Panc02 in 12 ml di terreno DMEM (10% siero fetale bovino e 100 U/mL di penicillina-streptomicina), e mantenere a 37 °C e 95% di umidità in un’atmosfera di 5% di anidride carbonica e 95% di aria per 48 ore. Raccogliere le cellule Panc02, centrifugare a 28 x g per 2 minuti, quindi eliminare il surnatante. Assicurarsi che il campione sia di dimensioni adeguate (1 x 107 celle), altrimenti i seguenti pas…

Representative Results

Durante la coltura cellulare (Figura 1A), abbiamo prima diviso le cellule tumorali pancreatiche in un gruppo di controllo coltivato con terreno di coltura completo, un gruppo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un attivatore della ferroptosi, 100 nM) e un gruppo RSL3 (100 nM) più ferrostatina-149 (Fer-1, un inibitore della ferroptosi, 100 nM). Attraverso le fasi sperimentali di cui sopra, il microscopio elettronico a scansione ha acquisito 38 (Figura supple…

Discussion

Il metodo qui presentato è un’utile guida passo-passo per applicare la tecnica di ricostruzione 3D, che prevede l’applicazione della microscopia elettronica e della tecnologia di elaborazione delle immagini all’impilamento e alla segmentazione di immagini tomografiche 2D generate da sezioni seriali ultrasottili. Questo protocollo evidenzia una limitazione delle immagini 2D che può essere affrontata dalla visualizzazione 3D dell’ultrastruttura dell’organello, che presenta i vantaggi di una forte riproducibilità delle s…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2