Трехмерная методика визуализации ультраструктурных изменений митохондрий в раковых клетках поджелудочной железы

Summary

Этот протокол описывает, как реконструировать митохондриальные кристы для получения 3D-визуализации с высокой точностью, высоким разрешением и высокой пропускной способностью.

Abstract

Понимание динамических особенностей ультраструктуры клеточных органелл, которая не только богата неизвестной информацией, но и сложна с трехмерной (3D) точки зрения, имеет решающее значение для механистических исследований. Электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает хорошую глубину изображения и позволяет реконструировать стеки изображений с высоким разрешением для исследования ультраструктурной морфологии клеточных органелл даже в нанометровом масштабе; Поэтому 3D-реконструкция приобретает все большее значение благодаря своим несравненным преимуществам. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) представляет собой высокопроизводительную технологию получения изображений, которая позволяет реконструировать большие структуры в 3D из одной и той же интересующей области на последовательных срезах. Поэтому применение СЭМ в крупномасштабной 3D-реконструкции для восстановления истинной 3D-ультраструктуры органелл становится все более распространенным. В этом протоколе мы предлагаем комбинацию серийных ультратонких срезов и методов 3D-реконструкции для изучения митохондриальных крист в клетках рака поджелудочной железы. Подробная информация о том, как выполняются эти методы, описана в этом протоколе пошагово, включая метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (OTO), последовательную визуализацию ультратонких срезов и дисплей визуализации.

Introduction

Митохондрии являются одними из самых важных органелл в клетке. Они служат центральным узлом клеточной биоэнергетики и метаболизма ^1,2 и играют важнейшую роль в развитии рака³. Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из самых трудно поддающихся лечению онкологических заболеваний^из-за его быстрого распространения и высокого уровня смертности. Митохондриальная дисфункция, которая в основном вызвана изменениями в морфологии митохондрий 3,5,6,7^, связана с механизмами заболевания, лежащими в основе ПК⁸. Митохондрии также очень динамичны, что отражается в частых и динамичных изменениях в их сетевой связности и структуре крист⁹. Изменение структуры крист может непосредственно влиять на функцию митохондрий и клеточное состояние 10,11, которые значительно изменяются во время роста опухолевых клеток, метастазирования и изменений микроокружения опухоли ^12,13.

В последние годы ученые изучали эту органеллу с помощью ЭМ-наблюдений^14,15,16,17; Например, исследователи проанализировали динамику митохондрий с помощью методов 3D-реконструкции 6,7,18,19. Общая концепция и метод 3D-реконструкции изображений электронной микроскопии были официально установлены еще в 1968 году и включали в себя сочетание электронной микроскопии, электронной дифракции^и компьютерной обработки изображений для реконструкции фагового хвоста Т4. До настоящего времени технология 3D-визуализации электронной микроскопии добилась значительных успехов с точки зрения разрешения изображения 21, степени автоматизации²² и объема обработки²³ и использовалась во все более широком масштабе в биологических исследованиях, от уровня тканей до уровня ультраструктуры органелл в нанометровом масштабе²⁴. В последние годы 3D-визуализация в электронной микроскопии также стала перспективной технологией для широкого спектра применений^25,26,27.

Растущее внимание к митохондриальным кристам особенно иллюстрирует основные требования к визуализации ультраструктурного объема. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ) была использована для визуализации образцов, собранных на медной сетке (400 меш)²⁸, при этом электронный пучок проходит через разрез. Однако из-за ограниченного диапазона медной сетки невозможно полностью отобразить непрерывные срезы одного и того же образца²⁹. Это усложняет изучение структур-мишеней при ПЭМ-визуализации. Кроме того, ПЭМ полагается на трудоемкие и подверженные ошибкам ручные задачи, включая вырезание и сбор нескольких срезов и их последовательную визуализацию²¹, поэтому он не приспособлен для ультраструктурных реконструкций образцов большого объема²³. В настоящее время реконструкция изображений больших объемов образцов с высоким разрешением достигается за счет использования специализированного оборудования, такого как массив камер TEM (TEMCA)³⁰ или две системы TEMCA второго поколения (TEMCA2)³¹, которые позволяют автоматизировать высокопроизводительную визуализацию за короткое время. Тем не менее, этот тип визуализации не имеет преимущества в том, что он прост в получении и универсален из-за необходимости индивидуального оборудования.

По сравнению с ПЭМ, метод автоматической генерации тысяч последовательных объемных изображений для больших площадей на основе SEM ^32,33 повышает эффективность и надежность последовательной визуализации и обеспечивает более высокое z-разрешение³⁴. Например, серийная блочная сканирующая электронная микроскопия (SBF-SEM) и сканирующая электронная микроскопия с фокусированным ионным пучком (FIB-SEM) позволили достичь 3D-реконструкции ультраструктуры с высокой скоростью, эффективностью и разрешением^35,36. Тем не менее, поверхность блока неизбежно срезается механическим способом алмазным ножом SBF-SEM или фрезерованием сфокусированным ионным пучком FIB-SEM^33,37. Из-за деструктивного действия двух методов на образцы невозможно повторно реконструировать ту же структуру мишени для дальнейшего анализа^38,39,40. Кроме того, в нескольких исследованиях была предпринята попытка реконструировать ультраструктуру 3D-органелл раковых клеток с помощью ЭМ для наблюдения за патологическими изменениями¹². По этим причинам для дальнейшего выяснения патологических механизмов раковых клеток, таких как клетки рака поджелудочной железы, мы предлагаем новую технологию 3D-реконструкции изображений серийных срезов с использованием ультрамикротома и полевого эмиссионного сканирующего электронного микроскопа (FE-SEM) для анализа ультраструктуры митохондрий на уровне крист; С помощью этой технологии можно получать данные с высоким разрешением, используя эффективный и доступный метод. Серийные ультратонкие срезы, изготовленные с помощью ультрамикротома, могут храниться в сетчатом футляре и многократно повторяться, даже по прошествии^{нескольких лет.} FE-SEM высоко ценится как инструмент в различных областях исследований благодаря своей способности обеспечивать получение изображений с высоким разрешением, большим увеличением и универсальностью⁴². В попытке отобразить тонкую структуру органелл в 3D, метод получения последовательных стеков 2D-изображений с полезным разрешением с использованием обратно рассеянных электронов, полученных с помощью FE-SEM 43,44^, также может быть использован для достижения высокопроизводительной и многомасштабной визуализации целевых областей или связанных с ними структур без специального оборудования⁴⁵. Генерация артефактов заряда напрямую влияет на качество получаемых изображений, поэтому особенно важно сократить время выдержки.

Таким образом, настоящее исследование развивает экспериментальные процедуры, используемые в этом методе SEM для реконструкции 3D-структуры митохондриальных крист⁴⁶. В частности, мы показываем процесс, разработанный для достижения полуавтоматической сегментации митохондриальных областей и оцифровки 3D-реконструкции с помощью программного обеспечения Amira, который также включает в себя изготовление образцов срезов с использованием традиционного метода подготовки образцов OTO^44,47, завершение сбора срезов с помощью ультрамикротомной резки и получение последовательных 2D-данных с помощью FE-SEM.

Protocol

1. Подготовка материала Культивируют 2 x 106 клеток Panc02 в 12 мл среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина) и выдерживают при 37 °C и влажности 95% в атмосфере 5% углекислого газа и 95% воздуха в течение 48 ч. Соберите клетки Panc02, центрифугир?…

Representative Results

При культивировании клеток (рис. 1А) мы сначала разделили клетки рака поджелудочной железы на контрольную группу, культивируемую с использованием полной питательной среды, группу (1S,3R)-RSL348 (RSL3, активатор ферроптоза, 100 нМ) и группу RSL3 (100 нМ) плюс ферростатин-1<sup…

Discussion

Представленный здесь метод представляет собой полезное пошаговое руководство по применению техники 3D-реконструкции, которая включает в себя применение технологии электронной микроскопии и обработки изображений для укладки и сегментации 2D-томографических изображений, полученных из…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2