Una técnica tridimensional para la visualización de cambios ultraestructurales mitocondriales en células de cáncer de páncreas

Summary

Este protocolo describe cómo reconstruir las crestas mitocondriales para lograr imágenes 3D con alta precisión, alta resolución y alto rendimiento.

Abstract

Comprender las características dinámicas de la ultraestructura del orgánulo celular, que no solo es rica en información desconocida sino también sofisticada desde una perspectiva tridimensional (3D), es fundamental para los estudios mecanicistas. La microscopía electrónica (EM) ofrece una buena profundidad de imagen y permite la reconstrucción de pilas de imágenes de alta resolución para investigar la morfología ultraestructural de los orgánulos celulares incluso a escala nanométrica; por lo tanto, la reconstrucción 3D está ganando importancia debido a sus ventajas incomparables. La microscopía electrónica de barrido (SEM) proporciona una tecnología de adquisición de imágenes de alto rendimiento que permite reconstruir grandes estructuras en 3D a partir de la misma región de interés en cortes consecutivos. Por lo tanto, la aplicación de SEM en la reconstrucción 3D a gran escala para restaurar la verdadera ultraestructura 3D de los orgánulos es cada vez más común. En este protocolo, sugerimos una combinación de técnicas seriadas de corte ultrafino y reconstrucción 3D para estudiar las crestas mitocondriales en células de cáncer de páncreas. Los detalles de cómo se realizan estas técnicas se describen en este protocolo paso a paso, incluido el método de osmio-tiocarbohidrazida-osmio (OTO), la obtención de imágenes de sección ultrafina en serie y la visualización de la pantalla.

Introduction

Las mitocondrias son uno de los orgánulos más importantes de la célula. Sirven como eje central de la bioenergética celular y el metabolismo ^1,2 y desempeñan un papel fundamental en el cáncer³. El cáncer de páncreas (CP) es uno^{de los} cánceres más difíciles de tratar debido a su rápida propagación y alta tasa de mortalidad. La disfunción mitocondrial, que es causada principalmente por cambios en la morfología mitocondrial 3,5,6,7^, se ha relacionado con los mecanismos de enfermedad subyacentes al PC⁸. Las mitocondrias también son altamente dinámicas, lo que se refleja en los cambios frecuentes y dinámicos en su conectividad de red y estructura de crestas⁹. La remodelación de la estructura de las crestas puede afectar directamente la función mitocondrial y el estado celular ^10,11, que se alteran significativamente durante el crecimiento de las células tumorales, la metástasis y los cambios en el microambiente^{tumoral 12,13}.

En los últimos años, los científicos han estudiado este orgánulo mediante la observación EM^14,15,16,17; por ejemplo, los investigadores han analizado la dinámica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrucción 3D 6,7,18,19. El concepto general y el método para la reconstrucción 3D de imágenes de microscopía electrónica se establecieron formalmente ya en 1968²⁰ e implicaron la combinación de microscopía electrónica, difracción de electrones y procesamiento de imágenes por computadora para reconstruir la cola del fago T4. Hasta ahora, la tecnología de imágenes 3D de microscopía electrónica ha logrado avances significativos en términos de resolución de imagen 21, grado de automatización²² y volumen de procesamiento 23 y se ha utilizado a una escala cada vez más amplia en la investigación biológica, desde el nivel de tejido hasta el nivel de ultraestructura de orgánulos a escala nanométrica²⁴. En los últimos años, la microscopía electrónica en 3D también se ha convertido en una tecnología prometedora para una amplia gama de aplicaciones^25,26,27.

La creciente atención a las crestas mitocondriales ilustra particularmente los requisitos esenciales para la obtención de imágenes de volumen ultraestructural. La microscopía electrónica de transmisión (TEM) se ha utilizado para visualizar muestras recogidas en una rejilla de cobre (malla 400)²⁸, con el haz de electrones pasando a través de la sección. Sin embargo, debido al alcance limitado de la rejilla de cobre, es imposible obtener imágenes completas de cortes continuos de la misma muestra²⁹. Esto complica el estudio de las estructuras diana durante la obtención de imágenes TEM. Además, la TEM se basa en tareas manuales que consumen mucho tiempo y son propensas a errores, como cortar y recoger múltiples cortes y obtener imágenes de ellas secuencialmente²¹, por lo que no está adaptado para reconstrucciones ultraestructurales de muestras de gran volumen²³. En la actualidad, la reconstrucción de alta resolución de imágenes de muestras de gran volumen se logra mediante el uso de equipos especializados, como el conjunto de cámaras TEM (TEMCA)³⁰ o dos sistemas TEMCA de segunda generación (TEMCA2)³¹, que permiten obtener imágenes automatizadas de alto rendimiento en poco tiempo. Sin embargo, este tipo de imágenes no tiene la ventaja de ser fácil de obtener y universal debido a la necesidad de equipos personalizados.

En comparación con TEM, el método para generar automáticamente miles de imágenes volumétricas en serie para grandes áreas basado en SEM ^32,33 mejora la eficiencia y la fiabilidad de las imágenes en serie y ofrece resoluciones z más altas³⁴. Por ejemplo, la microscopía electrónica de barrido de cara de bloque en serie (SBF-SEM) y la microscopía electrónica de barrido por haz de iones focalizado (FIB-SEM) han hecho posible lograr la reconstrucción 3D de la ultraestructura con alta velocidad, eficiencia y resolución^35,36. Sin embargo, es inevitable que la superficie del bloque se corte mecánicamente con la cuchilla de diamante del SBF-SEM o con el fresado con el haz de iones enfocado del FIB-SEM^33,37. Debido a la destructividad de los dos métodos para las muestras, no es posible reconstruir la misma estructura objetivo para su posterior análisis^38,39,40. Además, pocos estudios han intentado reconstruir la ultraestructura de orgánulos 3D de las células cancerosas utilizando EM para observar cambios patológicos¹². Por estas razones, con el fin de dilucidar aún más los mecanismos patológicos de las células cancerosas, como las células de cáncer de páncreas, proponemos una tecnología novedosa para la reconstrucción 3D de imágenes de sección seriada utilizando un ultramicrótomo y un microscopio electrónico de barrido por emisión de campo (FE-SEM) para analizar la ultraestructura mitocondrial a nivel de crestas; Con esta tecnología, se pueden adquirir datos de alta resolución utilizando un método eficiente y accesible. Las secciones ultrafinas en serie realizadas con un ultramicrótomo pueden almacenarse de forma semipermanente en una caja de rejilla y volver a crear imágenes varias veces, incluso después de varios años⁴¹. FE-SEM es muy valorada como herramienta en diversos campos de investigación debido a su capacidad para proporcionar imágenes de alta resolución, gran aumento y versatilidad⁴². En un intento de mostrar la estructura fina de los orgánulos en 3D, la técnica para producir pilas de imágenes 2D en serie con una resolución útil utilizando electrones retrodispersados producidos por FE-SEM ^43,44 también se puede utilizar para lograr imágenes de alto rendimiento y multiescala de las regiones objetivo o sus estructuras asociadas sin equipo especial ⁴⁵. La generación de artefactos de carga afecta directamente a la calidad de las imágenes adquiridas, por lo que es especialmente importante que el tiempo de permanencia sea corto.

Por lo tanto, el presente estudio profundiza en los procedimientos experimentales empleados en esta técnica SEM para reconstruir la estructura 3D de las crestas mitocondriales⁴⁶. En concreto, mostramos el proceso desarrollado para conseguir la segmentación semiautomática de las regiones mitocondriales y digitalizar la reconstrucción 3D mediante el software Amira, que también implica la realización de muestras de corte mediante el método convencional de preparación de muestras OTO^44,47, la finalización de la recogida de cortes mediante corte ultramicroscópico y la adquisición de datos secuenciales 2D mediante FE-SEM.

Protocol

1. Preparación del material Cultivar 2 x 106 células Panc02 en 12 mL de medio DMEM (10% de suero fetal bovino y 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), y mantener a 37 °C y 95% de humedad en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono y 95% de aire durante 48 h. Recoja las células de Panc02, centrifugue a 28 x g durante 2 minutos y luego deseche el sobrenadante. Asegúrese de que la muestra tenga un tamaño adecuado (1 x 107 células), ya que de lo c…

Representative Results

Durante el cultivo celular (Figura 1A), primero dividimos las células de cáncer de páncreas en un grupo control cultivado con medio de cultivo completo, un grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, un activador de la ferroptosis, 100 nM) y un grupo RSL3 (100 nM) más ferrostatina-149 (Fer-1, un inhibidor de la ferroptosis, 100 nM). A través de los pasos experimentales anteriores, el microscopio electrónico de barrido adquirió 38 (Figura suplementaria 1…

Discussion

El método que aquí se presenta es una guía útil paso a paso para aplicar la técnica de reconstrucción 3D, que implica la aplicación de microscopía electrónica y tecnología de procesamiento de imágenes al apilamiento y segmentación de imágenes tomográficas 2D generadas a partir de secciones ultrafinas en serie. Este protocolo pone de relieve una limitación de las imágenes 2D que puede abordarse mediante la visualización en 3D de la ultraestructura del orgánulo, que tiene las ventajas de una fuerte reprod…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2