Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas

Summary

Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.

Abstract

A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.

Introduction

As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular ^1,2 e desempenham um papel crítico no câncer³. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar⁴ devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações na^morfologia mitocondrial3,5,6,7^, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos ^CP8. As mitocôndrias também são altamente dinâmicas, o que se reflete nas mudanças frequentes e dinâmicas na conectividade de sua rede e estrutura de^cristas9. A remodelagem da estrutura das cristas pode afetar diretamente a função mitocondrial e o estado^celular10,11, que são significativamente alterados durante o crescimento das células tumorais, metástases e alterações no microambiente tumoral12,13.

Nos últimos anos, cientistas têm estudado essa organela utilizando a observação de EM14,15,16,17; por exemplo, pesquisadores analisaram a dinâmica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrução 3D 6,7,18,19. O conceito geral e o método para a reconstrução 3D de imagens de microscopia eletrônica foram formalmente estabelecidos já em 1968²⁰ e envolveram a combinação de microscopia eletrônica, difração de elétrons e processamento de imagens por computador para reconstruir a cauda do fago T4. Até o momento, a tecnologia de imagem 3D por microscopia eletrônica tem feito avanços significativos em termos de resolução de imagem²¹, grau de automação²² e volume de processamento²³ e tem sido usada em escala cada vez mais ampla em pesquisas biológicas, desde o nível tecidual até o nível de ultraestrutura da organela na escala nanométrica²⁴. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica 3D também se tornou uma tecnologia promissora para uma ampla gama de aplicações25,26,27.

A crescente atenção às cristas mitocondriais ilustra particularmente os requisitos essenciais para a imagem volumétrica ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem sido utilizada para visualizar amostras coletadas em uma grade de cobre (400 mesh)²⁸, com o feixe de elétrons passando pela seção. No entanto, devido ao alcance limitado da grade de cobre, é impossível obter imagens completas de cortes contínuos de uma mesma amostra²⁹. Isso dificulta o estudo das estruturas-alvo durante a aquisição de imagens por TEM. Além disso, a ETM depende de tarefas manuais demoradas e propensas a erros, incluindo corte e coleta de múltiplos cortes e obtenção de imagens sequencialmente²¹, não sendo adaptada para reconstruções ultraestruturais de amostras de grande volume²³. Atualmente, a reconstrução de alta resolução de imagens de amostras de grande volume é obtida por meio do uso de equipamentos especializados, como o TEMCA camera array (TEMCA)³⁰ ou dois sistemas TEMCA de segunda geração (TEMCA2)³¹, que permitem imagens automatizadas de alto rendimento em um curto espaço de tempo. Entretanto, este tipo de imagem não tem a vantagem de ser de fácil obtenção e universal devido à necessidade de equipamentos personalizados.

Em comparação com o TEM, o método de geração automática de milhares de imagens volumétricas seriais para grandes áreas baseado no SEM ^32,33 aumenta a eficiência e a confiabilidade das imagens seriais e oferece resoluções z mais altas³⁴. Por exemplo, a microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) e a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) possibilitaram a reconstrução 3D de ultraestrutura com alta velocidade, eficiência e resolução^35,36. Entretanto, é inevitável que a superfície do bloco seja raspada mecanicamente pelo bisturi de diamante do MEV-SBF ou pela fresagem com o feixe de íons focalizado do FIB-MEV^33,37. Devido à destrutividade dos dois métodos para as amostras, não é possível reconstruir novamente a mesma estrutura alvo para análises^{posteriores 38,39,40}. Além disso, poucos estudos tentaram reconstruir a ultraestrutura da organela 3D de células cancerosas usando EM para observar alterações^{patológicas12}. Por estas razões, a fim de elucidar melhor os mecanismos patológicos de células cancerosas, como células cancerosas pancreáticas, propomos uma nova tecnologia para a reconstrução 3D de imagens de cortes seriados usando um ultramicrótomo e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FE) para analisar a ultraestrutura mitocondrial em nível de cristas; Com essa tecnologia, dados de alta resolução podem ser adquiridos por meio de um método eficiente e acessível. As seções ultrafinas seriais feitas usando um ultramicrótomo podem ser armazenadas semi-permanentemente em uma caixa de grade e recriadas várias vezes, mesmo após vários anos⁴¹. A MEF-FE é altamente valorizada como ferramenta em vários campos de pesquisa devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução, alta magnificação e versatilidade⁴². Na tentativa de exibir a estrutura fina das organelas em 3D, a técnica para produzir pilhas de imagens 2D seriadas com resolução útil usando elétrons retroespalhados produzidos por FE-SEM ^43,44 também pode ser usada para obter imagens de alto rendimento e multiescala de regiões alvo ou suas estruturas associadas sem equipamentos especiais ⁴⁵. A geração de artefatos de carga afeta diretamente a qualidade das imagens adquiridas, por isso é particularmente importante manter o tempo de permanência curto.

Assim, o presente estudo elabora os procedimentos experimentais empregados nesta técnica de MEV para reconstruir a estrutura 3D das cristas mitocondriais46. Especificamente, mostramos o processo desenvolvido para alcançar a segmentação semiautomática das regiões mitocondriais e digitalizar a reconstrução 3D usando o software Amira, que também envolve a confecção de amostras de corte usando o método convencional de preparação de espécimes OTO^44,47, completar a coleta de cortes usando fatiamento de ultramicrótomos e adquirir dados sequenciais 2D por MEV-FE.

Protocol

1. Preparação do material Cultivar 2 x 106 células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h. Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 107 células), caso contrário, as segui…

Representative Results

Durante a cultura celular (Figura 1A), primeiramente dividimos as células de câncer de pâncreas em um grupo controle cultivado com meio de cultura completo, um grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, um ativador de ferroptose, 100 nM) e um grupo RSL3 (100 nM) mais ferrostatina-149 (Fer-1, um inibidor de ferroptose, 100 nM). Através das etapas experimentais acima, o microscópio eletrônico de varredura adquiriu 38 (Figura Suplementar 1), 43 (Fi…

Discussion

O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de al…

Materials

(1S,3R)-RSL3	MCE	HY-100218A
Acetone	SIGMA	179124
Amira	Visage Imaging
Aspartic acid	MCE	HY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s medium	Gibco	11995115
Ethanol	Merck	100983
Ferrostatin-1	MCE	HY-100579
Fetal bovine serum	Gibco	10437010
Field emission scanning electron microscope	HITACHI	SU8010
Glutaraldehyde	Alfa Aesar	A10500.22
Lead nitrate	SANTA CRUZ	sc-211724
Osmium Tetroxide	SANTA CRUZ	sc-206008B
Panc02	European Collection of Authenticated Cell Cultures	98102213
Penicillin-streptomycin	Biosharp	BL505A
Phosphate Buffered Saline	Biosharp	BL302A
Pon 812 Epoxy resin	SPI CHEM	GS02660
Potassium ferrocyanide	Macklin	P816416
Thiocarbohydrazide	Merck	223220
Ultramicrotome	LEICA	EMUC7
Uranyl Acetate	RHAWN	R032929	2020.2