Detta protokoll beskriver hur man rekonstruerar mitokondriella cristae för att uppnå 3D-avbildning med hög noggrannhet, hög upplösning och hög genomströmning.
Att förstå de dynamiska egenskaperna hos cellorganellens ultrastruktur, som inte bara är rik på okänd information utan också sofistikerad ur ett tredimensionellt (3D) perspektiv, är avgörande för mekanistiska studier. Elektronmikroskopi (EM) erbjuder bra bilddjup och möjliggör rekonstruktion av högupplösta bildstaplar för att undersöka den ultrastrukturella morfologin hos cellulära organeller även på nanometerskala; därför blir 3D-rekonstruktion allt viktigare på grund av dess ojämförliga fördelar. Svepelektronmikroskopi (SEM) ger en bildinsamlingsteknik med hög genomströmning som gör det möjligt att rekonstruera stora strukturer i 3D från samma intresseområde i på varandra följande skivor. Därför blir tillämpningen av SEM i storskalig 3D-rekonstruktion för att återställa den sanna 3D-ultrastrukturen hos organeller allt vanligare. I detta protokoll föreslår vi en kombination av seriell ultratunn sektion och 3D-rekonstruktionstekniker för att studera mitokondriella cristae i bukspottskörtelcancerceller. Detaljerna om hur dessa tekniker utförs beskrivs i detta protokoll steg för steg, inklusive osmium-tiokarbohydrazid-osmiummetoden (OTO), den seriella ultratunna sektionsavbildningen och visualiseringsdisplayen.
Mitokondrier är en av de viktigaste organellerna i cellen. De fungerar som det centrala navet för cellulär bioenergetik och metabolism 1,2 och spelar en avgörande roll i cancer3. Bukspottkörtelcancer (PC) är en av de svåraste cancerformerna4 att behandla på grund av dess snabba spridning och höga dödlighet. Mitokondriell dysfunktion, som främst orsakas av förändringar i mitokondriell morfologi 3,5,6,7, har kopplats till de sjukdomsmekanismer som ligger till grund för PC8. Mitokondrier är också mycket dynamiska, vilket återspeglas av de frekventa och dynamiska förändringarna i deras nätverksanslutning och cristae-struktur9. Omformningen av cristae-strukturen kan direkt påverka mitokondriell funktion och cellulärt tillstånd10,11, som förändras signifikant under tumörcelltillväxt, metastaser och tumörmikromiljöförändringar12,13.
Under de senaste åren har forskare studerat denna organell med EM-observation14,15,16,17; Till exempel har forskare analyserat mitokondriell dynamik med hjälp av 3D-rekonstruktionstekniker 6,7,18,19. Det allmänna konceptet och metoden för 3D-rekonstruktion av elektronmikroskopibilder etablerades formellt redan 196820 och involverade att kombinera elektronmikroskopi, elektrondiffraktion och datorbildbehandling för att rekonstruera T4-fagsvansen. Hittills har elektronmikroskopi 3D-avbildningsteknik gjort betydande framsteg när det gäller bildupplösning 21, automatiseringsgrad 22 och bearbetningsvolym23 och har använts i allt bredare skala inom biologisk forskning, från vävnadsnivå till organellultrastrukturnivå på nanometerskala24. Under de senaste åren har elektronmikroskopi 3D-avbildning också blivit en lovande teknik för ett brett spektrum av applikationer25,26,27.
Den växande uppmärksamheten på mitokondriella kristor illustrerar särskilt de väsentliga kraven för ultrastrukturell volymavbildning. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) har använts för att visualisera prover som samlats in på ett kopparnät (400 mesh)28, med elektronstrålen som passerar genom sektionen. På grund av kopparnätets begränsade räckvidd är det emellertid omöjligt att helt avbilda kontinuerliga skivor av samma prov29. Detta komplicerar studiet av målstrukturer under TEM-avbildning. Dessutom förlitar sig TEM på tidskrävande och felbenägna manuella uppgifter, inklusive skärning och insamling av flera skivor och avbildning av dem sekventiellt21, så det är inte anpassat för ultrastrukturella rekonstruktioner av stora volymprover23. För närvarande uppnås högupplöst rekonstruktion av provavbildning i stora volymer genom användning av specialutrustning, såsom TEMCA-kameramatrisen (TEMCA)30 eller två andra generationens TEMCA-system (TEMCA2)31, som möjliggör automatiserad avbildning med hög genomströmning på kort tid. Denna typ av avbildning har dock inte fördelen att den är lätt att få och universell på grund av kravet på anpassad utrustning.
Jämfört med TEM förbättrar metoden för att automatiskt generera tusentals seriella volymetriska bilder för stora områden baserat på SEM 32,33 effektiviteten och tillförlitligheten hos seriell avbildning och ger högre z-upplösningar34. Till exempel har seriell block-face scanning elektronmikroskopi (SBF-SEM) och fokuserad jonstråleskanningselektronmikroskopi (FIB-SEM) båda gjort det möjligt att uppnå 3D-rekonstruktion av ultrastruktur med hög hastighet, effektivitet och upplösning35,36. Det är emellertid oundvikligt att blockytan rakas mekaniskt av SBF-SEM:s diamantkniv eller genom fräsning med den fokuserade jonstrålen på FIB-SEM33,37. På grund av de två metodernas destruktivitet för proverna är det inte möjligt att rekonstruera samma målstruktur igen för vidare analys38,39,40. Dessutom har få studier försökt rekonstruera 3D-organellens ultrastruktur av cancerceller med hjälp av EM för att observera patologiska förändringar12. Av dessa skäl, för att ytterligare belysa de patologiska mekanismerna hos cancerceller, såsom bukspottskörtelcancerceller, föreslår vi en ny teknik för 3D-rekonstruktion av seriella sektionsbilder med hjälp av en ultramikrotom och ett fältemissionsskanningselektronmikroskop (FE-SEM) för att analysera mitokondriell ultrastruktur på cristae-nivå; Med denna teknik kan högupplösta data förvärvas med en effektiv och tillgänglig metod. De seriella ultratunna sektionerna gjorda med hjälp av en ultramikrotom kan lagras semi-permanent i ett rutnätfodral och reimaged flera gånger, även efter flera år41. FE-SEM värderas högt som ett verktyg inom olika forskningsområden på grund av dess förmåga att tillhandahålla högupplöst bildbehandling, hög förstoring och mångsidighet42. I ett försök att visa organellernas fina struktur i 3D kan tekniken för att producera seriella 2D-bildstaplar med användbar upplösning med hjälp av bakåtspridda elektroner producerade av FE-SEM 43,44 också användas för att uppnå hög genomströmning och flerskalig avbildning av målregioner eller deras associerade strukturer utan specialutrustning 45. Genereringen av laddningsartefakter påverkar direkt kvaliteten på de förvärvade bilderna, så det är särskilt viktigt att hålla uppehållstiden kort.
Således utarbetar föreliggande studie de experimentella procedurerna som används i denna SEM-teknik för att rekonstruera 3D-strukturen hos mitokondriella cristae46. Specifikt visar vi processen som utvecklats för att uppnå den halvautomatiska segmenteringen av mitokondriella regioner och digitalisera 3D-rekonstruktionen med hjälp av Amira-programvaran, vilket också innebär att man gör skivprover med den konventionella OTO-provberedningsmetoden44,47, slutför sektionssamlingen med ultramikrotomskivning och förvärvar sekventiell 2D-data med FE-SEM.
Metoden som presenteras här är en användbar steg-för-steg-guide för att tillämpa 3D-rekonstruktionstekniken, vilket innebär att elektronmikroskopi och bildbehandlingsteknik tillämpas på stapling och segmentering av 2D-tomografiska bilder genererade från seriella ultratunna sektioner. Detta protokoll belyser en begränsning av 2D-bilder som kan hanteras genom 3D-visualisering av organellens ultrastruktur, vilket har fördelarna med stark reproducerbarhet av strukturerna vid en hög upplösningsnivå och högre n…
The authors have nothing to disclose.
Denna forskning stöddes av Natural Science Foundation of Zhejiang Province bidrag (Z23H290001, LY19H280001); National Natural Science Foundation of China beviljar (82274364, 81673607 och 81774011); samt det offentliga välfärdsforskningsprojektet för Huzhou Science and Technology Grant (2021GY49, 2018GZ24). Vi uppskattar den stora hjälpen, teknisk support och experimentellt stöd från Public Platform of Medical Research Center, Academy of Chinese Medical Science, Zhejiang Chinese Medical University.
(1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
Acetone | SIGMA | 179124 | |
Amira | Visage Imaging | ||
Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
Ethanol | Merck | 100983 | |
Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 | 2020.2 |