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CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E CENP-E-/-ノックアウト細胞株の作製

Published: June 23, 2023 doi: 10.3791/65476
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 1,2
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3College of Clinical Medicine for Obstetrics & Gynecology and Pediatrics, Fujian Medical University, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital

Summary

本稿では、CRISPR/Cas9システムと3つの表現型ベースのスクリーニング戦略を用いたセントロメア関連プロテインE(CENP-E)ノックアウト細胞の構築について報告します。私たちは、 CENP-Eノックアウト細胞株を利用して、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための新しいアプローチを確立し、医薬品開発や生物学研究に有用です。

Abstract

CRISPR(clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9システムは、さまざまな生物において正確かつ効率的な遺伝子編集のための強力なツールとして登場しました。セントロメア関連プロテインE(CENP-E)は、動原体微小管の捕捉、染色体アライメント、および紡錘体アセンブリチェックポイントに必要なプラス末端指向性キネシンです。CENP-Eタンパク質の細胞機能は十分に研究されていますが、CENP-Eアブレーションは通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期の停止、および細胞死につながるため、従来のプロトコルを使用してCENP-Eタンパク質の直接的な機能を研究することは困難でした。本研究では、ヒトHeLa細胞の CENP-E 遺伝子を完全にノックアウトし、CRISPR/Cas9システムを用いて CENP-E-/- HeLa細胞を作製することに成功しました。

細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、CENP-Eタンパク質の蛍光強度など、3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略が確立され、 CENP-E ノックアウト細胞のスクリーニング効率と実験成功率を効果的に向上させました。重要なことに、 CENP-Eの 欠失は、染色体のミスアライメント、BUB1有糸分裂チェックポイントセリン/スレオニンキナーゼB(BubR1)タンパク質の異常な位置、および有糸分裂欠損をもたらします。さらに、 CENP-E ノックアウトHeLa細胞モデルを用いて、CENP-E特異的阻害剤の同定法を開発しました。

この研究では、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための有用なアプローチが確立されました。さらに、この論文では、細胞分裂におけるCENP-Eのメカニズムを調査するための強力なツールとなる可能性のあるCRISPR/Cas9システムを使用した CENP-E 遺伝子編集のプロトコルを提示します。さらに、 CENP-Eノックアウト細胞株は、抗腫瘍薬の開発、細胞生物学における細胞分裂メカニズムの研究、および臨床応用に重要な意味を持つCENP-E阻害剤の発見と検証に貢献します。

Introduction

遺伝子操作によるゲノム編集は、さまざまな細胞や生物の遺伝子の標的修飾を媒介します。真核生物では、標的DNAの相同組換えを刺激する配列特異的ヌクレアーゼの応用により、部位特異的な突然変異誘発を導入することができます1。近年、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)2,3、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)4,5、ホーミングメガヌクレアーゼ6,7など、いくつかのゲノム編集技術が特定の部位でゲノムを切断するように設計されていますが、これらのアプローチには複雑なタンパク質工学と冗長な実験手順が必要です。研究によると、II型原核生物クラスター化規則的インタースペース短回文反復(CRISPR)/Casシステムは、さまざまな細胞および種8,9,10,11においてRNA誘導部位特異的DNA切断を特異的に媒介する効率的な遺伝子編集技術であることが示されています8,9,10,11。CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト技術は、基礎生物学、バイオテクノロジー、医学の分野に革命をもたらしました12。

バクテリアとほとんどの古細菌は、CRISPRとCasタンパク質を使用してウイルスとプラスミドを識別して破壊するRNAベースの適応免疫システムを進化させました13。化膿連鎖球菌Cas9(SpCas9)エンドヌクレアーゼには、RuvC様Holliday junction resolvase(RuvC)およびHis-Asn-His(HNH)ドメインが含まれており、CRISPR RNA(crRNA)とトランス活性化crRNA(tracrRNA)を含む合成シングルガイドRNA(sgRNA)を提供することにより、配列特異的な二本鎖切断(DSB)を効率的に媒介することができます14,15,16。.DSBは、哺乳類細胞に挿入、欠失、または瘢痕のない一塩基置換を含む複数の変異を導入するインデル形成非相同末端結合(NHEJ)または相同性指向性修復(HDR)経路を介して修復することができます1,8。エラーが発生しやすいNHEJ経路と忠実度の高いHDR経路の両方を使用して、挿入または欠失を介して遺伝子ノックアウトを媒介することができ、フレームシフト変異および早期停止コドンを引き起こす可能性がある10。

キネシン-7 CENP-Eは、細胞分裂中の動原体-微小管の付着と染色体アライメントに必要です17,18,19。CENP-Eの抗体マイクロインジェクション20,21、siRNA枯渇22,23、化学的阻害24,25,26、および遺伝子欠失27,28,29は、染色体のミスアライメント、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、および有糸分裂欠損を引き起こし、異数性および染色体不安定性をもたらす19,30.マウスでは、CENP-Eの欠失により、発生のごく初期段階で異常な発育と胚致死が生じます27,29,31。CENP-Eの遺伝子欠失は、通常、染色体のミスアライメントと細胞死26,27,29を引き起こし、CENP-Eタンパク質の機能とメカニズムを研究する上で障害となる。

最近の研究では、オーキシン誘導性CRISPR/Cas9遺伝子編集法32を用いて、比較的短時間でCENP-Eタンパク質の迅速な分解を可能にする条件付きCENP-Eノックアウト細胞株が確立されました33。しかし、今日まで、安定したCENP-Eノックアウト細胞株は確立されておらず、これはCENP-E生物学における未解決の技術的課題です。遺伝的頑健性34、遺伝的代償応答35、36、37、および複雑な細胞内環境を考慮すると、CENP-Eの完全な欠失の直接的な結果は複雑で予測不可能である可能性があるため、染色体アライメント、紡錘体アセンブリチェックポイント、および下流シグナル伝達経路のメカニズムを調査するためにCENP-Eノックアウト細胞株を確立することが重要です。

CENP-E阻害剤の発見と応用は、がん治療にとって重要です。現在までに、GSK923295とその誘導体24,25、PF-277138,39、イミダゾ[1,2-a]ピリジン足場誘導体40,41、化合物-A42,43、シンテリン44,45、UA6278446、ベンゾ[d]ピロロ[2,1-b]チアゾール誘導体47を含む7種類のCENP-E阻害剤が発見され、合成されている.これらの阻害剤の中で、GSK923295は、CENP−Eの運動ドメインに結合し、3.2±0.2nMのKiを有するCENP−E微小管刺激ATPアーゼ活性を阻害するアロステリックで効率的なCENP−E阻害剤である24,25。しかし、培養がん細胞に対するGSK923295の阻害効果と比較すると、臨床がん患者におけるGSK923295の治療効果は理想的ではなく48,49、CENP-EのGSK923295の特異性についても懸念が生じました。さらに、CENP-Eタンパク質に対する他のCENP-E阻害剤の特異性と副作用は、がん研究における重要な問題です。

本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いてHeLa細胞の CENP-E 遺伝子を完全にノックアウトしました。CENP-E遺伝子編集のスクリーニング効率と成功率を向上させるために、細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、CENP-Eタンパク質の蛍光強度など、3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略が確立されています。さらに、 CENP-E ノックアウト細胞株を使用して、CENP-Eの候補化合物の特異性を試験することができます。

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Protocol

1. CRISPR/Cas9遺伝子ノックアウトベクターの構築

  1. ヒト CENP-E 遺伝子上の標的ゲノムDNA配列を選択します(GenBank Accession No.NM_001286734.2)を作成し、オンラインCRISPRデザインツール(http://crispor.tefor.net/)を使用してsgRNAを設計します。
  2. ゲノム配列を1つ入力し、"Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148"のゲノムを選択し、プロトスペーサー隣接モチーフ"20 bp-NGG-spCas9"を選択します。特異度スコア50、予測効率10、および最小のオフターゲットに従って、sgRNA-1、5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' および sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGCTC-3' の 2 つのガイド配列を選択します。
  3. 一本鎖DNAオリゴヌクレオチド(ssODN)を注文して合成します。ddH2O中のssODNを最終濃度100μMに希釈します。sgRNAオリゴをリン酸化してアニーリングするには、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブにフォワードオリゴ1μL、リバースオリゴ1μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼ0.5μL、T4ポリヌクレオチドキナーゼバッファー1μL、RNaseフリー水6.5μLを加え、チューブを37°Cで30分間、95°Cで5分間インキュベートします。その後、5°C min-1で25°Cまで下げます。
  4. BbsEquation 1 制限酵素を用いてpX458プラスミドを消化します。pX458プラスミド1 μg、10倍バッファーG2 μL、Bbs1Equation 1 μLを添加し、RNaseフリーddH2Oを1.5 mL遠心チューブに20 μL添加します。チューブを37°Cで2時間インキュベートします。次に、カラムDNAゲル抽出キットを使用して、メーカーのプロトコルに従って直鎖状プラスミドを精製します。
  5. sgRNAオリゴをpX458プラスミド(pSpCas9(BB)-2A-緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミド、Addgene ID. 48138)にライゲーションします。アニーリングしたオリゴヌクレオチド 1 μL、直鎖プラスミド 25 ng、10 x T4 DNA ライゲーションバッファー 1 μL、T4 DNA リガーゼ 0.5 μL(350 U/μL)を加え、1.5 mL の遠心チューブに ddH2O で最大 10 μL を作ります。ライゲーション溶液を16°Cで2時間インキュベートします。
  6. 構築したプラスミド10 μLをコンピテントDH5α細胞とともに氷上で30分間インキュベートし、42°Cで45秒間ヒートショックし、すぐに氷上に5分間置きます。500 μLのLuria-Bertani(LB)培地を添加し、アンピシリン(100 μg/mL)を含むLBプレートに細胞を播種します。37°Cで16時間インキュベートし、耐性クローンをスクリーニングします。
  7. 滅菌したピペットチップで5〜10個の単一コロニーを選択し、アンピシリン(100 μg/mL)を含むLB培地の1 mL培養物に移します。培養液を37°Cでインキュベートし、180rpmで12〜16時間振とうします。
  8. プラスミド抽出キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってプラスミドDNAを単離します。U6-Fwd プライマー 5'-GAGGGCCTATTTCCCATGATTCC-3' を使用して、U6 プロモーター部位からのサンガーシーケンシングにより、各コロニーのプラスミド DNA を検証します。
  9. エンドフリープラスミドDNAキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってプラスミドを抽出および精製します。

2. CENP-E ノックアウトHeLa細胞のトランスフェクション、単離、スクリーニング

  1. 10%ウシ胎児血清と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加したDulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM)でHeLa細胞を、加湿インキュベーターで37°C、5%CO2で培養します。
  2. 0.25%トリプシン/エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を使用して37°Cで2〜3分間HeLa細胞をインキュベートし、ピペッティングで穏やかに細胞を解離した後、細胞継代用に希釈比1:4で新しいプレートに細胞を播種します。
  3. トランスフェクション前に細胞を12ウェルプレートに播種し、60〜70%のコンフルエントになるまで培養します。pX458-sgRNAプラスミドを、メーカーのプロトコルに従って参照試薬を使用してHeLa細胞にトランスフェクションします( 材料表を参照)。
    1. 1 μgのバリデーション済みpX458-sgRNAプラスミドと50 μLの還元血清培地をチューブAで穏やかに混合します。次に、チューブBにトランスフェクション試薬2μLと還元血清培地50μLを静かに混合し、チューブAとBを別々に室温で5分間インキュベートします。
    2. チューブAとチューブBの両方を穏やかに混合し、室温で5分間インキュベートします。混合物を12ウェルプレートに加え、細胞を6時間インキュベートし、培地を新しいDMEM培地と交換します。
  4. 24時間後または48時間後に蛍光顕微鏡を使用してHeLa細胞を検査し、トランスフェクション効率を確認します。48時間トランスフェクションした後、0.25%トリプシン/EDTAを用いて37°Cで3〜5分間トランスフェクションしたHeLa細胞を完全に解離し、ノイバウアーチャンバーまたは自動セルカウンターを使用して細胞数をカウントし、段階希釈法10に従って、トランスフェクションした集団ごとに細胞を3つの別々の96ウェルプレートに播種します。
  5. 細胞を加湿したインキュベーターに戻し、さらに1〜2週間培養します。培地は3日に1回交換してください。 CENP-E ノックアウトの表現型ベースのスクリーニングおよびバリデーションでは、24ウェルまたは12ウェルプレートで細胞を5〜7日間解離および増殖させます。
  6. 10倍および20倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して、細胞コロニーの直径が小さい変異細胞をスクリーニングします。
    注: CENP-E 変異は、通常、細胞コロニー内の分裂細胞の数の有意な増加をもたらし、これは CENP-E 変異細胞をスクリーニングするための重要な指標の1つとなり得る。
  7. カラム動物ゲノムDNA抽出キットを使用して、DNA抽出用の細胞をメーカーのプロトコルに従って回収します。PCR反応を次のようにセットアップします:0.25 μLのTaqポリメラーゼ、5 μLの10xバッファー(Mg2+ plus)、4 μLのdNTP混合物、500 ngのDNAテンプレート、1 μLのフォワードオリゴ、1 μLのリバースオリゴ、ddH2Oを50 μLに調整します。 遺伝子増幅には、以下のPCRプログラム設定を使用します。 98 °C、10秒;98 °C、10 秒、55 °C、30 秒、72 °C、60 秒、33 サイクル。72°C、10分間、その後4°Cで保持します。
    注:標的遺伝子座のクローニングのための特異的プライマーは、以下のようにリストされている: CENP-EターゲットF1 、5'-GAGGGTCCTGGCCATTTTCCTG-3'; CENP-EターゲットR1 、5'-AGATCTCCGATCCTCCCCTGTC-3'; CENP-EターゲットF2 、5'-TGGTAACTGCATTTTGGTGTTCTAC-3'; CENP-EターゲットR2 、5'-CCTGTTGCAACGTGAGGGAAG-3'。
  8. メーカーのプロトコールに従って、ターゲットDNAをpMD18-Tベクターにライゲーションします。ライゲーションしたプラスミドをコンピテントDH5α細胞にトランスフェクションし、クローンを選択するために培養します。
  9. サンガーシーケンシングを実施して、 CENP-E ノックアウトの種類を決定します。プラスミド抽出キットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってプラスミドDNAを単離します。M13フォワードプライマーおよびリバースプライマーを使用して、各コロニーのプラスミドDNAのサンガーシーケンシングを実施します。M13Fプライマー、5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3';M13Rプライマー、5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3'。
  10. 野生型および CENP-E 変異体HeLa細胞を、それぞれ24ウェルプレート内の12 mmガラスカバーガラスに播種します。完全なDMEM培地を除去し、細胞を4%パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水(PBS)固定液中で室温で10分間固定します。
  11. 核を4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)溶液で室温で5分間染色します。Plan Fluor 40x/開口数(NA)0.75対物レンズを装着した蛍光顕微鏡を用いて、染色体アライメントの表現型に基づいて CENP-E 変異細胞をスクリーニングし、検証します。
  12. CENP-Eタンパク質の免疫蛍光染色および分析(セクション3を参照)を用いて、CENP-Eノックアウト細胞をスクリーニングし、検証します。

3. 免疫蛍光染色と高分解能共焦点顕微鏡

  1. 細胞を4%パラホルムアルデヒド/PBS固定液で室温で10分間固定し、1x PBSに2 x 5分間浸漬します。
    注:細胞が健康な状態にあり、中期の細胞剥離を避けるために細胞が収集され、穏やかに固定されていることを確認してください。
  2. 細胞を0.25% Triton X-100/PBSで室温で10分間透過処理し、1x PBSに2 x 5分間浸漬します。
  3. 細胞を1% BSA/PBST(0.1% Tween 20 in PBS)で室温で1時間ブロッキングします。一次抗体を1% BSA/PBSTで希釈し、サンプルを4°Cで12時間インキュベートします。
  4. 一次抗体溶液を廃棄し、1x PBSで細胞を3 x 5分間リンスし、希釈した二次抗体とともに細胞を室温で2時間インキュベートします。
  5. 二次抗体を廃棄し、細胞を1x PBSで3 x 5分間すすぎます。
  6. 核をDAPIで室温で5分間染色します。スライドを封入剤で取り付けます。スライドをマニキュアで密封します。
  7. 63倍/NA 1.40の対物レンズを装備した走査型共焦点顕微鏡を使用して、蛍光画像を観察し、記録します。

4. 染色体調製と核型解析

  1. 10%ウシ胎児血清および1%ペニシリン/ストレプトマイシンを添加した完全DMEM培地で野生型および CENP-E-/- HeLa細胞を24時間培養した後、野生型および CENP-E-/- HeLa細胞を300 nMコルヒチンで5時間インキュベートします。
  2. 細胞を0.25%トリプシン/EDTAと37°Cで3分間インキュベートし、細胞を1.5 mLの遠心チューブに集めます。
  3. 細胞を室温で1,000 × g で5分間遠心分離し、上清を廃棄し、1.2 mLの0.075 mol/L KCl溶液を加え、37°Cで20分間インキュベートします。
  4. 細胞を室温で1,000 × g で5分間遠心分離し、上清を捨て、0.2 mLの固定液(メタノール:氷酢酸=3:1)を加えてプレフィケーションし、1分間穏やかに混合します。
  5. 細胞を室温で1,000×gで5分間遠心分離し、ペレットを回収し、1.5mLの固定液を室温で10分間添加した後、室温で1,000×gで5分間遠心分離します。
  6. 上清を捨て、0.6 mLの固定液を加え、細胞懸濁液を調製します。氷のスライドに35〜40 cmの高さから3〜5滴の細胞懸濁液を追加します。
    注:細胞懸濁液をスライドに放出する高さは35〜40cmに保ちます。そうしないと、染色体が分散しすぎているか、互いに分離していない可能性があります。
  7. スライドを直ちにアルコールランプで乾燥させ、サンプルを10%ギムザ染色溶液で7分間染色し、スライドを流水で2分間すすぎ、Plan Fluor 40x/NA 0.75対物レンズを装着した光学顕微鏡でサンプルを観察します。

5. 細胞コロニー形成アッセイ

  1. 細胞懸濁液を6ウェルプレートで1,000-2,000細胞/ウェルの細胞密度で調製します。プレートを静かに振って、細胞を均等に分散させます。
  2. 6ウェルプレートをCO2 インキュベーターに入れ、37°Cで5%CO2で2〜3週間インキュベートします。培地は5日に1回交換してください。10倍と20倍の対物レンズを備えた倒立顕微鏡を使用して画像を記録します。コロニーが見えたら細胞を採取します(クローン内の数百の細胞)。
  3. GSK923295の影響を調べるには、6ウェルプレートで細胞を24時間培養し、最終濃度10、25、50、100、および200 nMで2 mLのGSK923295を加えます。
    注:新しいクローンを形成し、トランスフェクションされた細胞のスクリーニングに影響を与える可能性のある細胞脱落を避けるために、クローン形成の初期段階で培養皿を動かさないでください。
  4. 培地を廃棄し、細胞を1%PFAで室温で10分間固定します。コロニーを0.1%クリスタルバイオレット染色液で室温で15分間染色します。サンプルを1x PBSで3回すすぎます。細胞コロニーの画像を記録し、ImageJソフトウェアを使用して各コロニーの直径を定量化します。 [直線 ] 選択ツールを選択して [解析] をクリックし、[ 計測] を選択して、長さを記録します。
  5. コロニーを1 mLの10%酢酸溶液で5分間すすぎます。上清溶液200μLを96ウェルプレートに移し、マイクロプレート分光光度計を用いてA600 nmの吸光度値を測定します。

6. 細胞生存率アッセイ

  1. 24ウェルプレートに細胞を播種し、48時間から80〜90%の密度で細胞を培養します。
  2. 細胞を100 μLの0.25%トリプシン/EDTAとともに37°Cで3分間インキュベートします。
  3. 400 μLのPBSをピペットガンで細胞と混合します。100 μL の細胞懸濁液を 96 ウェルプレートに移します。
  4. 最終濃度が 317 μg/mL になるように各ウェルに 20 μL の MTS 溶液を添加し、メーカーのプロトコルに従って穏やかに混合します。サンプルを37°CでCO2 インキュベーターで1〜3時間インキュベートします。
  5. マイクロプレート分光光度計を使用して、A490 nmの吸光度ピークにおける各ウェルの吸光度値を記録します。細胞破片と非特異的吸光度(細胞生存率 =A 490nm-A 630 nm)に寄与するバックグラウンドを差し引くには、A630 nmの参照波長を使用します。

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Representative Results

CENP-E-/- HeLa細胞は、CRISPR/Cas9システムを用いて作製に成功しました(図1)。この分析法のタイムラインと重要な実験ステップを図 1 に示します。まず、CENP-E特異的sgRNAを設計・合成し、sgRNAをアニーリングしてpX458プラスミドにライゲーションし、プラスミドをHeLa細胞にトランスフェクションし、48時間培養しました。トランスフェクションした細胞を解離し、段階希釈を用いて96ウェルプレートに播種しました(図1A)。単一コロニーを選択し、3つの表現型ベースの戦略を用いてスクリーニングした。変異型およびCENP-Eノックアウト細胞は、PCR、サンガーシーケンシング、および免疫蛍光アッセイを用いてバリデーションしました(図1A)。CENP-E遺伝子のエクソン1およびエクソン13は、4番染色体上で標的部位として選択されました(図1B)。CRISPR/Cas9システムは、RuvCおよびHNHエンドヌクレアーゼドメインを使用して、プロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)配列の近位にあるDSBを誘導することができ、NHEJ経路をトリガーし、遺伝子編集(小さな挿入、欠失、置換)を引き起こします(図1C)。これらのエラーが発生しやすい修復メカニズムにより、4つの遺伝子ノックアウトHeLa細胞集団が得られました。pX458-sgRNAのトランスフェクション効率は、免疫蛍光アッセイを用いて検出しました(図1D)。また、コントロール、ターゲット1、ターゲット2のHeLa細胞のゲノムDNAを抽出し(図1E)、標的遺伝子座のDNAを増幅し、それらをpMD18-Tにライゲーションして、DNAシーケンシングと変異タイプの検証を行いました(図1F)。要約すると、約100個のクローンをスクリーニングし、+1 bpの挿入(クローン1およびクローン2の28位)、-7 bpの欠失(クローン3の1102-1108位)、および-1 bpの欠失(クローン4の1102 bp位)を含む、4つの安定なCENP-EノックアウトHeLa細胞の作製に成功しました(CENP-Eコード配列、 GenBankアクセッション番号NM_001286734.2)(図1G、H)。これらの変異はいずれもフレームシフト変異と早期停止をもたらし、その結果、クローン1/2のCENP-E遺伝子とクローン3/4のHeLa細胞の2つのCENP-E変異体が完全に欠失した。

CENP-Eノックアウト実験の効率と実験の成功率を向上させるために、3つの表現型ベースのスクリーニング戦略が開発されました。これらは、位相差顕微鏡を用いた細胞コロニースクリーニング(図2A)、DAPI染色を用いた染色体アライメント(図2B)、および免疫蛍光アッセイを用いたCENP-Eタンパク質の蛍光強度(図2C)に基づいていました。CRISPR/Cas9システムの重要なステップには、ガイドRNAクローニング、pX458-sgRNAの細胞株へのトランスフェクション、48時間のインキュベーション、96ウェルプレートへの細胞希釈、細胞回収、スクリーニング、および3つの表現型ベースの戦略を使用した検証が含まれます(図2D)。対照群およびCENP-E-/- 基の免疫蛍光染色により、CENP-Eタンパク質の蛍光強度がCENP-E-/-クローン1細胞で完全にノックアウトされ、CENP-E変異クローン3細胞で有意に低下したことが示され(図2E)、CENP-EのCRISPR/Cas9を介した遺伝子ノックアウトの有効性がさらに実証されましたHeLa細胞の遺伝子。染色体がずれている中期細胞の割合は、対照群の0.30±0.21%から、Clone 1 HeLa細胞では4.15±0.57%、Clone 3 HeLa細胞では5.85±0.80%に増加しました(図2F)。一方、中期細胞の割合は、対照群の3.49±0.47%から、CENP-E-/-クローン1細胞では5.86±0.57%、CENP-E変異クローン3細胞では6.70±0.77%に増加しました(図2G)。さらに、CENP-E欠失後のクローン1およびクローン3群では、対照群と比較して、間期細胞の割合がわずかに増加しました(図2H)。前期細胞、後期細胞、終期細胞の割合は、CENP-E欠失後にわずかに減少したのに対し、中期細胞の割合はCENP-E欠失後に増加しました(図2I)。CENP-E欠失の表現型をさらに調べるために、紡錘体アセンブリチェックポイントの鍵となるタンパク質であるBubR1の免疫蛍光染色を行ったところ、CENP-Eの非存在下でBubR1の局在が異常であり、BubR1の動原体蓄積が有意に影響を受けることを見出しました(図2J-L)。

CENP-EノックアウトHeLa細胞の細胞増殖および増殖能をよりよく理解するために、クローン1、クローン2、クローン3、およびクローン4細胞を含む4つのCENP-E-/-HeLa細胞についてコロニー形成アッセイおよびクリスタルバイオレット染色を実施しました(図3A、B)。CENP-Eの欠失は、各クローンのクローン形成能力の低下、コロニー径の縮小、および細胞数の減少をもたらし(図3A-D)、CENP-Eがクローン形成および細胞増殖に不可欠であることを示唆している。さらに、3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム、インナーソルト(MTS)法を利用して細胞生存率アッセイを行ったところ、対照群の1.05±0.00と比較して、CENP-E-/-HeLa細胞では細胞生存率値が0.66±0.01、0.79±0.00に低下することがわかりました(図3E).染色体の安定性におけるCENP-Eの役割をさらに調べるために、染色体調製、ギムザ染色、および核型分析を行い、野生型HeLa細胞の67.09±0.50からCENP-E-/-HeLa細胞の染色体数が0.83±0.83±56.08に減少することを発見しました(図3F、G)。これらの結果を総合すると、CENP-Eの欠失が細胞増殖、コロニー形成、および細胞生存率を有意に阻害することを示しており、CENP-Eが細胞の増殖、増殖、および染色体の安定性に不可欠であることを示唆しています。

この研究では、CENP-Eノックアウト細胞株が、CENP-E特異的阻害剤の同定と検証のための貴重なツールとして開発されました。CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための有用なアプローチが確立されています(図4)。GSK92329524,25を例に、野生型HeLa細胞およびCENP-E-/-クローン1HeLa細胞株を一連の濃度のGSK923295で処理し、コロニー形成アッセイおよび免疫蛍光アッセイを用いて、これら2つのHeLa細胞に対するCENP-E阻害剤の効果をさらに調査しました(図4).6ウェルプレートに接種した単一細胞をコロニー形成アッセイに供した。細胞を異なる濃度のGSK923295で処理し、2〜3週間培養した後、さらなる分析のために回収しました(図4A-D)。クリスタルバイオレット染色後、野生型HeLa細胞およびCENP-E-/-細胞のコロニー径をImageJソフトウェアを用いて測定した。野生型HeLa細胞では、GSK923295濃度の上昇処理後にコロニー形成が有意に減少した。また、野生型HeLa細胞ではCENP-E阻害後にコロニー径が小さくなりました(図4B-D)。特に、CENP-Eノックアウトクローン1 HeLa細胞は、異なる濃度のGSK923295存在下でクローン径の有意な減少を示さなかったことから、GSK923295は10 nM〜10 μMの濃度範囲で有意なオフターゲット効果や明らかな毒性副作用のない特異的阻害剤であることを示唆しています。

続いて、野生型HeLa細胞およびCENP-E-/-細胞の染色体アライメント表現型を免疫蛍光アッセイを用いて調べました(図4E)。定量解析により、50 nM、100 nM、400 nM、2 μM、および10 μMのGSK923295処理後に中期細胞の割合が有意に増加することが示されました(図4E、F)。さらに、野生型HeLa細胞における染色体のミスアライメントの有意な増加と比較して、CENP-E-/-クローン1HeLa細胞は、異なる濃度のGSK923295の影響を受けませんでした。まとめると、このCENP-E-/-クローン1細胞株は、特定のタイプのGSK923295耐性細胞株であり、CENP-Eの欠失と適応、遺伝的冗長性34、および潜在的な遺伝的代償効果35,36,37のためにCENP-E阻害剤に反応しない。これらの知見は、CENP-E-/-クローン1 HeLa細胞が、CENP-E阻害剤の特異性、毒性、および副作用を検証するための強力で有用なツールであることを示しています。

Figure 1
図1:CRISPR/Cas9システムを用いたCENP-E-/-HeLa細胞の構築。 (A)CRISPR/Cas9ベクターの構築、トランスフェクション、細胞クローンの形成と選択、および機能検証のプロトコルタイムライン。cenp-E-/-細胞株の構築(sgRNA設計、pX458-sgRNAプラスミドの構築、変異細胞のスクリーニングなど)のタイムライン。(B)直鎖化pX458ベクターへのsgRNAのクローニングの概略モデル。4番染色体のCENP-E遺伝子のエクソン1およびエクソン13を標的部位として選択した。(C)遺伝子編集のためのCRISPR/Cas9システムのメカニズム。DSBに続いて非相同末端結合が続くと、挿入、欠失、置換を含む3つのランダムな変異が発生します。(D)pX458-sgRNA1(ターゲット1)およびpX458-sgRNA2(ターゲット2)をトランスフェクションしたHeLa細胞の代表的な蛍光画像。スケールバー = 50 μm。 (E)コントロール、ターゲット1、およびターゲット2におけるゲノムDNAの代表的なアガロースゲル電気泳動。(F-H)コントロール群、クローン1群、およびクローン3群のターゲット領域のサンガーシーケンシング結果。PCR増幅は、単離されたクローン1およびクローン3細胞の標的遺伝子座に特異的フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて実施した。DNA断片をpMD18-Tベクターにクローニングし、クローン形成およびサンガーシーケンシングのためにDH5α大腸菌にトランスフェクションしました。代表的なシークエンス結果を示します。クローン1 HeLa細胞では、28 bpで+ 1 bpの挿入がありました。クローン2のHeLa細胞では、28 bpで+1 bpの挿入も見られました。クローン 3 では、1,102-1,108 bp で -7 bp の欠失がありました。クローン 4 では、1,102 bp で -1 bp の欠失がありました。これら2つの変異は、いずれもフレームシフト変異とCENP-Eタンパク質の早期停止をもたらす。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:CRISPR/Cas9を介したCENP-EノックアウトHeLa細胞株の構築と表現型ベースのスクリーニング戦略。 (A)スクリーニング戦略は細胞コロニーに基づいています。対照群と比較して、CENP-Eノックアウト細胞は分裂細胞の有意な増加を示しました。スケールバー = 50 μm。 (B)スクリーニング戦略は、染色体アライメントに基づいています。対照群と比較して、CENP-Eノックアウト細胞は染色体のミスアライメントの増加を示しました。いくつかの染色体は、CENP-E欠失後の紡錘体極の近位に位置していた。DAPI、青。スケールバー = 10 μm。 (C)スクリーニング戦略は、CENP-Eタンパク質の蛍光強度に基づいています。CENP-E、緑。スケールバー = 10 μm。 (D) CRISPR/Cas9システムの構築CENP-E特異的sgRNAをpX458プラスミドにライゲーションし、バリデーションのために配列決定しました。pX458-sgRNAプラスミドをトランスフェクション試薬を用いてHeLa細胞にトランスフェクションし、48時間培養しました。細胞を0.25%トリプシン/EDTAを用いて溶解し、96ウェルプレートに播種し、細胞コロニーを形成するために培養した。(E)対照群およびCENP-E-/-群におけるCENP-Eおよびα-チューブリンの代表的な免疫蛍光画像。DAPI、青;CENP-E、緑;α-チューブリン、赤。スケールバー = 10 μm。 (F)対照群とCENP-E-/-群の染色体にミスアライメントのある中期細胞の比率。コントロール、0.30±0.21%、n = 9;クローン 1、4.15 ± 0.57%、n = 9;クローン 3、5.85 ± 0.80%、n = 9。(G)対照群とCENP-E-/群 における中期細胞の比率。コントロール、3.49±0.47%、n = 9;クローン 1、5.86 ± 0.57%、n = 9。クローン 2、6.70 ± 0.77%、n = 9。(H)対照群とCENP-E-/-群における間期細胞の比率。コントロール、70.08±2.71%、n = 7;クローン 1、86.77 ± 0.91%、n = 7;クローン 3、87.67 ± 0.91%、n = 7。(I)前期、中期、後期、および終期細胞の比率を含む、対照およびCENP-E-/-グループの有糸分裂指数分析。(J)対照群およびCENP-E-/-群におけるBubR1およびCENP-Bの代表的な免疫蛍光画像。DAPI、青;BubR1、緑;CENP-B、赤。スケールバー = 10 μm。 (K) コントロール群とCENP-E-/-群のBubR1とCENP-Bのラインスキャン分析。X 軸は相対距離を示します。Y軸は蛍光強度を示す。(L)対照群およびCENP-E-/-群におけるBubR1の相対蛍光強度(細胞質内の動原体/BubR1の蛍光強度におけるBubR1の蛍光強度)。コントロール、1.44±0.10、n = 16;クローン 1、0.98 ± 0.07、n = 18。すべてのグラフについて、平均±SEMが示されました。図2F-Iでは、ANOVA Dunnettの多重比較検定。ns、p > 0.05;**、p < 0.01;, p < 0.001;, p < 0.0001.図2Lでは、対応のないスチューデントのt検定。、p < 0.001。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:細胞コロニー形成、細胞生存率アッセイ、核型解析を含む 、CENP-E ノックアウトHeLa細胞の細胞増殖アッセイ。 (A)対照群および CENP-E-/群 の細胞コロニーの代表画像。スケールバー = 50 μm。 (B)対照群および CENP-E-/- 群における細胞コロニーの代表的な結晶紫色染色。スケールバー = 1 cm。 (C)野生型(コントロール)および CENP-E-/- グループのクローンあたりの細胞数。野生型、81.97 ± 4.09、n = 32;クローン 1、31.52 ± 2.51、n = 33。クローン 2、13.97 ± 1.31、n = 33。クローン 3、48.48 ± 3.01、n = 33;クローン 4、33.39 ± 1.87、n = 33。(D)細胞コロニーの相対的な細胞生存率を、A600nmにおける結晶紫色吸光度により測定した。野生型、0.42 ± 0.00、n = 6;クローン 1、0.12 ± 0.00、n = 6。クローン 2、0.13 ± 0.00、n = 6。クローン 3、0.18 ± 0.00、n = 6。クローン 4、0.12 ± 0.00、n = 6。(E)MTSおよび細胞生存率アッセイを用いた野生型および CENP-E-/-基の細胞生存率。野生型、1.05±0.00、n = 8;クローン 1、0.77 ± 0.01、n = 8。クローン 2、0.67 ± 0.01、n = 7。クローン 3、0.79 ± 0.00、n = 7;クローン 4、0.66 ± 0.01、n = 7。(F)野生型および CENP-E-/- グループの細胞あたりの染色体数。野生型、67.09 ± 0.50、n = 66;クローン 1、61.68 ± 0.83、n = 105。クローン 2、56.08 ± 0.6、n = 106。クローン 3、61.28 ± 0.63、n = 90。クローン 4、64.18 ± 0.83、n = 61。(G)対照群と CENP-E-/-群に広がる染色体の代表画像。スケールバー = 10 μm。すべてのグラフについて、ANOVA Dunnett の多重比較検定。エラーバー、平均±SEM。 **、 p < 0.01;、 p < 0.001;、 p < 0.0001 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4: CENP-E ノックアウトHeLa細胞を使用して、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証。 (A)異なる濃度のGSK923295処理後の対照群および CENP-E-/-基の代表的な結晶紫色染色。スケールバー = 1 cm。 (B)異なる濃度のGSK923295で処理した後のコントロール群および CENP-E-/群 の細胞コロニーの代表的な画像。スケールバー = 50 μm。 (C)異なる濃度のGSK923295を処理した後の対照群の細胞コロニーの直径。コントロール、28.68±0.85μm、n = 149;10 nM、25.40 ± 0.86 μm、n = 223;25 nM、26.07 ± 0.68 μm、n = 255;50 nM、26.41 ± 0.60 μm、n = 180;100 nM、16.02 ± 0.32 μm、n = 185;200 nM、15.61 ± 0.29 μm、n = 185。(D)異なる濃度のGSK923295処理後の CENP-E-/- 基の細胞コロニーの直径。クローン1、17.64 ± 0.40 μm、n = 230;10 nM、17.98 ± 0.39 μm、n = 230;25 nM、15.03 ± 0.26 μm、n = 230;50 nM、16.14 ± 0.32 μm、n = 230;100 nM、21.13 ± 0.42 μm、n = 230;200 nM、19.00 ± 0.40 cm、n = 230。(E)対照群および CENP-E-/-群におけるα-チューブリンの代表的な免疫蛍光画像は、異なる濃度のGSK923295、DAPI、青色で処理した後です。α-チューブリン、緑色。スケールバー = 10 μm。 (F)異なる濃度のGSK923295で処理した後のコントロール群および CENP-E-/-群における中期細胞の比率。(G)対照群と CENP-E-/-群の染色体に不整合のある中期細胞の比率を、異なる濃度のGSK923295で処理した後。すべてのグラフについて、ANOVA Dunnett の多重比較検定。エラーバー、平均±SEM。 ns、 p > 0.05;*、 p < 0.05;**, p < 0.01;、 p < 0.0001 です。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

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Discussion

キネシン-7 CENP-Eは、細胞分裂中の染色体アライメントと紡錘体アセンブリチェックポイントにおける重要な調節因子です17,19,20。CENP-Eの遺伝子欠失は、通常、紡錘体アセンブリチェックポイントの活性化、細胞周期停止、および細胞死をもたらします27,29,51,52。したがって、安定したCENP-Eノックアウト細胞株の構築は、CENP-E生物学における重要な未解決の問題です。本研究では、CRISPR/Cas9システムを用いてCENP-EノックアウトHeLa細胞の作製に成功しました。この研究では、細胞コロニースクリーニング、染色体アライメント表現型、およびCENP-Eタンパク質の蛍光強度という3つの最適化された表現型ベースのスクリーニング戦略を確立し、CENP-Eノックアウト細胞の効率と成功率を大幅に向上させました。

この調査には、いくつかの重要なステップがあります。まず、オフターゲット効果を最小限に抑えるには、最適化されたsgRNAの設計が不可欠です。第二に、脂質ベースの試薬、エレクトロポレーション、またはレンチウイルストランスフェクションを介してCRISPRプラスミドを培養細胞にトランスフェクションすることで、トランスフェクション効率と遺伝子ノックアウト細胞比を向上させることができます。さらに、蛍光活性化セルソーティング53、54、55およびピューロマイシン選択56、57のアプリケーションにより、スクリーニング速度が加速され、実験期間が短縮されます。第三に、遺伝子ノックアウト表現型の検証は、PCR、ウェスタンブロット、免疫蛍光アッセイ、およびゲノムDNAシーケンシングによって達成できます。第四に、CENP-Eノックアウト表現型の機能解析は、細胞増殖アッセイ、免疫蛍光、細胞周期解析、高分解能イメージングなど、さまざまなアッセイを用いて研究することができます。

ZFNやTALENなどの従来のゲノム編集技術と比較して、CRISPR/Cas9システムは、シンプルさ、高効率、カスタマイズの容易さ、汎用性、マルチプレックス機能など、いくつかの利点を示します10。さらに、CRISPR/Cas9システムは、ハイスループットスクリーニングや大規模なエンジニアリングプロジェクトのためにスケールアップすることができます58,59。また、CRISPR/Cas9システムは、複数の遺伝子のワンステップ変異を可能にする効率的な遺伝子編集技術として採用されており60、機能的に冗長な遺伝子、相互作用する遺伝子、および多遺伝子遺伝病の研究を加速させる。さらに、CRISPR/Cas9システムは、その効率と汎用性を向上させることができます8。代替の主要なDNA修復経路であるハイフィデリティHDR経路は、将来、分裂細胞の標的遺伝子座での正確な遺伝子編集を媒介するために使用できます10。さらに、複数のsgRNAの同時トランスフェクションは、細胞内のCENP-Eの大規模な欠失と完全なノックアウトをもたらす可能性があり、CENP-Eノックアウト細胞の安定性と信頼性を向上させます。

CRISPR/Cas9システムの主な限界は、SpCas9がオフターゲット突然変異誘発を起こしやすく、ゲノム内の意図しない部位を標的とし、オフターゲット効果を引き起こすことがあることです。これは、改良されたガイドRNA設計、オフターゲット予測アルゴリズム、および全ゲノムシーケンシングによって最小限に抑えることができます10,59。オフターゲット効果を低減するために、代替のCas12aまたはCas13タンパク質の使用53、塩基エディターの使用61、Cas9タンパク質およびガイドRNAの送達12など、いくつかのアプローチが開発されている。第2の限界は、広く用いられている化膿連鎖球菌Cas9(SpCas9)は、標的遺伝子座の認識に必要な5'-NGG PAMを必要とするため、ゲノム中のSpCas9の標的部位の選択が制限されることです。緩和されたPAMや多様なPAMを認識する改変されたSpCas9変異体の開発は、CRISPR/Cas9ゲノム工学ツールボックス62,63,64におけるCas9の標的範囲を拡大する可能性がある。さらに、いくつかのケースでは、CRISPR/Cas9システムがモザイク現象を引き起こし、細胞集団に異なる編集をもたらす65。一部の動物はCas9タンパク質に対する免疫応答を刺激する可能性があり、特定の種でのその適用が制限されます12,66。これらの制限にもかかわらず、CRISPR/Cas9システムは、基礎科学、バイオテクノロジー、遺伝子治療、および医学におけるゲノム編集および遺伝子機能の研究のための強力な遺伝子編集技術であり続けています。

CENP-Eとその阻害剤の相互作用様式と分子機構は、細胞生物学および癌研究において重要な研究分野です。部位特異的突然変異誘発および分子生物学的研究により、GSK923295がIle182およびThr183およびCENP-Eタンパク質と相互作用し、ヘリックスα2およびα3の間に挟まれ、ループ5の近くに存在することが明らかになった25。この研究では、CENP-EノックアウトHeLa細胞株が、CENP-E阻害剤の特異性と毒性を検証するための貴重なツールとして確立されました。今日まで、ほとんどのCENP-E阻害剤の結合部位とメカニズムはよく理解されていません。分子質量分析イメージング67、核磁気共鳴分光法68、光ピンセット69、分子構造改変、X線結晶構造解析70、クライオ電子顕微鏡71,72の組み合わせは、CENP-E阻害の相互作用部位とメカニズムの解明に寄与するであろう。将来的には、特定の部位におけるCENP-Eの相同性指向性修復媒介標的修飾により、CENP-E遺伝子編集細胞を生成することができ、CENP-E特異的阻害剤の特異的結合部位およびメカニズムを明らかにするのに役立つであろう。

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Disclosures

著者には開示すべき利益相反はありません。

Acknowledgments

有益な議論をしてくれた福建医科大学細胞骨格研究所のすべてのメンバーに感謝します。福建医科大学公共技術サービスセンターのJun-Jin Lin氏、Zhi-Hong Huang氏、Ling Lin氏、Li-Li Pang氏、Lin-Ying Zhou氏、Xi Lin氏、Min-Xia Wu氏の技術支援に感謝します。福建医科大学基礎医学実験教育センターのSi-Yi Zheng氏、Ying Lin氏、Qi Ke氏のご支援に感謝します。本研究は、中国国家自然科学基金会(助成金番号82001608および82101678)、中国福建省自然科学基金会(助成金番号2019J05071)、中国福建省科学技術イノベーション共同基金(助成金番号2021Y9160)、福建医科大学ハイレベル人材科学研究立ち上げ資金プロジェクト(助成金番号XRCZX2017025)の支援を受けて行われました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco 25200056
1.5 mL centrifuge tube Axygen MCT-150-C
24-well plate Corning 3524
4S Gelred, 10,000x in water Sangon Biotech (Shanghai) A616697
50 mL centrifuge tube Corning 430828
6 cm Petri dish Corning 430166
95% ethanol Sinopharm Chemical Reagent 10009164
96-well plate Corning 3599
Acetic acid Sinopharm Chemical Reagent 10000218 Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose Sangon Biotech (Shanghai) A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0428 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L) Beyotime A0423 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L) Beyotime A0460 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol Sinopharm Chemical Reagent 100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody Abcam ab254326 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution 
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody Santa Cruz Biotechnology sc-376392 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody Abcam ab133583 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium Beyotime P0131 Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody Abcam ab7291 For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer Biotek Instruments Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA) Sinopharm Chemical Reagent 69003435
BpiI (BbsI) Thermo Fisher Scientific ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay Promega G3580
Centrifuge Eppendorf 5424BK745380
Colchicine Sinopharm Chemical Reagent 61001563
Confocal scanning microscope Leica Leica TCS SP8
Coverslip CITOTEST 80344-1220
DAPI Beyotime C1006
DH5α competent cells Sangon Biotech (Shanghai) B528413
DL2000 DNA marker TaKaRa 3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit Equation 2 Omega D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit Sangon Biotech (Shanghai) B518251
Fetal bovine serum Zhejiang Tianhang Biotechnology 11011-8611
Gentian violet Sinopharm Chemical Reagent 71019944 Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution Sinopharm Chemical Reagent 71020260
GraphPad Prism version 8.0 software GraphPad www.graphpad.com Statistical analysis.
GSK923295 MedChemExpress HY-10299
HeLa cell line ATCC CCL-2
Humidified incubator Heal Force HF90/HF240
Image J software National Institutes of Health https://imagej.nih.gov/ij/ Image processing and analysis.
Inverted microscope Nanjing Jiangnan Novel Optics XD-202
LB agar powder Sangon Biotech (Shanghai) A507003
Lipo6000 transfection reagent Beyotime C0526
Nikon Ti-S2 microscope Nikon Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium Gibco 31985070
Paraformaldehyde Sinopharm Chemical Reagent 80096618 Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution HyClone SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit Sangon Biotech (Shanghai) B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit Sangon Biotech (Shanghai) B518191
T4 DNA ligase TaKaRa 2011A
T4 polynucleotide kinase TaKaRa 2021A
TaKaRa Ex Taq TaKaRa RR001A
Triton X-100 Sinopharm Chemical Reagent 30188928 Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20 Sinopharm Chemical Reagent 30189328 Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.

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References

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生物学、第196号、CENP-Eノックアウト、セントロメア関連プロテインE、キネシン、動原体微小管捕捉、染色体アライメント、紡錘体アセンブリチェックポイント、HeLa細胞、表現型ベースのスクリーニング、染色体ミスアライメント、BUB1有糸分裂チェックポイントセリン/スレオニンキナーゼB(BubR1)、有糸分裂欠損症
CRISPR/Cas9システムを用いたセントロメア関連プロテイン-E <em><sup>CENP-E-/-</sup></em>ノックアウト細胞株の作製
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