घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करके मानव मल से बैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर पुटिकाओं का अलगाव और शुद्धिकरण
Summary
यह अध्ययन घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) के माध्यम से मानव मल से समृद्ध बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) को अलग करने और शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन करता है, आकृति विज्ञान, कण आकार और एकाग्रता से बीईवी की भौतिक विशेषताओं की पहचान करता है, और नैदानिक और वैज्ञानिक अनुसंधान में डीजीसी दृष्टिकोण के संभावित अनुप्रयोगों पर चर्चा करता है।
Abstract
बैक्टीरियल एक्स्ट्रासेल्युलर वेसिकल्स (बीईवी) बैक्टीरिया से प्राप्त नैनोवेसिकल्स हैं जो बैक्टीरिया-बैक्टीरिया और बैक्टीरिया-होस्ट संचार में सक्रिय भूमिका निभाते हैं, जो मूल बैक्टीरिया से विरासत में मिले प्रोटीन, लिपिड और न्यूक्लिक एसिड जैसे बायोएक्टिव अणुओं को स्थानांतरित करते हैं। आंत माइक्रोबायोटा से प्राप्त बीईवी का जठरांत्र संबंधी मार्ग के भीतर प्रभाव पड़ता है और दूर के अंगों तक पहुंच सकता है, जिसके परिणामस्वरूप शरीर विज्ञान और विकृति विज्ञान के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है। सैद्धांतिक जांच जो मानव मल से प्राप्त बीईवी के प्रकार, मात्रा और भूमिकाओं का पता लगाती है, आंत माइक्रोबायोटा से बीईवी के स्राव और कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन जांचों में बीईवी को अलग करने और शुद्ध करने के लिए वर्तमान रणनीति में सुधार की भी आवश्यकता है।
इस अध्ययन ने दो घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी) मोड स्थापित करके बीईवी के अलगाव और शुद्धिकरण प्रक्रिया को अनुकूलित किया: टॉप-डाउन और बॉटम-अप। बीईवी का समृद्ध वितरण अंश 6 से 8 (एफ 6-एफ 8) में निर्धारित किया गया था। दृष्टिकोण की प्रभावशीलता का मूल्यांकन कण आकृति विज्ञान, आकार, एकाग्रता और प्रोटीन सामग्री के आधार पर किया गया था। कण और प्रोटीन वसूली दर की गणना की गई थी, और दो डीजीसी मोड की वसूली और शुद्धता की तुलना करने के लिए विशिष्ट मार्करों की उपस्थिति का विश्लेषण किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि टॉप-डाउन सेंट्रीफ्यूजेशन मोड में संदूषण का स्तर कम था और बॉटम-अप मोड के समान रिकवरी दर और शुद्धता हासिल की। 7 घंटे का एक सेंट्रीफ्यूजेशन समय 108 / मिलीग्राम की फेकल बीईवी एकाग्रता प्राप्त करने के लिए पर्याप्त था।
मल के अलावा, इस विधि को घटकों और चिपचिपाहट में अंतर के अनुसार उचित संशोधन के साथ शरीर के अन्य तरल पदार्थों पर लागू किया जा सकता है। अंत में, यह विस्तृत और विश्वसनीय प्रोटोकॉल बीईवी के मानकीकृत अलगाव और शुद्धिकरण की सुविधा प्रदान करेगा और इस प्रकार, बाद के बहु-ओमिक्स विश्लेषण और कार्यात्मक प्रयोगों के लिए एक नींव रखेगा।
Introduction
आंत को व्यापक रूप से मानव शरीर में सबसे प्रचुर मात्रा में माइक्रोबियल समुदायों को शरण देने वाले अंग के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें 90% से अधिक बैक्टीरिया उपनिवेशण और गुणन 1,2 में शामिल होते हैं। व्यापक सबूत से पता चला है कि आंत माइक्रोबायोटा आंत microenvironment modulates और साथ ही दूर के अंगों में शिथिलता के साथ बातचीत, मुख्य रूप से एक बिगड़ा आंतों बाधा 3,4 के माध्यम से. बढ़ते सबूत आंत माइक्रोबायोटा के असंतुलन और सूजन आंत्र रोग (आईबीडी)5,6की प्रगति के साथ-साथ आंत-मस्तिष्क अक्ष 5,6,7,8के माध्यम से संज्ञानात्मक विकारों के बीच एक संबंध को इंगित करता है। बैक्टीरिया द्वारा उत्पादित बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) इन रोग प्रक्रियाओं में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
बीईवी नैनोस्केल कण हैं जो बैक्टीरियल डेरिवेटिव को एनकैप्सुलेट करते हैं, जिनका व्यास 20 से 400 एनएम तक होता है। वे बैक्टीरिया और उनके मेजबान जीवों 9,10 के बीच बातचीत की सुविधा के लिए प्रदर्शन किया गया है. उनकी अदृश्यता के बावजूद, इन कणों नैदानिक biomarkers के रूप में उनके संभावित व्यापक अनुप्रयोगों के कारण शोधकर्ताओं से बढ़ती ध्यान आकर्षित किया है, चिकित्सीय लक्ष्य, और दवा वितरण वाहनों11. मानव मल, अक्सर बीईवी का अध्ययन करने के लिए बायोस्पेसिमेन के रूप में उपयोग किया जाता है, मुख्य रूप से आंत बैक्टीरिया से प्राप्त होता है, जिसमें पानी, बैक्टीरिया, लिपिड, प्रोटीन, अपचित खाद्य अवशेष, और दूसरों के बीच एक्सफोलिएटेड एपिथेलियल कोशिकाओं का एक जटिल मिश्रण होता है। जटिल फेकल संरचना बीईवी के अलगाव और शुद्धता के लिए चुनौतियां पैदा करती है, जिससे बीईवी के व्यापक, उद्देश्यपूर्ण और यथार्थवादी विश्लेषण में बाधा उत्पन्न होती है। इसलिए, दूषित घटकों से हस्तक्षेप को कम करने और बीईवी की उपज बढ़ाने के लिए प्रभावी रणनीतियां महत्वपूर्ण मुद्दों के रूप में उभरी हैं जिन पर तत्काल ध्यान देने की आवश्यकता है।
मौजूदा अलगाव रणनीतियाँ काफी हद तक अल्ट्रा-हाई-स्पीड सेंट्रीफ्यूजेशन (यूसी), घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन (डीजीसी), और आकार बहिष्करण क्रोमैटोग्राफी (एसईसी)12,13,14,15,16,17जैसी तकनीकों पर निर्भर करती हैं। वर्तमान में, डीजीसी बीईवी पृथक्करण के क्षेत्र में सबसे व्यापक रूप से लागू तरीकों में से एक है, जिसमें दो अवसादन-फ्लोटिंग मोड, “टॉप-डाउन” और “बॉटम-अप” शामिल हैं, जो नमूने की प्रारंभिक लोडिंग स्थिति द्वारा निर्धारित किए जाते हैं। ये पद्धतियां आकार और घनत्व असमानताओं के आधार पर अन्य घटकों से बाह्य पुटिकाओं (ईवीएस) को अलग करती हैं, जिससे परिवर्तनीय शुद्धता और वसूली दर मिलती है। पूर्व शोध ने संकेत दिया है कि शरीर के तरल पदार्थ के नमूनों में घुलनशील प्रोटीन से ईवीएस को पर्याप्त रूप से अलग करने के लिए एकल-दृष्टिकोण रणनीतियां अपर्याप्त हैं, जैसे कि रक्त18 में लिपोप्रोटीन और मूत्र19 में टैम-हॉर्सफॉल प्रोटीन। इसके अतिरिक्त, यूकेरियोटिक बाह्य पुटिकाओं (ईईवी) का आकार वितरण अक्सर बीईवी के साथ ओवरलैप होता है, जिससे बीईवी उपज को अनुकूलित करने के लिए आगे पद्धतिगत संवर्द्धन की आवश्यकता होती है। नतीजतन, बीईवी के अध्ययन को आगे बढ़ाना प्रभावी पृथक्करण और शुद्धिकरण पद्धतियों के विकास पर टिका है। विशेष रूप से, टुल्केन्स एट अल 15 ने ईईवी से फेकल बीईवी को अलग करने के लिए एक ऑर्थोगोनल बायोफिजिकल रणनीति को नियोजित किया, जिसमें बॉटम-अप डीजीसी मोड का सेंट्रीफ्यूजेशन समय18 घंटे तक था। इसके विपरीत, इस अध्ययन ने इसे 7 घंटे तक कम कर दिया, ढाल-अल्ट्रासेंट्रीफ्यूजेशन समय को बहुत बचाया और प्रक्रिया को सरल बनाया।
वर्तमान अध्ययन में, हमने कम से अत्यधिक उच्च वेग तक, अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन गति की एक श्रृंखला के साथ बीईवी को समृद्ध करने के बाद, अनुकूलित बफर स्थितियों के तहत दो डीजीसी मोड को नियोजित करने वाले फेकल बीईवी को अलग और शुद्ध किया। आकृति विज्ञान, कण आकार और एकाग्रता के आधार पर मूल्यांकन ने इस उन्नत विधि द्वारा एक सराहनीय प्रदर्शन का संकेत दिया। यह अध्ययन भविष्य के अनुसंधान की नींव के रूप में काम कर सकता है, इसके अनुप्रयोगों को एक व्यापक डोमेन तक बढ़ा सकता है, और मानव शरीर के भीतर बीईवी की विविधता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यह बीईवी पृथक्करण और विश्लेषण तकनीकों के मानकीकरण में भी योगदान देता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
बैक्टीरियल बाह्य पुटिकाओं (बीईवी) लिपिड-बाइलेयर नैनोकणों को बैक्टीरिया द्वारा स्रावित किया जाता है, प्रोटीन, लिपिड, न्यूक्लिक एसिड और अन्य बायोएक्टिव अणुओं का खजाना ले जाता है, जो बैक्टीरिया20</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को प्रतिष्ठित युवा विद्वानों (82025024) के लिए राष्ट्रीय विज्ञान कोष द्वारा समर्थित किया गया था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (82230080) की प्रमुख परियोजना; चीन का राष्ट्रीय कुंजी अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2021YFA1300604); चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (81871735, 82272438, और 82002245); विशिष्ट युवा विद्वानों के लिए ग्वांगडोंग प्राकृतिक विज्ञान कोष (2023B1515020058); ग्वांगडोंग प्रांत का प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (2021A1515011639); चीन में शेडोंग प्रांत के प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन के प्रमुख राज्य बुनियादी अनुसंधान विकास कार्यक्रम (ZR2020ZD11); पोस्ट-डॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (2022M720059); नानफांग अस्पताल, दक्षिणी चिकित्सा विश्वविद्यालय (2022J001) की उत्कृष्ट युवा विकास योजना।
Materials
| 1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
| 1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
| 1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
| 1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
| 5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
| 5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
| 75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
| 96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
| Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
| Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
| Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
| Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
| Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
| Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
| Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
| Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
| Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
| Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
| Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
| Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
| Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
| HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
| Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
| Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
| LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
| Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
| Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
| Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
| Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
| Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
| NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
| NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
| Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
| Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
| Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
| Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
| Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
| Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
| Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
| Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
| Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
| TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
| Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
| Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
| Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
| Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
| ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |
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