Isolamento e purificazione di vescicole extracellulari batteriche da feci umane mediante centrifugazione a gradiente di densità

Summary

Questo studio descrive un metodo per isolare e purificare le vescicole extracellulari batteriche (BEV) arricchite da feci umane tramite centrifugazione a gradiente di densità (DGC), identifica le caratteristiche fisiche dei BEV dalla morfologia, dalla dimensione delle particelle e dalla concentrazione e discute le potenziali applicazioni dell’approccio DGC nella ricerca clinica e scientifica.

Abstract

Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanovescicole derivate da batteri che svolgono un ruolo attivo nella comunicazione batterio-batterio e batterio-ospite, trasferendo molecole bioattive come proteine, lipidi e acidi nucleici ereditati dai batteri genitori. I BEV derivati dal microbiota intestinale hanno effetti all’interno del tratto gastrointestinale e possono raggiungere organi distanti, con conseguenti implicazioni significative per la fisiologia e la patologia. Le indagini teoriche che esplorano i tipi, le quantità e i ruoli dei BEV derivati dalle feci umane sono fondamentali per comprendere la secrezione e la funzione dei BEV dal microbiota intestinale. Queste indagini richiedono anche un miglioramento dell’attuale strategia per l’isolamento e la purificazione dei BEV.

Questo studio ha ottimizzato il processo di isolamento e purificazione dei BEV stabilendo due modalità di centrifugazione a gradiente di densità (DGC): Top-down e Bottom-up. La distribuzione arricchita dei BEV è stata determinata nelle frazioni da 6 a 8 (F6-F8). L’efficacia dell’approccio è stata valutata in base alla morfologia delle particelle, alle dimensioni, alla concentrazione e al contenuto proteico. Sono stati calcolati i tassi di recupero di particelle e proteine ed è stata analizzata la presenza di marcatori specifici per confrontare il recupero e la purezza delle due modalità DGC. I risultati hanno indicato che la modalità di centrifugazione top-down aveva livelli di contaminazione più bassi e raggiungeva un tasso di recupero e una purezza simili a quelli della modalità bottom-up. Un tempo di centrifugazione di 7 ore è stato sufficiente per raggiungere una concentrazione fecale di BEV di 10⁸/mg.

Oltre alle feci, questo metodo potrebbe essere applicato ad altri tipi di fluidi corporei con opportune modifiche in base alle differenze nei componenti e nella viscosità. In conclusione, questo protocollo dettagliato e affidabile faciliterebbe l’isolamento e la purificazione standardizzati dei BEV e, quindi, getterebbe le basi per le successive analisi multi-omiche e gli esperimenti funzionali.

Introduction

L’intestino è ampiamente riconosciuto come l’organo che ospita le comunità microbiche più abbondanti nel corpo umano, con oltre il 90% dei batteri coinvolti nella colonizzazione e moltiplicazione ^1,2. Numerose evidenze hanno dimostrato che il microbiota intestinale modula il microambiente intestinale e contemporaneamente interagisce con la disfunzione in organi distanti, principalmente attraverso una barriera intestinale compromessa ^3,4. Prove crescenti indicano una correlazione tra lo squilibrio del microbiota intestinale e la progressione della malattia infiammatoria intestinale (IBD)5,6, nonché i disturbi cognitivi attraverso l’asse intestino-cervello 5,6,7,8. Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) prodotte dai batteri svolgono un ruolo significativo in questi processi patologici.

I BEV sono particelle su scala nanometrica che incapsulano derivati batterici, con diametri compresi tra 20 e 400 nm. È stato dimostrato che facilitano le interazioni tra i batteri e i loro organismi ospiti ^9,10. Nonostante la loro invisibilità, queste particelle hanno attirato una crescente attenzione da parte dei ricercatori a causa delle loro ampie applicazioni come biomarcatori diagnostici, bersagli terapeutici e veicoli di somministrazione di farmaci¹¹. Le feci umane, spesso utilizzate come campioni biologici per lo studio dei BEV, provenienti prevalentemente da batteri intestinali, contengono una complessa miscela di acqua, batteri, lipidi, proteine, residui di cibo non digerito e cellule epiteliali esfoliate, tra gli altri. L’intricata composizione fecale pone sfide all’isolamento e alla purezza dei BEV, impedendo così un’analisi completa, obiettiva e realistica dei BEV. Pertanto, le strategie efficaci per ridurre al minimo le interferenze dovute alla contaminazione dei componenti e migliorare la resa dei BEV sono emerse come questioni critiche che meritano un’attenzione immediata.

Le strategie di isolamento esistenti si basano in gran parte su tecniche come la centrifugazione ad altissima velocità (UC), la centrifugazione a gradiente di densità (DGC) e la cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC)12,13,14,15,16,17. Attualmente, il DGC è uno dei metodi più ampiamente applicati nel campo della separazione dei BEV, che comprende due modalità di sedimentazione-galleggiamento, “Top-down” e “Bottom-up”, che sono determinate dalla posizione di carico iniziale del campione. Queste metodologie differenziano le vescicole extracellulari (EV) da altri componenti in base alle disparità di dimensioni e densità, producendo velocità di purezza e recupero variabili. Ricerche precedenti hanno indicato che le strategie ad approccio singolo sono insufficienti per separare adeguatamente le vescicole extracellulari dalle proteine solubili nei campioni di fluidi corporei, come la lipoproteina nel sangue¹⁸ e la proteina Tamm-Horsfall nelle urine¹⁹. Inoltre, la distribuzione dimensionale delle vescicole extracellulari eucariotiche (EEV) spesso si sovrappone a quella dei BEV, rendendo quindi necessari ulteriori miglioramenti metodologici per ottimizzare la resa dei BEV. Di conseguenza, l’avanzamento dello studio dei BEV dipende dallo sviluppo di metodologie efficaci di separazione e purificazione. In particolare, Tulkens et al. 15 hanno impiegato una strategia biofisica ortogonale per separare i BEV fecali dagli EEV, in cui il tempo di centrifugazione di una modalità DGC dal basso verso l’alto era fino a^{18 ore.} Al contrario, questo studio lo ha ridotto a 7 ore, risparmiando notevolmente il tempo di ultracentrifugazione a gradiente e semplificando il processo.

Nel presente studio, abbiamo isolato e purificato BEV fecali impiegando due modalità DGC in condizioni tampone ottimizzate, dopo aver arricchito i BEV con una gamma di velocità di centrifugazione differenziali, da bassa a altissima velocità. Le valutazioni basate sulla morfologia, la dimensione delle particelle e la concentrazione hanno indicato prestazioni encomiabili con questo metodo avanzato. Questo studio potrebbe fungere da base per la ricerca futura, estendendo le sue applicazioni a un dominio più ampio e offrendo approfondimenti sull’eterogeneità dei BEV all’interno del corpo umano. Contribuisce inoltre alla standardizzazione delle tecniche di separazione e analisi dei BEV.

Protocol

Il Comitato Etico del Nanfang Hospital, Southern Medical University, ha approvato questo studio, che è stato condotto con il consenso informato dei partecipanti. Tutti i metodi utilizzati nel presente documento sono conformi alle linee guida operative standard fornite dagli standard internazionali del microbioma umano (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Tutte le successive procedure di manipolazione dei liquidi dovevano essere eseguite all’interno di una cabina di biosicurezza o di un banco ultra-pulito. <…

Representative Results

Determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con BEVPer determinare la distribuzione delle frazioni arricchite con vescicole extracellulari batteriche (BEV), è stato stabilito un controllo in bianco per misurare i valori di assorbanza a OD 340 nm e la densità di ciascuna frazione è stata calcolata in base alle misurazioni e alle linee guida sullo iodixanolo (Fase 8.1). La Tabella 2 presenta i risultati della densità, dimostrando che le frazioni da F4 a F9 hanno mostrato…

Discussion

Le vescicole extracellulari batteriche (BEV) sono nanoparticelle a doppio strato lipidico secrete dai batteri, che trasportano una ricchezza di proteine, lipidi, acidi nucleici e altre molecole bioattive, contribuendo a mediare gli effetti funzionali dei batteri²⁰. È stato verificato che i BEV derivati dall’intestino sono coinvolti nello sviluppo di malattie, come la malattia infiammatoria intestinale, il morbo di Crohn e il cancro del colon-retto, e influenzano anche il metabolismo generale e me…

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4