Isolement et purification de vésicules extracellulaires bactériennes à partir de matières fécales humaines à l’aide d’une centrifugation à gradient de densité

Summary

Cette étude décrit une méthode permettant d’isoler et de purifier les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) enrichies à partir de matières fécales humaines par centrifugation à gradient de densité (DGC), identifie les caractéristiques physiques des VEB à partir de la morphologie, de la taille des particules et de la concentration, et discute des applications potentielles de l’approche DGC dans la recherche clinique et scientifique.

Abstract

Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanovésicules dérivées de bactéries qui jouent un rôle actif dans la communication bactérie-bactérie et bactérie-hôte, en transférant des molécules bioactives telles que des protéines, des lipides et des acides nucléiques hérités de la bactérie mère. Les VEB dérivés du microbiote intestinal ont des effets dans le tractus gastro-intestinal et peuvent atteindre des organes éloignés, ce qui a des implications importantes pour la physiologie et la pathologie. Les recherches théoriques qui explorent les types, les quantités et les rôles des VEB dérivés des matières fécales humaines sont cruciales pour comprendre la sécrétion et la fonction des VEB à partir du microbiote intestinal. Ces recherches nécessitent également une amélioration de la stratégie actuelle d’isolement et d’épuration des VEB.

Cette étude a permis d’optimiser le processus d’isolement et de purification des VEB en établissant deux modes de centrifugation à gradient de densité (DGC) : Top-down et Bottom-up. La distribution enrichie des VEB a été déterminée dans les fractions 6 à 8 (F6-F8). L’efficacité de l’approche a été évaluée en fonction de la morphologie, de la taille, de la concentration et de la teneur en protéines des particules. Les taux de récupération des particules et des protéines ont été calculés, et la présence de marqueurs spécifiques a été analysée pour comparer la récupération et la pureté des deux modes DGC. Les résultats ont indiqué que le mode de centrifugation descendante avait des niveaux de contamination plus faibles et atteignait un taux de récupération et une pureté similaires à ceux du mode ascendant. Un temps de centrifugation de 7 h a été suffisant pour atteindre une concentration fécale de 10⁸/mg.

Outre les matières fécales, cette méthode pourrait être appliquée à d’autres types de fluides corporels avec une modification appropriée en fonction des différences de composants et de viscosité. En conclusion, ce protocole détaillé et fiable faciliterait l’isolement et la purification standardisés des BEV et jetterait ainsi les bases d’analyses multi-omiques ultérieures et d’expériences fonctionnelles.

Introduction

L’intestin est largement reconnu comme l’organe abritant les communautés microbiennes les plus abondantes dans le corps humain, avec plus de 90% des bactéries impliquées dans la colonisation et la multiplication ^1,2. De nombreuses preuves ont démontré que le microbiote intestinal module le microenvironnement intestinal et interagit simultanément avec le dysfonctionnement d’organes distants, principalement par le biais d’une barrière intestinale altérée ^3,4. De plus en plus de preuves indiquent une corrélation entre le déséquilibre du microbiote intestinal et la progression des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin (MICI)5,6, ainsi que des troubles cognitifs à travers l’axe intestin-cerveau 5,6,7,8. Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) produites par les bactéries jouent un rôle important dans ces processus pathologiques.

Les BEV sont des particules à l’échelle nanométrique encapsulant des dérivés bactériens, avec des diamètres allant de 20 à 400 nm. Il a été démontré qu’ils facilitent les interactions entre les bactéries et leurs organismes hôtes ^9,10. Malgré leur invisibilité, ces particules ont attiré de plus en plus l’attention des chercheurs en raison de leurs vastes applications potentielles en tant que biomarqueurs diagnostiques, cibles thérapeutiques et véhicules d’administration de médicaments¹¹. Les excréments humains, souvent utilisés comme échantillons biologiques pour l’étude des VEB, provenant principalement de bactéries intestinales, contiennent un mélange complexe d’eau, de bactéries, de lipides, de protéines, de résidus alimentaires non digérés et de cellules épithéliales exfoliées, entre autres. La composition complexe des matières fécales pose des défis à l’isolement et à la pureté des VEB, ce qui empêche une analyse complète, objective et réaliste des VEB. Par conséquent, des stratégies efficaces visant à minimiser les interférences causées par des composants contaminants et à améliorer le rendement des VEB sont apparues comme des problèmes critiques nécessitant une attention immédiate.

Les stratégies d’isolement existantes reposent en grande partie sur des techniques telles que la centrifugation à ultra-haute vitesse (UC), la centrifugation à gradient de densité (DGC) et la chromatographie d’exclusion de taille (SEC)12,13,14,15,16,17. À l’heure actuelle, la DGC est l’une des méthodes les plus largement appliquées dans le domaine de la séparation des VEB, englobant deux modes de sédimentation-flottement, « Top-down » et « Bottom-up », qui sont déterminés par la position de chargement initiale de l’échantillon. Ces méthodologies différencient les vésicules extracellulaires (VE) des autres composants en fonction des disparités de taille et de densité, ce qui permet d’obtenir des taux de pureté et de récupération variables. Des recherches antérieures ont indiqué que les stratégies à approche unique sont insuffisantes pour séparer adéquatement les VE des protéines solubles dans les échantillons de fluides corporels, telles que la lipoprotéine dans le sang¹⁸ et la protéine Tamm-Horsfall dans l’urine¹⁹. De plus, la distribution de la taille des vésicules extracellulaires eucaryotes (EEV) chevauche souvent celle des BEV, ce qui nécessite d’autres améliorations méthodologiques pour optimiser le rendement des BEV. Par conséquent, l’avancement de l’étude des VEB repose sur le développement de méthodologies efficaces de séparation et de purification. En particulier, Tulkens et al¹⁵ ont utilisé une stratégie biophysique orthogonale pour séparer les VEB fécaux des VEE, dans laquelle le temps de centrifugation d’un mode DGC ascendant était jusqu’à 18 h. En revanche, cette étude l’a réduit à 7 h, ce qui a permis de gagner considérablement le temps d’ultracentrifugation par gradient et de simplifier le processus.

Dans la présente étude, nous avons isolé et purifié des VEB fécaux en utilisant deux modes DGC dans des conditions tampons optimisées, après avoir enrichi les VEB avec une gamme de vitesses de centrifugation différentielles, allant de faible à extrêmement élevée vitesse. Des évaluations basées sur la morphologie, la taille des particules et la concentration ont indiqué une performance louable de cette méthode améliorée. Cette étude pourrait servir de base à de futures recherches, en étendant ses applications à un domaine plus large et en offrant un aperçu de l’hétérogénéité des VEB dans le corps humain. Il contribue également à la standardisation des techniques de séparation et d’analyse des VEB.

Protocol

Le comité d’éthique de l’hôpital de Nanfang, Southern Medical University, a approuvé cette étude, qui a été menée avec le consentement éclairé des participants. Toutes les méthodes employées dans le présent document ont respecté les directives opérationnelles standard fournies par les Normes internationales sur le microbiome humain (IHMS : http://www.microbiome-standards.org/). Toutes les procédures subséquentes de manipulation des liquides devaient être effectuées dans une enceinte de sécurité b…

Representative Results

Déterminer la distribution des fractions enrichies en VEBPour déterminer la distribution des fractions enrichies en vésicules extracellulaires bactériennes (VEB), un témoin à blanc a été établi pour mesurer les valeurs d’absorbance à OD 340 nm, et la densité de chaque fraction a été calculée sur la base des mesures et des lignes directrices sur l’iodixanol (étape 8.1). Le tableau 2 présente les résultats de densité, démontrant que les fractions F4 à F9 présen…

Discussion

Les vésicules extracellulaires bactériennes (VEB) sont des nanoparticules bicouches lipidiques sécrétées par les bactéries, transportant une richesse de protéines, de lipides, d’acides nucléiques et d’autres molécules bioactives, contribuant à la médiation des effets fonctionnels des bactéries²⁰. Il a été prouvé que les VEB dérivés de l’intestin sont impliqués dans le développement de maladies, telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, la maladie de Crohn et …

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4