Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Summary

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV’s) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV’s op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Abstract

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) zijn nanoblaasjes die zijn afgeleid van bacteriën die een actieve rol spelen in de communicatie tussen bacteriën en bacteriën, waarbij bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren worden overgedragen die zijn geërfd van de ouderbacteriën. BEV’s afgeleid van de darmmicrobiota hebben effecten in het maagdarmkanaal en kunnen verre organen bereiken, wat resulteert in aanzienlijke implicaties voor fysiologie en pathologie. Theoretisch onderzoek naar de soorten, hoeveelheden en rollen van BEV’s afkomstig van menselijke uitwerpselen is cruciaal voor het begrijpen van de afscheiding en functie van BEV’s uit de darmmicrobiota. Deze onderzoeken vereisen ook een verbetering van de huidige strategie voor het isoleren en zuiveren van BEV’s.

Deze studie optimaliseerde het isolatie- en zuiveringsproces van BEV’s door twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) vast te stellen: Top-down en Bottom-up. De verrijkte verdeling van BEV’s werd bepaald in fracties 6 tot en met 8 (F6-F8). De effectiviteit van de aanpak werd geëvalueerd op basis van deeltjesmorfologie, grootte, concentratie en eiwitgehalte. De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten werden berekend en de aanwezigheid van specifieke markers werd geanalyseerd om het herstel en de zuiverheid van de twee DGC-modi te vergelijken. De resultaten gaven aan dat de top-down centrifugatiemodus lagere verontreinigingsniveaus had en een terugwinningspercentage en zuiverheid bereikte die vergelijkbaar waren met die van de bottom-upmodus. Een centrifugatietijd van 7 uur was voldoende om een fecale BEV-concentratie van 10⁸/mg te bereiken.

Afgezien van uitwerpselen, kan deze methode worden toegepast op andere soorten lichaamsvloeistoffen met de juiste modificatie volgens de verschillen in componenten en viscositeit. Concluderend kan worden gesteld dat dit gedetailleerde en betrouwbare protocol de gestandaardiseerde isolatie en zuivering van BEV’s zou vergemakkelijken en zo een basis zou leggen voor latere multi-omics-analyse en functionele experimenten.

Introduction

De darm wordt algemeen erkend als het orgaan dat de meest voorkomende microbiële gemeenschappen in het menselijk lichaam herbergt, met meer dan 90% van de bacteriën die betrokken zijn bij kolonisatie en vermenigvuldiging ^1,2. Uitgebreid bewijs heeft aangetoond dat de darmmicrobiota de darmmicro-omgeving moduleert en tegelijkertijd interageert met disfunctie in verre organen, voornamelijk via een verminderde darmbarrière ^3,4. Toenemend bewijs wijst op een correlatie tussen de onbalans van de darmmicrobiota en de progressie van inflammatoire darmaandoeningen (IBD)5,6, evenals cognitieve stoornissen via de darm-hersenas 5,6,7,8. Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) geproduceerd door bacteriën spelen een belangrijke rol in deze pathologische processen.

BEV’s zijn deeltjes op nanoschaal die bacteriële derivaten inkapselen, met diameters variërend van 20 tot 400 nm. Van hen is aangetoond dat ze interacties tussen bacteriën en hun gastheerorganismen vergemakkelijken ^9,10. Ondanks hun onzichtbaarheid hebben deze deeltjes steeds meer aandacht gekregen van onderzoekers vanwege hun toekomstige brede toepassingen als diagnostische biomarkers, therapeutische doelen en voertuigen voor medicijnafgifte^. Menselijke uitwerpselen, vaak gebruikt als biospecimens voor het bestuderen van BEV’s, voornamelijk afkomstig van darmbacteriën, bevatten een complex mengsel van onder andere water, bacteriën, lipiden, eiwitten, onverteerde voedselresten en geëxfolieerde epitheelcellen. De ingewikkelde fecale samenstelling vormt een uitdaging voor de isolatie en zuiverheid van BEV’s, waardoor een uitgebreide, objectieve en realistische analyse van BEV’s wordt belemmerd. Vandaar dat effectieve strategieën om interferentie door verontreinigende componenten te minimaliseren en de opbrengst van BEV’s te verbeteren, naar voren zijn gekomen als kritieke problemen die onmiddellijke aandacht verdienen.

Bestaande isolatiestrategieën zijn grotendeels gebaseerd op technieken zoals ultrasnelle centrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)12,13,14,15,16,17. Momenteel is DGC een van de meest toegepaste methoden op het gebied van BEV-scheiding, die twee sedimentatie-zwevende modi omvat, “Top-down” en “Bottom-up”, die worden bepaald door de initiële laadpositie van het monster. Deze methodologieën onderscheiden extracellulaire vesikels (EV’s) van andere componenten op basis van verschillen in grootte en dichtheid, wat variabele zuiverheid en terugwinningspercentages oplevert. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat enkelvoudige benaderingsstrategieën onvoldoende zijn om EV’s adequaat te scheiden van oplosbare eiwitten in lichaamsvloeistofmonsters, zoals lipoproteïne in bloed¹⁸ en Tamm-Horsfall-eiwit in urine¹⁹. Bovendien overlapt de grootteverdeling van eukaryote extracellulaire vesikels (EEV’s) vaak met die van BEV’s, waardoor verdere methodologische verbeteringen nodig zijn om de BEV-opbrengst te optimaliseren. Bijgevolg hangt het bevorderen van de studie van BEV’s af van de ontwikkeling van effectieve scheidings- en zuiveringsmethoden. Met name Tulkens et al 15 gebruikten een orthogonale biofysische strategie om fecale BEV’s te scheiden van EEV’s, waarbij de centrifugatietijd van een bottom-up DGC-modus maximaal¹⁸ uur was. Deze studie daarentegen heeft het teruggebracht tot 7 uur, waardoor de gradiënt-ultracentrifugatietijd aanzienlijk werd bespaard en het proces werd vereenvoudigd.

In de huidige studie hebben we fecale BEV’s geïsoleerd en gezuiverd met behulp van twee DGC-modi onder geoptimaliseerde bufferomstandigheden, na BEV’s te hebben verrijkt met een reeks differentiële centrifugatiesnelheden, van lage tot extreem hoge snelheid. Evaluaties op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie wezen op een lovenswaardige prestatie van deze verbeterde methode. Deze studie zou als basis kunnen dienen voor toekomstig onderzoek, waarbij de toepassingen ervan worden uitgebreid naar een breder domein en inzicht wordt geboden in de heterogeniteit van BEV’s binnen het menselijk lichaam. Het draagt ook bij aan de standaardisatie van BEV-scheidings- en analysetechnieken.

Protocol

De ethische commissie van het Nanfang Hospital, Southern Medical University, keurde deze studie goed, die werd uitgevoerd met de geïnformeerde toestemming van de deelnemers. Alle methoden die hierin worden gebruikt, voldoen aan de standaard operationele richtlijnen van de International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle daaropvolgende procedures voor vloeistofbehandeling moesten verplicht worden uitgevoerd binnen een bioveiligheidskast of een ultraschone bank. <p class="jov…

Representative Results

Bepaal de verdeling van BEV-verrijkte fractiesOm de verdeling van met bacteriële extracellulaire vesikels (BEV’s) verrijkte fracties te bepalen, werd een blancocontrole ingesteld om de absorptiewaarden bij OD 340 nm te meten, en de dichtheid van elke fractie werd berekend op basis van de metingen en jodixanolrichtlijnen (stap 8.1). Tabel 2 geeft de dichtheidsresultaten weer, waaruit blijkt dat de fracties F4 tot en met F9 dichtheden vertoonden binnen het bereik dat doorgaans wordt g…

Discussion

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV’s) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden en een schat aan eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere bioactieve moleculen bevatten, die bijdragen aan het mediëren van de functionele effecten van bacteriën²⁰. Van BEV’s afkomstig van de darm is geverifieerd dat ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, zoals inflammatoire darmaandoeningen, de ziekte van Crohn en colorectale kanker, en ook het algemene meta…

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4