Isolering og rensing av bakterielle ekstracellulære vesikler fra humane avføring ved bruk av tetthetsgradient sentrifugering

Summary

Denne studien beskriver en metode for å isolere og rense bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) beriket fra menneskelig avføring via tetthetsgradientsentrifugering (DGC), identifiserer de fysiske egenskapene til BEVs fra morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon, og diskuterer potensielle anvendelser av DGC-tilnærmingen i klinisk og vitenskapelig forskning.

Abstract

Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er nanovesikler avledet fra bakterier som spiller en aktiv rolle i bakterier-bakterier og bakterier-vertkommunikasjon, og overfører bioaktive molekyler som proteiner, lipider og nukleinsyrer arvet fra foreldrebakteriene. BEVs avledet fra tarmmikrobiota har effekter i mage-tarmkanalen og kan nå fjerne organer, noe som resulterer i betydelige implikasjoner for fysiologi og patologi. Teoretiske undersøkelser som undersøker typer, mengder og roller av BEVs avledet fra menneskelig avføring er avgjørende for å forstå sekresjon og funksjon av BEVs fra tarmmikrobiota. Disse undersøkelsene krever også en forbedring i dagens strategi for å isolere og rense BEVs.

Denne studien optimaliserte isolasjons- og renseprosessen til BEVs ved å etablere to tetthetsgradientsentrifugeringsmoduser (DGC): Top-down og Bottom-up. Den berikede fordelingen av BEVs ble bestemt i fraksjonene 6 til 8 (F6-F8). Effektiviteten av tilnærmingen ble evaluert basert på partikkelmorfologi, størrelse, konsentrasjon og proteininnhold. Partikkel- og proteinutvinningshastighetene ble beregnet, og tilstedeværelsen av spesifikke markører ble analysert for å sammenligne utvinning og renhet av de to DGC-modusene. Resultatene indikerte at Top-down sentrifugeringsmodus hadde lavere forurensningsnivåer og oppnådde en gjenvinningsgrad og renhet som ligner på Bottom-up-modus. En sentrifugeringstid på 7 timer var tilstrekkelig til å oppnå en fekal BEV-konsentrasjon på 10⁸/mg.

Bortsett fra avføring, kan denne metoden brukes på andre kroppsvæsketyper med riktig modifikasjon i henhold til forskjellene i komponenter og viskositet. Avslutningsvis vil denne detaljerte og pålitelige protokollen lette standardisert isolasjon og rensing av BEVs og dermed legge grunnlaget for påfølgende multi-omics analyse og funksjonelle eksperimenter.

Introduction

Tarmen er allment anerkjent som organet som har de rikeste mikrobielle samfunnene i menneskekroppen, med over 90% av bakteriene involvert i kolonisering og multiplikasjon ^1,2. Omfattende bevis har vist at tarmmikrobiota modulerer tarmmikromiljøet og samtidig interagerer med dysfunksjon i fjerne organer, primært gjennom en nedsatt tarmbarriere ^3,4. Monteringsbevis indikerer en sammenheng mellom ubalansen i tarmmikrobiota og utviklingen av inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 5,6, samt kognitive forstyrrelser gjennom tarm-hjerneaksen ^5,6,7,8. Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) produsert av bakterier spiller viktige roller i disse patologiske prosessene.

BEVs er nanoskala partikler innkapsling bakterielle derivater, med diametre fra 20 til 400 nm. De har vist seg å lette interaksjoner mellom bakterier og deres vertsorganismer ^9,10. Til tross for deres usynlighet har disse partiklene fått økende oppmerksomhet fra forskere på grunn av deres potensielle brede applikasjoner som diagnostiske biomarkører, terapeutiske mål og legemiddelleveringsbiler¹¹. Menneskelig avføring, ofte brukt som biospecimens for å studere BEVs, hovedsakelig hentet fra tarmbakterier, inneholder en kompleks blanding av vann, bakterier, lipider, proteiner, ufordøyd matrester og eksfolierte epitelceller blant andre. Den intrikate fekale sammensetningen utgjør utfordringer for isolasjon og renhet av BEVs, og dermed hindre en omfattende, objektiv og realistisk analyse av BEVs. Derfor har effektive strategier for å minimere forstyrrelser fra forurensende komponenter og øke utbyttet av BEVs dukket opp som kritiske problemer som garanterer umiddelbar oppmerksomhet.

Eksisterende isolasjonsstrategier er i stor grad avhengige av teknikker som ultra-høyhastighets sentrifugering (UC), tetthetsgradientsentrifugering (DGC) og størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) 12,13,14,15,16,17. For tiden er DGC en av de mest anvendte metodene innen BEV-separasjon, som omfatter to sedimenteringsflytende moduser, “Top-down” og “Bottom-up”, som bestemmes av prøvens opprinnelige lastposisjon. Disse metodene skiller ekstracellulære vesikler (EV) fra andre komponenter basert på størrelses- og tetthetsforskjeller, noe som gir variabel renhet og gjenvinningshastighet. Tidligere forskning har indikert at enkelttilnærmingsstrategier er utilstrekkelige for tilstrekkelig å skille EV fra løselige proteiner i kroppsvæskeprøver, som lipoprotein i blod¹⁸ og Tamm-Horsfall-protein i urin¹⁹. I tillegg overlapper størrelsesfordelingen av eukaryote ekstracellulære vesikler (EEVs) ofte med BEVs, og nødvendiggjør dermed ytterligere metodologiske forbedringer for å optimalisere BEV-utbyttet. Følgelig, fremme studiet av BEVs hengsler på utvikling av effektive separasjon og rensing metoder. Spesielt benyttet Tulkens et al 15 en ortogonal biofysisk strategi for å skille fekale BEVs fra EEVs, hvor sentrifugeringstiden for en Bottom-up DGC-modus var opptil¹⁸ timer. I kontrast reduserte denne studien den til 7 timer, noe som sparte gradient-ultracentrifugeringstiden og forenklet prosessen.

I denne studien isolerte og renset vi fekale BEVs ved å bruke to DGC-moduser under optimaliserte bufferforhold, etter å ha beriket BEVs med en rekke differensielle sentrifugeringshastigheter, fra lav til ekstremt høy hastighet. Evalueringer basert på morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon indikerte en prisverdig ytelse ved denne forbedrede metoden. Denne studien kan tjene som grunnlag for fremtidig forskning, utvide sine applikasjoner til et bredere domene, og gir innsikt i heterogeniteten av BEVs i menneskekroppen. Det bidrar også til standardisering av BEV separasjon og analyse teknikker.

Protocol

Den etiske komiteen ved Nanfang Hospital, Southern Medical University, sanksjonerte denne studien, som ble utført med informert samtykke fra deltakerne. Alle metodene som ble brukt her fulgte standard driftsretningslinjer gitt av International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle påfølgende væskehåndteringsprosedyrer ble pålagt å bli utført i et biosikkerhetsskap eller en ultraren benk. 1. Innsamling og aliquoting av fekale prøver</strong…

Representative Results

Bestemme fordelingen av BEV-berikede fraksjonerFor å bestemme fordelingen av bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs)-berikede fraksjoner, ble det etablert en blank kontroll for å måle absorbansverdiene ved OD 340 nm, og tettheten av hver fraksjon ble beregnet basert på målingene og iodixanolretningslinjene (trinn 8.1). Tabell 2 presenterer tetthetsresultatene, og viser at fraksjonene F4 til F9 viste tettheter innenfor området som vanligvis er forbundet med ekstracellulære…

Discussion

Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er lipid-bilayer nanopartikler utskilt av bakterier, som bærer et vell av proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre bioaktive molekyler, noe som bidrar til å formidle de funksjonelle effektene av bakterier²⁰. BEVs avledet fra tarmen har blitt bekreftet å være involvert i utviklingen av sykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og kolorektal kreft, og påvirker også generell metabolisme og medierer nedsatt kognitiv funksjon 4,16,17,20,…

Materials

1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	Transfer the solution
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6
5 × loading buffer	Fdbio science	FD006	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Surface disinfection
96-well plate	Rar	A8096	Measure the absorbance values
Anti-Calnexin antibody	Abcam	ab92573	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD63 antibody	Abcam	ab134045	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-CD9 antibody	Abcam	ab236630	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Flagellin antibody	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Integrin beta 1 antibody	Abcam	ab30394	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LPS antibody	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-LTA antibody	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-OmpA antibody	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-Syntenin antibody	Abcam	ab133267	Western blotting (Primary Antibody)
Anti-TSG101 antibody	Abcam	ab125011	Western blotting (Primary Antibody)
Autoclave	ZEALWAY	GR110DP	Sterilization for supplies and mediums used in the experiment
Balance	Mettler Toledo	AL104	Balance the tube sample-loaded with PBS
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1
Biosafety cabinet	Haier	HR1200- II B2	Peform the procedures about feces sample handling
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Preprocess for BEVs (Step 3)
Chemiluminescence Apparatus	BIO-OI	OI600SE-MF	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values
Dil-labled low density lipoprotein	ACMEC	AC12038	Definition of distribution of interfering components
Electrophoresis equipment	Bio-rad	1658033	Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Preprocess for BEVs (Step 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4
Filter paper	Biosharp	BS-TFP-070B	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution)
Formvar/Carbon supported copper grids	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3
HEPES powder	Meilunbio	MB6078	Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secondary Antibody)
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Fdbio science	FDR007	Western blotting (Secondary Antibody)
Incubator shaker	Qiangwen	DHZ-L	Cultivate Escherichia coli
Kimwipes™ Delicate Task Wipes	Kimtech Science	34155	Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15
LB broth	Hopebio	HB0128	Cultivate Escherichia coli
Low temperature freezer (-80 °C)	Haier	DW-86L338J	Store the samples
Methanol	Alalddin	M116118	Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5
Micro tubes 1.5 mL	KIRGEN	KG2211	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 2 mL	KIRGEN	KG2911	Recover fractions after density gradient centrifugation
Micro tubes 5 mL	BBI	F610888-0001	Recover fractions after density gradient centrifugation
Microplate reader	Thermo Fisher	Multiskan MK3	Measure protein content of BEVs at Step 8.2
Millipore filter 0.22 μm	Merck millipore	SLGP033RB	Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES
NaCl	GHTECH	1.01307.040	Density gradient centrifugation solution
NaOH	GHTECH	1.01394.068	Density gradient centrifugation solution (pH adjustment)
Optima™ XPN-100	Beckman Coulter	A94469	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
OptiPrep™	Serumwerk Bernburg AG	1893	Density gradient centrifugation stock solution
Orbital Shaker	Youning	CS-100	Dissolve feces at Step 2
Phosphate buffered saline	Procell	PB180327	Dissolve feces at Step 2
Pipettor	Eppendorf	3120000267, 3120000259	Transfer the solution
Plastic pasteur pipette	ABCbio	ABC217003-4	Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes	Millipore	ISEQ00010, IPVH00010	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells	ACE	F15420Gel	Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3
Primary antibody diluent	Fdbio science	FD0040	Used in western blotting at Step 8.5.8
Protein ladder	Fdbio science	FD0672	Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5
Rapid protein blotting solution	UBIO	UW0500	Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor	Beckman Coulter	369650	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Syringe 20 mL, 50 mL	Jetway	ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL	Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing
TBS powder	Fdbio science	FD1021	Used in western blotting at Step 8.5
Transmission electron microscope (TEM)	Hitachi	H-7650	Morphological observation for BEVs at Step 8.3
Tween-20	Fdbio science	FD0020	Used in western blotting at Step 8.5
Ultracentrifuge tube	Beckman	326823, 355642	Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7
Ultra-clean bench	AIRTECH	SW-CJ-2FD	Peform the procedures about liquid handling
Water bath	Bluepard	CU600	Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5
ZetaView	Particle Metrix	S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7)	Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4