Denne studien beskriver en metode for å isolere og rense bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) beriket fra menneskelig avføring via tetthetsgradientsentrifugering (DGC), identifiserer de fysiske egenskapene til BEVs fra morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon, og diskuterer potensielle anvendelser av DGC-tilnærmingen i klinisk og vitenskapelig forskning.
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er nanovesikler avledet fra bakterier som spiller en aktiv rolle i bakterier-bakterier og bakterier-vertkommunikasjon, og overfører bioaktive molekyler som proteiner, lipider og nukleinsyrer arvet fra foreldrebakteriene. BEVs avledet fra tarmmikrobiota har effekter i mage-tarmkanalen og kan nå fjerne organer, noe som resulterer i betydelige implikasjoner for fysiologi og patologi. Teoretiske undersøkelser som undersøker typer, mengder og roller av BEVs avledet fra menneskelig avføring er avgjørende for å forstå sekresjon og funksjon av BEVs fra tarmmikrobiota. Disse undersøkelsene krever også en forbedring i dagens strategi for å isolere og rense BEVs.
Denne studien optimaliserte isolasjons- og renseprosessen til BEVs ved å etablere to tetthetsgradientsentrifugeringsmoduser (DGC): Top-down og Bottom-up. Den berikede fordelingen av BEVs ble bestemt i fraksjonene 6 til 8 (F6-F8). Effektiviteten av tilnærmingen ble evaluert basert på partikkelmorfologi, størrelse, konsentrasjon og proteininnhold. Partikkel- og proteinutvinningshastighetene ble beregnet, og tilstedeværelsen av spesifikke markører ble analysert for å sammenligne utvinning og renhet av de to DGC-modusene. Resultatene indikerte at Top-down sentrifugeringsmodus hadde lavere forurensningsnivåer og oppnådde en gjenvinningsgrad og renhet som ligner på Bottom-up-modus. En sentrifugeringstid på 7 timer var tilstrekkelig til å oppnå en fekal BEV-konsentrasjon på 108/mg.
Bortsett fra avføring, kan denne metoden brukes på andre kroppsvæsketyper med riktig modifikasjon i henhold til forskjellene i komponenter og viskositet. Avslutningsvis vil denne detaljerte og pålitelige protokollen lette standardisert isolasjon og rensing av BEVs og dermed legge grunnlaget for påfølgende multi-omics analyse og funksjonelle eksperimenter.
Tarmen er allment anerkjent som organet som har de rikeste mikrobielle samfunnene i menneskekroppen, med over 90% av bakteriene involvert i kolonisering og multiplikasjon 1,2. Omfattende bevis har vist at tarmmikrobiota modulerer tarmmikromiljøet og samtidig interagerer med dysfunksjon i fjerne organer, primært gjennom en nedsatt tarmbarriere 3,4. Monteringsbevis indikerer en sammenheng mellom ubalansen i tarmmikrobiota og utviklingen av inflammatorisk tarmsykdom (IBD) 5,6, samt kognitive forstyrrelser gjennom tarm-hjerneaksen 5,6,7,8. Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) produsert av bakterier spiller viktige roller i disse patologiske prosessene.
BEVs er nanoskala partikler innkapsling bakterielle derivater, med diametre fra 20 til 400 nm. De har vist seg å lette interaksjoner mellom bakterier og deres vertsorganismer 9,10. Til tross for deres usynlighet har disse partiklene fått økende oppmerksomhet fra forskere på grunn av deres potensielle brede applikasjoner som diagnostiske biomarkører, terapeutiske mål og legemiddelleveringsbiler11. Menneskelig avføring, ofte brukt som biospecimens for å studere BEVs, hovedsakelig hentet fra tarmbakterier, inneholder en kompleks blanding av vann, bakterier, lipider, proteiner, ufordøyd matrester og eksfolierte epitelceller blant andre. Den intrikate fekale sammensetningen utgjør utfordringer for isolasjon og renhet av BEVs, og dermed hindre en omfattende, objektiv og realistisk analyse av BEVs. Derfor har effektive strategier for å minimere forstyrrelser fra forurensende komponenter og øke utbyttet av BEVs dukket opp som kritiske problemer som garanterer umiddelbar oppmerksomhet.
Eksisterende isolasjonsstrategier er i stor grad avhengige av teknikker som ultra-høyhastighets sentrifugering (UC), tetthetsgradientsentrifugering (DGC) og størrelsesekskluderingskromatografi (SEC) 12,13,14,15,16,17. For tiden er DGC en av de mest anvendte metodene innen BEV-separasjon, som omfatter to sedimenteringsflytende moduser, “Top-down” og “Bottom-up”, som bestemmes av prøvens opprinnelige lastposisjon. Disse metodene skiller ekstracellulære vesikler (EV) fra andre komponenter basert på størrelses- og tetthetsforskjeller, noe som gir variabel renhet og gjenvinningshastighet. Tidligere forskning har indikert at enkelttilnærmingsstrategier er utilstrekkelige for tilstrekkelig å skille EV fra løselige proteiner i kroppsvæskeprøver, som lipoprotein i blod18 og Tamm-Horsfall-protein i urin19. I tillegg overlapper størrelsesfordelingen av eukaryote ekstracellulære vesikler (EEVs) ofte med BEVs, og nødvendiggjør dermed ytterligere metodologiske forbedringer for å optimalisere BEV-utbyttet. Følgelig, fremme studiet av BEVs hengsler på utvikling av effektive separasjon og rensing metoder. Spesielt benyttet Tulkens et al 15 en ortogonal biofysisk strategi for å skille fekale BEVs fra EEVs, hvor sentrifugeringstiden for en Bottom-up DGC-modus var opptil18 timer. I kontrast reduserte denne studien den til 7 timer, noe som sparte gradient-ultracentrifugeringstiden og forenklet prosessen.
I denne studien isolerte og renset vi fekale BEVs ved å bruke to DGC-moduser under optimaliserte bufferforhold, etter å ha beriket BEVs med en rekke differensielle sentrifugeringshastigheter, fra lav til ekstremt høy hastighet. Evalueringer basert på morfologi, partikkelstørrelse og konsentrasjon indikerte en prisverdig ytelse ved denne forbedrede metoden. Denne studien kan tjene som grunnlag for fremtidig forskning, utvide sine applikasjoner til et bredere domene, og gir innsikt i heterogeniteten av BEVs i menneskekroppen. Det bidrar også til standardisering av BEV separasjon og analyse teknikker.
Bakterielle ekstracellulære vesikler (BEVs) er lipid-bilayer nanopartikler utskilt av bakterier, som bærer et vell av proteiner, lipider, nukleinsyrer og andre bioaktive molekyler, noe som bidrar til å formidle de funksjonelle effektene av bakterier20. BEVs avledet fra tarmen har blitt bekreftet å være involvert i utviklingen av sykdommer, som inflammatorisk tarmsykdom, Crohns sykdom og kolorektal kreft, og påvirker også generell metabolisme og medierer nedsatt kognitiv funksjon 4,16,17,20,…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); Key-prosjektet til National Natural Science Foundation of China (82230080); Kinas nasjonale nøkkelforsknings- og utviklingsprogram (2021YFA1300604); National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 og 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); Natural Science Foundation i Guangdong-provinsen (2021A1515011639); Major State Basic Research Development Program of Natural Science Foundation of Shandong-provinsen i Kina (ZR2020ZD11); Stiftelsen Postdoktor Science (2022M720059); den fremragende ungdomsutviklingsordningen til Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water) | ACMEC | AP1126 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.3 |
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water) | Sigma-Aldrich | M7027 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.6 |
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water) | Polysciences | 21447-25 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3.5 |
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette | KIRGEN | KG1313, KG1212, KG1011 | Transfer the solution |
5 % (w/v) bovine serum albumin solution (prepared from the original powder in TBST buffer) | Fdbio science | FD0030 | Used in western blotting for blocking at Step 8.5.6 |
5 × loading buffer | Fdbio science | FD006 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5.1 |
75 % (v/v) alcohol | LIRCON | LIRCON-500 mL | Surface disinfection |
96-well plate | Rar | A8096 | Measure the absorbance values |
Anti-Calnexin antibody | Abcam | ab92573 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD63 antibody | Abcam | ab134045 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-CD9 antibody | Abcam | ab236630 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Flagellin antibody | Sino Biological | 40067-MM06 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Integrin beta 1 antibody | Abcam | ab30394 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LPS antibody | Thermo Fisher | MA1-83152 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-LTA antibody | Thermo Fisher | MA1-7402 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-OmpA antibody | CUSABIO | CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/ | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-Syntenin antibody | Abcam | ab133267 | Western blotting (Primary Antibody) |
Anti-TSG101 antibody | Abcam | ab125011 | Western blotting (Primary Antibody) |
Autoclave | ZEALWAY | GR110DP | Sterilization for supplies and mediums used in the experiment |
Balance | Mettler Toledo | AL104 | Balance the tube sample-loaded with PBS |
Bicinchoninic acid assay | Fdbio science | FD2001 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
BioRender | BioRender | https://app.biorender.com | Make the schematic workflow of BEVs isolation and purification showed in Figure 1 |
Biosafety cabinet | Haier | HR1200- II B2 | Peform the procedures about feces sample handling |
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38 | Eppendorf | 5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Chemiluminescence Apparatus | BIO-OI | OI600SE-MF | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Cytation 5 | BioTek | F01 | Microplate detector for measuring the absorbance (Step 8.1) and fluorescence (Figure 6) values |
Dil-labled low density lipoprotein | ACMEC | AC12038 | Definition of distribution of interfering components |
Electrophoresis equipment | Bio-rad | 1658033 | Used in western blotting for protein separation and transfer at Step 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5 |
Enhanced Chemiluminescence kit HRP | Fdbio science | FD8020 | Used in western blotting for signal detection at Step 8.5.12 |
Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC8739 | Isolate BEVs as a positive control. Protocol: Dissolve 25 g of the LB powder in 1 L deionized water, and autoclave. Transfer the 800 μL of preserved Escherichia coli into the medium. Cultivate at 37 °C in the incubator shaker. Then centrifuge at 3, 000 × g for 20 min at 4 °C, 12, 000 × g for 30 min at 4 °C, filter the supernatant through 0.22 μm membrane, and perform ultra-speed centrifugation at 160, 000 × g for 70 min at 4 °C. Pellet defined as crude BEVs from Escherichia coli was suspended in 1.2 mL PBS (Step 3, 4). |
Falcon tubes 50 mL | KIRGEN | KG2811 | Preprocess for BEVs (Step 3) |
Feto Protein Staining Buffer | Absci | ab.001.50 | Coomassie brilliant blue staining at Step 8.5.4 |
Filter paper | Biosharp | BS-TFP-070B | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 (Blotting the solution) |
Formvar/Carbon supported copper grids | Sigma-Aldrich | TEM-FCF200CU50 | Morphological observation for BEVs using TEM at Step 8.3 |
HEPES powder | Meilunbio | MB6078 | Prepare iodixanol buffers with different concentrations for density gradient centrifugation |
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Fdbio science | FDM007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
HRP AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Fdbio science | FDR007 | Western blotting (Secondary Antibody) |
Incubator shaker | Qiangwen | DHZ-L | Cultivate Escherichia coli |
Kimwipes™ Delicate Task Wipes | Kimtech Science | 34155 | Wipe the inner wall of the ultracentrifuge tube at Step 4.15 |
LB broth | Hopebio | HB0128 | Cultivate Escherichia coli |
Low temperature freezer (-80 °C) | Haier | DW-86L338J | Store the samples |
Methanol | Alalddin | M116118 | Used in western blotting for activating PVDF membrane at Step 8.5.5 |
Micro tubes 1.5 mL | KIRGEN | KG2211 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 2 mL | KIRGEN | KG2911 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Micro tubes 5 mL | BBI | F610888-0001 | Recover fractions after density gradient centrifugation |
Microplate reader | Thermo Fisher | Multiskan MK3 | Measure protein content of BEVs at Step 8.2 |
Millipore filter 0.22 μm | Merck millipore | SLGP033RB | Filtration sterilization; Material: polyethersulfone, PES |
NaCl | GHTECH | 1.01307.040 | Density gradient centrifugation solution |
NaOH | GHTECH | 1.01394.068 | Density gradient centrifugation solution (pH adjustment) |
Optima™ XPN-100 | Beckman Coulter | A94469 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
OptiPrep™ | Serumwerk Bernburg AG | 1893 | Density gradient centrifugation stock solution |
Orbital Shaker | Youning | CS-100 | Dissolve feces at Step 2 |
Phosphate buffered saline | Procell | PB180327 | Dissolve feces at Step 2 |
Pipettor | Eppendorf | 3120000267, 3120000259 | Transfer the solution |
Plastic pasteur pipette | ABCbio | ABC217003-4 | Remove supernatant in preprocessing at Step 3.4 |
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes | Millipore | ISEQ00010, IPVH00010 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Prefabricated polyacrylamide gel, 4–20% 15 Wells | ACE | F15420Gel | Used in western blotting for protein separation at Step 8.5.2, 8.5.3 |
Primary antibody diluent | Fdbio science | FD0040 | Used in western blotting at Step 8.5.8 |
Protein ladder | Fdbio science | FD0672 | Used in western blotting and Coomassie brilliant blue stain at Step 8.5 |
Rapid protein blotting solution | UBIO | UW0500 | Used in western blotting for protein transfer at Step 8.5.5 |
Rotor SW 32 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 369650 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Syringe 20 mL, 50 mL | Jetway | ZSQ-20ML, YCXWJZSQ-50 mL | Transfer buffers amd remove supernatant in preprocessing |
TBS powder | Fdbio science | FD1021 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Transmission electron microscope (TEM) | Hitachi | H-7650 | Morphological observation for BEVs at Step 8.3 |
Tween-20 | Fdbio science | FD0020 | Used in western blotting at Step 8.5 |
Ultracentrifuge tube | Beckman | 326823, 355642 | Ultracentrifugation for BEVs isolation at Step 4, 7 |
Ultra-clean bench | AIRTECH | SW-CJ-2FD | Peform the procedures about liquid handling |
Water bath | Bluepard | CU600 | Used for measuring protein content of BEVs at Step 8.2.5 |
ZetaView | Particle Metrix | S/N 21-734, Software ZetaView (version 8.05.14 SP7) | Nanoparticle tracking analysis (NTA) for measuring the particle size and concentrarion of BEVs at Step 8.4 |