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Developmental Biology

प्रारंभिक अनगाइडेड मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड न्यूरोवास्कुलर आला मॉडलिंग अनुमेय चिक भ्रूण Chorioallantoic झिल्ली में मॉडलिंग

Published: February 16, 2024 doi: 10.3791/65710
Automatic Translation
1,2, 3, 3,4, 3,4, 3,5, 5,6,7,8, 2,9, 9, 2,9, 1,2, 1,2, 3,4
1Instituto de Biología Celular y Neurociencias “Prof. E. De Robertis” (IBCN), CONICET - Universidad de Buenos Aires, 2Facultad de Medicina, Departamento de Biología Celular, Histología, Embriología y Genética, Universidad de Buenos Aires, 3Institute of Neurosciences, Pathology and Experimental Therapeutics Dept, University of Barcelona, 4Functional Neurogenomics Group, Neurodevelopmental Disorders, IDIBELL, L’Hospitalet de Llobregat, 5IBE, Institute of Evolutionary Biology (UPF-CSIC), Department of Medicine and Life Sciences, Universitat Pompeu Fabra, 6Institució Catalana de Recerca i Estudis Avançats (ICREA) and Universitat Pompeu Fabra, 7Center for Genomic Regulation (CRG), The Barcelona Institute of Science and Technology, 8BarcelonaBeta Brain Research Center, Pasqual Maragall Foundation, 9Instituto de Investigación en Biomedicina (IBioBA) – CONICET – Instituto Partner de la Sociedad Max Planck

Summary

यहां, हम मानव मस्तिष्क के अंगों को कई परिपक्वता चरणों में चिक कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) में संलग्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। मस्तिष्क के ऑर्गेनोइड को अनियंत्रित मानकीकृत प्रोटोकॉल के बाद उगाया गया था।

Abstract

मॉडल जानवरों में संवहनी ऊतकों में ऑर्गेनोइड को उकेरना, जैसे कि इम्यूनोडेफिशिएंसी माउस या चिक भ्रूण कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम), नवसंवहनीकरण मॉडलिंग के लिए कुशल साबित हुआ है। सीएएम एक समृद्ध संवहनी extraembryonic झिल्ली है, जो सीमित immunoreactivity से पता चलता है, इस प्रकार मानव मूल सेल प्रत्यारोपण के लिए एक उत्कृष्ट होस्टिंग मॉडल बन गया है.

यह पत्र सीएएम में कई परिपक्वता चरणों में विभेदित मानव मस्तिष्क के अंगों को उकेरने की रणनीति का वर्णन करता है। मस्तिष्क के अंगों की सेलुलर संरचना समय के साथ बदलती है, जो मानव मस्तिष्क के विकास के मील के पत्थर को दर्शाती है। हमने प्रासंगिक परिपक्वता चरणों में मस्तिष्क के अंगों को ग्राफ्ट किया: भ्रूण दिवस (ई) 7 चिकन भ्रूण के सीएएम में न्यूरोपीथेलियल विस्तार (18 डीआईवी), प्रारंभिक न्यूरोजेनेसिस (60 डीआईवी), और प्रारंभिक ग्लियोजेनेसिस (180 डीआईवी)। उत्कीर्ण मस्तिष्क ऑर्गेनोइड को 5 दिन बाद काटा गया और उनकी ऊतकीय विशेषताओं का विश्लेषण किया गया।

ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड या ग्राफ्टिंग से सटे असामान्य रक्त वाहिकाओं में नवसंवहनीकरण के कोई हिस्टोलॉजिकल संकेत नहीं पाए गए। इसके अलावा, ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड की सेलुलर संरचना में उल्लेखनीय परिवर्तन देखे गए, अर्थात्, ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन-पॉजिटिव-रिएक्टिव एस्ट्रोसाइट्स की संख्या में वृद्धि। हालांकि, साइटोआर्किटेक्चरल परिवर्तन ऑर्गेनॉइड परिपक्वता चरण पर निर्भर थे। कुल मिलाकर, इन परिणामों से पता चलता है कि मस्तिष्क के अंग सीएएम में बढ़ सकते हैं, और वे ग्राफ्टिंग में उनकी परिपक्वता अवस्था के आधार पर साइटोआर्किटेक्चर में अंतर दिखाते हैं।

Introduction

मानव मस्तिष्क organoids एक उभरती हुई तकनीक है कि हमें इन विट्रो 1,2,3 में मानव मस्तिष्क के प्रारंभिक विकास पुनरावृत्ति करने के लिए अनुमति देता है. फिर भी, इस मॉडल की प्रमुख सीमाओं में से एक संवहनी की कमी है, जो न केवल मस्तिष्क होमियोस्टेसिस में बल्कि मस्तिष्क के विकास में भी अपरिहार्य भूमिका निभाताहै। ऑक्सीजन और पोषक तत्वों के वितरण के अलावा, सबूत जमा करने से पता चलता है कि मस्तिष्क की संवहनी प्रणाली 5,6 के विकास के दौरान तंत्रिका भेदभाव, प्रवासन और सिनैप्टोजेनेसिस को नियंत्रित करती है। इसलिए, विश्वसनीय मॉडल स्थापित करने की तत्काल आवश्यकता है जो मस्तिष्क के अंगों को लापता संवहनी संकेत और संरचना प्रदान कर सकते हैं, जिससे मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड पीढ़ी7 की जटिलता बढ़ जाती है।

संवहनी के लिए प्रस्तावित तरीकों के बीच, दो मुख्य streamlines पर विचार किया जा सकता है: organoid एक जीवित जीव में engrafting और विशुद्ध रूप से इन विट्रो प्रौद्योगिकियों सह संवर्धन endothelial कोशिकाओं और तंत्रिका कोशिकाओं 8,9,10,11,12. चूहों में इंट्रासेरेब्रल प्रत्यारोपण महंगा और समय लेने वाला है, जिससे अन्य प्रौद्योगिकियां सरल मॉडल के लिए प्रासंगिक हो जाती हैं। चिक कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) परख का उपयोग एंजियोजेनेसिस 13,14,15का अध्ययन करने के लिए बड़े पैमाने पर किया गया है। पिछले दशक में, कई समूहों सफलतापूर्वक सीएएम में गुर्दे16,17, हृदय18, और ट्यूमर organoids19,20 सहित organoids के विभिन्न प्रकार उत्कीर्ण किया है. फिर भी, प्रभावकारिता, विषाक्तता / अस्वीकृति, शारीरिक प्रभाव और सीएएम में मानव मस्तिष्क के अंगों को उकेरने के तरीकों के बारे में बहुत कम जानकारी है। एक और दिलचस्प और अभी तक बेरोज़गार पहलू सीएएम और ऑर्गेनॉइड एस्ट्रोसाइटिक इंटरफ़ेस के बीच एक काइमेरिक रक्त-मस्तिष्क बाधा (बीबीबी) का गठन है। पिछले अग्रणी काम astrocytes और astrocyte-वातानुकूलित माध्यम 21,22,23प्रत्यारोपण द्वारा सीएएम में एक बीबीबी उत्पन्न करने की ख्यात व्यवहार्यता का सुझाव दिया. हालांकि, परिपक्व एस्ट्रोसाइट्स इस24,25 को प्राप्त करने में असमर्थ प्रतीत होते हैं। इस प्रकार, बीबीबी का एस्ट्रोसाइट-प्रेरित गठन बहस योग्य बना हुआ है, और मानव मस्तिष्क के अंगों को प्रत्यारोपित करने से हमें इस विवाद पर प्रकाश डालने की अनुमति मिलेगी।

यह वीडियो लेख सीएएम में ओवो मानव मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो विकास, सुधार और संवहनी को बढ़ावा देता है, जिसके परिणामस्वरूप ऑर्गेनोइड होते हैं जो हिस्टोलॉजिकल रूप से संगत बीबीबी तत्वों को शामिल करते हैं। यहां, हम चिकन भ्रूण के अस्तित्व को सुनिश्चित करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं और मस्तिष्क के अंग विकास को बनाए रखने के लिए सीएएम की अनुमति पर रिपोर्ट करते हैं।

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Protocol

व्हाइट लेगॉर्न चिकन (गैलस गैलस) भ्रूण का इलाज प्रयोगशाला पशु संसाधन संस्थान, जीवन विज्ञान आयोग, राष्ट्रीय अनुसंधान परिषद, संयुक्त राज्य अमेरिका से प्रयोगशाला जानवरों की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड का पालन करके किया गया था, और प्रयोगों को बार्सिलोना विश्वविद्यालय से प्रायोगिक जानवरों की देखभाल और उपयोग परिषद द्वारा अनुमोदित किया गया था।

1. गैर-निर्देशित मस्तिष्क अंग तैयारी

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में डीएमईएम (1:40) में भंग मैट्रिगेल के साथ लेपित 6-अच्छी प्लेटों में 70% के संगम के तहत कमरे के तापमान (आरटी) पर प्रीवार्म किए गए एमटीईएसआर 1 में एच9 मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) बनाए रखें।
    नोट: मैट्रिगेल को बर्फ में तब तक रखा जाना चाहिए जब तक कि इसके पोलीमराइजेशन को रोकने के लिए कोटिंग के रूप में इसका उपयोग न हो।
  2. अनियंत्रित मस्तिष्क प्रोटोकॉल 2 के बाद मस्तिष्क organoids उत्पन्न.
    1. सेल पृथक्करण समाधान के 500 माइक्रोन का उपयोग करके एच 9 एचईएससी को अलग करें और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। एमटीईएसआर 1 में पुन: निलंबित करें जिसमें एक रॉक अवरोधक Y27632 (अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोन) और बीज 9,000 कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से कम आसंजन प्रीट्रीटेड 96-वेल प्लेट में है।
    2. एक बार जब ऑर्गेनोइड एमटीईएसआर 1 में एक रॉक अवरोधक वाई 27632 (अंतिम एकाग्रता 50 माइक्रोन) युक्त होते हैं, तो उन्हें 5-6 दिनों के लिए प्रेरण माध्यम में स्थानांतरित करें।
    3. अनियंत्रित मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड प्रोटोकॉल26 के बाद, ~ दिनों 4-5 पर तंत्रिका प्रेरण मीडिया में ऑर्गेनोइड को स्थानांतरित करें।
    4. एक बार जब वे आकार और न्यूरोपीथेलियम रिंग प्राप्त कर लेते हैं, तो उन्हें बर्फ-ठंडे मैट्रिगेल ड्रॉप में स्थानांतरित करें। एक बार Matrigel पोलीमराइज़ हो जाने के बाद, ऑर्गेनोइड को 5 सेमी, कम-आसंजन पेट्री डिश में 5 एमएल प्रीवार्म्ड परिपक्वता माध्यम के साथ स्थानांतरित करें।
    5. 4 दिनों के बाद, मस्तिष्क के अंगों को कक्षीय आंदोलन के तहत रखें।
  3. ग्राफ्टिंग से तुरंत पहले ताजा डीपीबीएस में कटाई के लिए ऑर्गेनोइड इकट्ठा करें।

2. अंडे के रखरखाव, विकास सक्रियण, और अंडे के छिलके पंचर

  1. उपयोग होने तक 18 डिग्री सेल्सियस पर एक इनक्यूबेटर में निषेचित अंडे (दिन 0 पर) स्टोर करें।
    नोट: इस तापमान पर, वे विकसित नहीं होते हैं, परिपक्वता के समान चरण में शेष रहते हैं।
  2. जब उपयोग के लिए आवश्यक हो, तो उन्हें 45 डिग्री सेल्सियस के कोण पर नरम रॉकिंग रोटेशन के साथ 38 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर इनक्यूबेट करें।
  3. 1 दिन, 70% इथेनॉल के साथ अंडे की सतह को साफ करें और इसे निष्फल करने के लिए एक कागज़ के तौलिये से सुखाएं।
  4. अंडे के ऊपर एक सर्जिकल पेपर चिपकने वाली पट्टी रखें, जिसे इसके बाद "पट्टी" कहा जाता है, अंडे के वायु कक्ष को कवर करें।
    नोट: यह अंडे के छिलके से धूल को सीएएम में गिरने से रोकेगा जहां यह फंस जाता है।
  5. एयर चैंबर वेध पंचर करें, इसके बाद एयर चैंबर होल (ACH) के रूप में संदर्भित, एक बाँझ सुई 21 G x 11/2 '' के साथ, धीरे से अंडे के छिलके को पंचर करना। सीएएम को परेशान करने से बचने के लिए अंडे की ऊपरी नोक पर एसीएच खोलें, जो इस बिंदु पर खोल से अलग हो जाता है।
  6. ACH को पंचर करने के लिए सबसे अच्छी स्थिति खोजने के लिए, अंडे के ऊपरी सिरे पर सबसे पतली अंडे के छिलके की सतह को निर्धारित करने के लिए एक दीपक का उपयोग करें। प्रत्यक्ष प्रकाश किरण संचरण ड्रिल करने के लिए सबसे अच्छी स्थिति इंगित करता है।
  7. बाहरी वातावरण से भ्रूण की रक्षा के लिए एक नई पट्टी के साथ ACH को कवर करें और अंडे को वापस इनक्यूबेटर में रखें।
  8. इस क्षण से, इनक्यूबेटर में रोटेशन बंद करें और अंडे को शीर्ष पर खिड़की के साथ एक ऊर्ध्वाधर स्थिति में बनाए रखें।
    नोट: यह भ्रूण के विकास की सुविधा होगी, और सीएएम भ्रूण और अंडे के छिलके के बीच हवा के एक कक्ष के साथ शीर्ष पर उपलब्ध हो जाता है, बाद में ग्राफ्टिंग के लिए अनुमति देता है।
  9. ACH को दिन 1 से दिन 4 तक खोलें। व्यवहार्यता दिन 4 (ग्राफ्टिंग दिन से 3 दिन पहले) पर बढ़ जाती है।

3. मस्तिष्क अंग ग्राफ्टिंग

  1. दिन 7 पर ग्राफ्टिंग प्रदर्शन जब सीएएम अच्छी तरह से विकसित और संवहनी है, भ्रूण भर में अंडे को कवर.
  2. पट्टी निकालें, और अंडे के छिलके को स्टरलाइज़ करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ अंडे की सतह को पोंछ लें, ध्यान से ACH को ग्राफ्टिंग विंडो में चौड़ा करने से पहले।
  3. ग्राफ्टिंग विंडो को बड़ा करते समय सीएएम में गिरने वाले अंडे के टुकड़ों से बचने के लिए अंतिम ग्राफ्टिंग विंडो से परे विस्तार को कवर करने वाली एक नई, बड़ी पट्टी रखें।
    नोट: सबसे अच्छी ग्राफ्टिंग स्थिति का चयन करने और बाद में ग्राफ्टिंग के लिए इस बड़ी खिड़की की आवश्यकता है।
  4. अंडे के छिलके को धीरे से पंचर करके ग्राफ्टिंग विंडो को बड़ा करें जब तक कि खिड़की लगभग 2 सेमी के व्यास तक न पहुंच जाए। चिमटी के साथ अंडे के छिलके की खिड़की के किनारों को धीरे से हटा दें जब तक कि खिड़की बड़ी न हो जाए। शेष धूल और अंडे के छिलके के टुकड़ों को हटा दें जो पट्टी से धीरे से छीलकर पट्टी से जुड़े रहेंगे।
  5. ऑर्गेनॉइड को P200 ऑटोमैटिक पिपेट के साथ रखें। ऑर्गेनोइड के आकार के अनुसार उद्घाटन को बड़ा करने के लिए बाँझ और तेज कैंची के साथ युक्तियों को काटें और ऑर्गेनोइड को नुकसान को रोकें या वाइड-गेज ट्रांसफरिंग बाँझ युक्तियों का उपयोग करें। पीबीएस के 50 माइक्रोन की अधिकतम मात्रा में ऑर्गेनॉइड को इकट्ठा करें और इसे सीधे सीएएम में स्थानांतरित करें, भ्रूण के स्थान के विपरीत एक तरफ।
  6. सुनिश्चित करें कि कटाई के दौरान इसके टूटने से बचने के लिए ग्राफ्ट की स्थिति जर्दी से दूर है, और अधिमानतः, इसे रक्त वाहिका के पास रखें।
  7. सीएएम पर ऑर्गेनॉइड रखने के बाद ऑर्गेनॉइड के आसपास मैट्रिगेल के 7 माइक्रोन की एक बूंद रखें।
    नोट: यह ऑर्गेनॉइड को झिल्ली के चारों ओर घूमने से रोकेगा।
  8. खिड़की के सटीक आकार को फिट करने वाले पैराफिल्म के एक छोटे टुकड़े का उपयोग करके खिड़की को बंद करें और इसे एक चिपकने वाली पट्टी के साथ खोल से संलग्न करें।
    नोट: गैस विनिमय की अनुमति देते समय भ्रूण को सूखने से बचाने के लिए पैराफिल्म के साथ खिड़की को पूरी तरह से कवर करना महत्वपूर्ण है। खिड़की कवरेज के विस्तार को ठीक से परिसीमन करें, खिड़की से अधिक से बचने के लिए, क्योंकि यह सही भ्रूण विकास27 के लिए आवश्यक गैस विनिमय में बाधा डाल सकता है।

4. प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड कटाई

  1. ग्राफ्टिंग के 5 दिन बाद 38 हैमबर्गर और हैमिल्टन चरण के विकास (HH38)28 के अनुरूप, चिकन विकास के दिन 12 पर ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड और आसपास के सीएएम की कटाई करें। इस स्तर पर, सीएएम पूरी तरह से परिपक्व वाहिका के साथ विभेदित है, जबकि पंख रोगाणु पंखों के साथ-साथ भ्रूण की ऊपरी पलक को कवर करते हैं।
  2. चिपकने वाली पट्टी को हटाने पर, कैंची और ठीक चिमटी का उपयोग करके नमूना फसल की सुविधा के लिए खिड़की को और बड़ा करें।
  3. यदि आवश्यक हो तो दूरबीन विच्छेदन माइक्रोस्कोपी की मदद से ऑर्गेनॉइड की कल्पना करें, इसके बाद ऑर्गेनॉइड और सीएएम कटाई में मदद करने के लिए 4% पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) के साथ 2 मिनट का उपसर्ग कदम उठाया जाए।
  4. ऑर्गेनॉइड युक्त सीएएम के 1.5 सेमी2 खंड को इकट्ठा करें।
  5. नमूना निर्धारण
    1. 1x पीबीएस के साथ नमूने धो लें और उन्हें 4% पीएफए (पीबीएस, पीएच 7.2 में) के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए ठीक करें। फिर, पीबीएस में 3 x 5 मिनट के लिए नमूने धो लें।
    2. सोडियम एज़ाइड के साथ पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने स्टोर करें या सीधे उन्हें 30% सुक्रोज-पीबीएस में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर क्रायोप्रोटेक्ट करें।
    3. क्रायोप्रोटेक्शन पर, नमूनों को इष्टतम काटने के तापमान यौगिक (ओसीटी) में एम्बेड करें और उन्हें सेक्शनिंग तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। क्रायोस्टेट का उपयोग करके 20 माइक्रोन मोटी ऊतक स्लाइस काटें और उन्हें ज़ाइलेनाइज्ड स्लाइड पर इकट्ठा करें। स्लाइड्स को -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि वे धुंधला के लिए उपयोग नहीं किए जाते।

5. इम्यूनोफ्लोरेसेंस

  1. कमरे के तापमान (आरटी) पर 10 मिनट के लिए 0.1% ट्राइटन एक्स -100 (पीबीएस-टी) के साथ पीबीएस समाधान के साथ वर्गों से अक्टूबर निकालें।
  2. आरटी पर 1 घंटे के लिए 2% बीएसए, 3% गधा सीरम पीबीएस-टी 0.01% समाधान के साथ अवरुद्ध समाधान (बीएस) के साथ वर्गों का इलाज करें।
  3. बीएस में चयनित प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) को पतला करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर नमूनों को इनक्यूबेट करें।
  4. अगले दिन, आरटी पर 1x पीबीएस में नमूने 3 x 10 मिनट धो लें।
  5. बीएस में माध्यमिक एंटीबॉडी को पतला करें और आरटी पर 2 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  6. आरटी पर सेल नाभिक को चिह्नित करने के लिए 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल (डीएपीआई) के साथ 10 मिन के लिए नमूने इनक्यूबेट करें, पीबीएस-टी में 1: 1,000 कमजोर पड़ने पर पतला हो।
  7. बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड्स माउंट और ग्लास coverslips के साथ कवर.
  8. 2.5, 10, 20, और 40x पर एक widefield प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सभी छवियों ले लो.
  9. स्लाइस को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

6. हेमेटोक्सिलिन और ईोसिन (एच एंड ई) धुंधला हो जाना

नोट: यह साबित करने के लिए कि ग्राफ्टिंग ने काम किया है, एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन करें।

  1. आरटी पर 10 मिनट के लिए पीबीएस-टी 0.1% के साथ अक्टूबर निकालें।
  2. एक हुड में धारावाहिक निर्जलीकरण निम्नानुसार करें: आसुत जल (DW) में 10 मिनट, हेमटोक्सिलिन में 45 s, DW में 1 मिनट, PBS में 20 s, 70% EtOH में 2 x 30 s, 80% EtOH में 2 x 30 s, 96% EtOH में 2 x 30 s, eosin में 30 s, 96% EtOH में 2 x 15 s, 100% EtOH में 2 x 15 s, xylol-100% ETOH में 1 मिनट, xylol में 1 मिनट, xylol (ताजा) में 1 मिनट।
  3. ग्लास कवरस्लिप को जाइलीन-आधारित माउंटिंग माध्यम से माउंट करें।

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Representative Results

प्रत्यारोपण के लिए भ्रूण परिपक्वता अनुसूची का चयन
प्रयोग D0 पर शुरू होता है जब निषेचित अंडे 38 डिग्री सेल्सियस और 60% सापेक्ष आर्द्रता पर ऊष्मायन होते हैं। कोरियोलेंटोइक झिल्ली (सीएएम) एक अत्यधिक संवहनी बहिर्भ्रूणीय झिल्ली है जो अंडे के इनक्यूबेशन के बाद विकसित होती है। यह एलेंटोइस और कोरियोन के संलयन से बनता है। डी 1 में, इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद, सीएएम को आंतरिक खोल झिल्ली से जोड़ने से रोकने के लिए वायु कक्ष को पंचर किया जाता है। D1 पर वायु कक्ष को पंचर करने से बाद के चरणों (D4) में पंचर की तुलना में वायु कक्ष की गुणवत्ता में सुधार होता है। सीएएम D12 तक बढ़ने के लिए जारी है जब यह पूरे अंडे सामग्री को ढंकना और भीतरी खोल झिल्ली (चित्रा 1) के लिए मजबूती से पालन करता है. नमूना फसल की सुविधा के लिए डी 7 में किए गए छेद को बड़ा किया जाता है। D7 ग्राफ्टिंग के लिए इष्टतम समय है जब सीएएम परिपक्वता तक पहुँचता है और जर्दी थैली और भ्रूण की सतह को कवर करता है। इस स्तर पर, वायु कक्ष छेद बढ़े हुए हैं, और organoids एक स्वचालित विंदुक की मदद से सीएएम में स्थानांतरित कर रहे हैं.

मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड ग्राफ्टिंग
इन विट्रो में मस्तिष्क के अंगों की अंतर्निहित परिपक्वता के दौरान, उनकी सेलुलर संरचना तंत्रिका पूर्वज से परिपक्व न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं में बदल जाती है। Neurovasculature और neurogenesis कशेरुक में intermingled और अन्योन्याश्रित विकास प्रक्रियाओं रहे हैं, और इस crossstock के लिए अग्रणी संकेत अत्यधिक तंत्रिका समकक्ष29 की परिपक्वता चरण पर निर्भर है. तंत्रिका पूर्वज विकासशील मस्तिष्क29,30 में proangiogenic कारकों के प्रमुख स्रोत हैं. इसके विपरीत, न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स संवहनी एंडोथेलियल विकास कारक31,32 के स्राव के माध्यम से परिपक्व चरणों और वयस्कता में नियोएंजियोजेनेसिस का समर्थन करते हैं। मस्तिष्क साइटोआर्किटेक्चर में ये परिवर्तन, जो मस्तिष्क के ऑर्गेनोइड में भी परिलक्षित होते हैं, मस्तिष्क के ऑर्गेनोइड की परिपक्वता चरण के आधार पर सीएएम उत्कीर्णन के एकीकरण और प्रतिक्रिया में अंतर परिवर्तन कर सकते हैं। इसलिए, हमने इन विट्रो (डीआईवी) में भेदभाव दिवस 13 पर मस्तिष्क के अंगों को ग्राफ्ट किया, जब न्यूरोपीथेलियल कोशिकाओं और रेडियल ग्लिया का विस्तार होता है; डीआईवी 37 पर, न्यूरोजेनेसिस की शुरुआत में; डीआईवी 60 पर, जब न्यूरोजेनेसिस मजबूत होता है और विभिन्न पहचान के न्यूरॉन्स को टर्मिनल रूप से विभेदित किया जाता है; और डीआईवी 120 में, जब परिपक्व न्यूरॉन्स की अधिकता ऑर्गेनॉइड को आबाद कर रही है, तो एक अच्छी तरह से विकसित न्यूरोनल नेटवर्क और एस्ट्रोजेनेसिस भी व्यापक है।

सभी मामलों में, नमूने ओवो (डीआईओ) इनक्यूबेशन में 5 दिनों के बाद एकत्र किए गए थे। मस्तिष्क के अंगों में बैच प्रभाव के कारण पूर्वाग्रहों से बचने के लिए, ग्राफ्टेड और गैर-ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड के बीच सभी तुलना एक ही बैच में एक जोड़ीदार तरीके से की गई थी। ऑर्गेनोइड प्रति समय बिंदु कम से कम दो स्वतंत्र प्रयोगों और कुल छह स्वतंत्र भेदभाव से प्राप्त किए गए थे। प्रत्येक ग्राफ्टिंग प्रयोग में समानांतर में कई परिपक्वता चरणों की ग्राफ्टिंग की गई थी। ग्राफ्टिंग पर, ऑर्गेनोइड ने ऑर्गेनॉइड (चित्रा 2) में रक्त वाहिकाओं की घुसपैठ के किसी भी सबूत के बिना सीएएम जहाजों से सटे परिपक्वता प्रक्रिया को जारी रखा।

ग्राफ्टिंग पर ऑर्गेनॉइड उत्तरजीविता सबसे कम उम्र में 80% से होती है और ग्राफ्टिंग के बाद 5 दिनों के बाद परिपक्व ऑर्गेनोइड में ~ 66% तक गिर जाती है, यह सुझाव देती है कि समय के साथ अनुमति और ऑर्गेनॉइड ग्राफ्टिंग प्लास्टिसिटी बदल सकती है (तालिका 1)। ऑर्गेनॉइड व्यवहार्यता एच एंड ई स्टेनिंग में पाइनोटिक नाभिक की उपस्थिति से निर्धारित की गई थी। पाइकोटिक नाभिक की संख्या प्रत्यारोपित और गैर-प्रत्यारोपित नियंत्रण ऑर्गेनोइड्स(चित्रा 3)के बीच समान थी, यह सुझाव देते हुए कि सीएएम प्रत्यारोपण पर जीवित ऑर्गेनॉइड को बनाए रखने के लिए अनुमेय है। इसके अलावा, सीएएम में कोई हिस्टोलॉजिकल या हेमोजेनिक रिलीज का पता नहीं चला, और भ्रूण जीवित रहते हैं, यह सुझाव देते हुए कि न तो ग्राफ्टिंग प्रक्रिया और न ही ऑर्गेनॉइड सीएएम की अखंडता को बाधित करते हैं या भ्रूण के विकास को महत्वपूर्ण रूप से प्रभावित करते हैं।

ग्राफ्टेड मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में सेल संरचना
अनगाइडेड मस्तिष्क ऑर्गेनोइड में एक चिह्नित अंतर- और इंट्राऑर्गेनॉइड सेलुलर परिवर्तनशीलता होती है। हालांकि, वे मुख्य रूप से तंत्रिका हैं, एक अनुक्रमिक गति 2,26 पर पूर्वजों, न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की तरंगें पैदा करते हैं। इसके बाद, हमने मूल्यांकन किया कि ग्राफ्टिंग मस्तिष्क के अंगों में तंत्रिका संरचना को बदल देती है या नहीं। छोटे ऑर्गेनोइड (13 डीआईवी + 5 डीआईओ: 18 दिन) न्यूरॉन्स (टीयूबीबी 3 +) की उपस्थिति में उनके नियंत्रण गैर-ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड से कोई अंतर नहीं दिखाते हैं। बाद में परिपक्वता चरणों (60 डीआईवी +5 डीआईओ: 65 दिन और 120 डीआईवी + 5 डीआईओ: 125 दिन) में, न्यूरॉन्स (टीयूबीबी 3 +) का अनुपात गैर-ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड(चित्रा 4)की तुलना में नाटकीय रूप से कम हो जाता है। 60 डीआईवी के लिए परिपक्व गैर-ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड में, न्यूरॉन्स व्यापक रूप से ऑर्गेनोइड के चारों ओर फैले हुए हैं।

विशेष रूप से, ग्लियल फाइब्रिलरी एसिडिक प्रोटीन-पॉजिटिव (जीएफएपी +) एस्ट्रोसाइट्स की संख्या और स्थानीयकरण, गैर-ग्राफ्टेड नियंत्रणों में देखे गए लोगों की तुलना में वृद्धि का प्रमाण है। इसके अलावा, इन GFAP+ एस्ट्रोसाइट्स ने ऑर्गेनॉइड के बाहरी हिस्से में एक अप्रत्याशित स्थानीयकरण प्राप्त कर लिया। 18 डीआईवी में, मुक्त ऑर्गेनोइड (गैर-ग्राफ्टेड), कुछ एस्ट्रोसाइट्स देखे जा सकते हैं और कोई संरचनात्मक वितरण नहीं पाया जा सकता है; इसके विपरीत, वे सजातीय रूप से पूरे ऑर्गेनॉइड (चित्रा 3) में फैले हुए दिखाई देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: ऑर्गेनॉइड प्रत्यारोपण के लिए सीएएम परख सेटअप की समयरेखा। (ए) अंडे के शीर्ष पर सर्जिकल पेपर चिपकने वाला पट्टी आवेदन। (बी) चिपकने वाली पट्टी पर एक सुई के साथ खोल में एक छेद बनाना। (सी) अंडे के छिलके की खिड़की खोलें, ऊपर से देखें, एक (डी) मानव मस्तिष्क अंग (दिन 60) के प्रत्यारोपण के लिए तैयार है। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ई) ओवो इनक्यूबेशन में 5 दिनों के बाद सीएएम में उत्कीर्ण ऑर्गेनॉइड की कल्पना। (एफ) दिन 0 से दिन 120 तक मस्तिष्क अंग विकास की पहचान। तीर ऑर्गेनॉइड के स्थान को इंगित करता है। संक्षिप्त: CAM = chorioallantoic झिल्ली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: हेमेटोक्सिलिन और कोरियोलेंटोइक झिल्ली में ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड के ईोसिन धुंधला हो जाना। (ए) 13 डीआईवी + 5 डीआईओ ऑर्गेनॉइड; (बी) 37 डीआईवी + 5 डीआईओ ऑर्गेनॉइड; (सी) 60 डीआईवी + 5 डीआईओ ऑर्गेनॉइड; और (डी) 120 डीआईवी + 5 डीआईओ ऑर्गेनॉइड; लाल वर्ग ऑर्गेनॉइड को चिह्नित करते हैं। स्केल बार = 500 माइक्रोन. संक्षिप्ताक्षर: DIV = इन विट्रो में दिन; DIO = ओवो में दिन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: विकास के विभिन्न चरणों में ऑर्गेनोइड की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। GFAP का उपयोग नाभिक के लिए धुंधला और DAPI के लिए किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (ए, बी) उसी 13 डीआईवी + 5 डीआईओ ग्राफ्टेड ऑर्गेनॉइड की छवियां जहां ऑर्गेनॉइड के किनारे के आसपास एस्ट्रोसाइट्स देखे जाते हैं। (सी) 18 डीआईवी मुक्त ऑर्गेनॉइड की छवि जहां एस्ट्रोसाइट्स मुश्किल से दिखाई देते हैं। मुक्त और ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड के बीच का अंतर बहुत ध्यान देने योग्य है। (डी, ई) 37 डीआईवी + 5 डीआईओ ग्राफ्टेड ऑर्गेनॉइड की छवियां जहां कुछ एस्ट्रोसाइट्स देखे जा सकते हैं। (च) 42 डीआईवी मुक्त ऑर्गेनॉइड की छवि। पीले तीर एस्ट्रोसाइट्स के स्थान को इंगित करते हैं। संक्षिप्ताक्षर: DIV = इन विट्रो में दिन; DIO = ओवो में दिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; GFAP = ग्लियाल फाइब्रिलरी अम्लीय प्रोटीन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: 120 डीआईवी ऑर्गेनोइड की इम्यूनोसाइटोकेमिस्ट्री। TUBB3 का उपयोग न्यूरॉन्स और DAPI को नाभिक के लिए धुंधला करने के लिए किया गया था। स्केल बार = 100 माइक्रोन; छवियों को 20x पर लिया गया था। (ए) एक 120 डीआईवी +5 डीआईओ ग्राफ्टेड ऑर्गेनॉइड जहां कुछ न्यूरॉन्स देखे जा सकते हैं। (बी) एक 125 डीआईवी, न्यूरॉन्स के बहुत सारे के साथ मुक्त अंग। तारांकन ऑर्गेनॉइड के स्थान को इंगित करता है जबकि धराशायी रेखा ऑर्गेनॉइड और सीएएम (हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण द्वारा निर्धारित) के बीच की सीमा का प्रतिनिधित्व करती है। संक्षिप्ताक्षर: DIV = इन विट्रो में दिन; DIO = ओवो में दिन; DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindole; CAM = chorioallantoic झिल्ली। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

ऑर्गेनोइड्स 13 मंडल 37 मंडल 60 मंडल 120 डिवीव
ज़िंदादिल 6 (75%) 10 (83%) 6 (66%) 6 (66%)
अत्‍यधिक 2 (25%) 2 (16%) 3 (34%) 3 (34%)

तालिका 1: सीएएम ऑर्गेनॉइड ग्राफ्टिंग के बाद भ्रूण जीवित रहने की दर। संक्षिप्ताक्षर: DIV = इन विट्रो में दिन; DIO = ओवो में दिन; CAM = chorioallantoic झिल्ली।

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Discussion

इस अध्ययन में, हम कई महत्वपूर्ण चरणों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं जो चिकन भ्रूण के अस्तित्व को परेशान किए बिना ग्राफ्टिंग पर मानव मस्तिष्क के अंगों के अनुकूल विकास और विकास प्रदान करते हैं। हम इनक्यूबेशन (1 दिन) के 24 घंटे के बाद अंडे के वायु कक्ष पंचर करने के लिए बाँझ सुइयों के उपयोग की सिफारिश की. इसके अतिरिक्त, हमने दिन 4 पर पंचर बनाने की भी कोशिश की (प्रकाश द्वारा अंडे के छिलके के माध्यम से जांच करने के बाद वास्कुलचर के विकास का परीक्षण करने के लिए यह सुनिश्चित करने के लिए कि हम केवल स्वस्थ भ्रूण के साथ काम कर रहे थे)। हालांकि, इसके परिणामस्वरूप अंडे के छिलके के लिए सीएएम वाहिकाओं की निकटता के कारण भ्रूण की व्यवहार्यता में गिरावट आई। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि बहुत अधिक बल लागू करने से सीएएम वाहिका के बाद के नुकसान के साथ अंडे के छिलके को तोड़ने में परिणाम हो सकता है। अंडे के छिलके के पतले क्षेत्रों का पता लगाने के लिए एक प्रकाश स्रोत का उपयोग कुंद छेद बनाने में मददगार था, साथ ही साथ ओवरपेनेट्रेशन को रोकने और अंडे से गुजरने के लिए, जिससे सीएएम पर आक्रमण हुआ।

भले ही इनक्यूबेशन के दौरान चिकन भ्रूण के समुचित विकास के लिए अंडे का रोटेशन अनिवार्य लगता है, लेकिन वायु कक्ष को पंचर करने के बाद इससे बचना आवश्यक है। एल्बुमिन को हटाने के लिए इस मॉडल के लिए वारंट नहीं किया गया था और न ही अंडे के निर्जलीकरण से बचने के लिए पीबीएस के अलावा था. इसके अलावा, 70% इथेनॉल समाधान का उपयोग बुद्धिमानी से किया जाना चाहिए, भ्रूण की व्यवहार्यता को संरक्षित करने के लिए खोल पर किसी भी शेष इथेनॉल समाधान को सूखने के लिए अतिरिक्त देखभाल के साथ। एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु एनग्राफ्टमेंट के लिए उपयोग किए जाने वाले अंडे के छिलके के छेद का आकार है, जिसके लिए सबसे छोटे संभव छेद को संतुलित करने की आवश्यकता होती है जो ग्राफ्टिंग हेरफेर आराम की अनुमति देता है। ग्राफ्टिंग (E7) के लिए भ्रूण चरण का चयन सीएएम की परिपक्वता चरण और उसके सापेक्ष आकार से प्रेरित था, जो प्रत्यारोपण के एकीकरण के पक्ष में था। हालांकि, अंतिम मामले में कि प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड को ओवो परिपक्वता में अधिक समय की आवश्यकता होती है, ग्राफ्टिंग दिन E5.5/6 पर किया जा सकता है। प्रयोगात्मक व्यवहार्यता सुनिश्चित करने के लिए मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड परिवर्तनशीलता को नियंत्रित किया जाता है। एक ही उम्र के ऑर्गेनोइड समान आकार प्रदर्शित करते हैं, और यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, ऑर्गेनोइड की उम्र की परवाह किए बिना, वे सभी प्रत्यारोपण के बाद 5 दिनों के लिए ऊष्मायन किए गए थे। इसके अलावा, स्थिरता के लिए, नियंत्रण ऑर्गेनोइड को सावधानीपूर्वक उनके उत्कीर्ण समकक्षों के सटीक आकार से मेल खाने के लिए चुना गया था। एक अन्य तकनीकी पहलू, ग्राफ्टेड ऑर्गेनोइड और भ्रूण दोनों के अस्तित्व का समर्थन करने के लिए प्रासंगिक, पैराफिल्म के एक वर्ग टुकड़े के साथ ग्राफ्टिंग छेद को बंद कर रहा है, ताकि ओवो वातावरण में नियंत्रित बनाए रखा जा सके।

हमारी प्रारंभिक परिकल्पनाओं के विपरीत, युवा ऑर्गेनोइड पुराने लोगों की तुलना में ग्राफ्टिंग प्रक्रिया और सीएएम एकीकरण के बाद बेहतर बच गए। हमने अनुमान लगाया है कि प्रारंभिक चरण के पूर्वज33 में उनकी समृद्ध उपस्थिति के कारण युवा ऑर्गेनोइड अधिक प्लास्टिक हैं, जबकि परिपक्व न्यूरॉन्स को उनके रखरखाव के लिए एक अनुमेय न्यूरोनल वातावरण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, एस्ट्रोसाइट्स के वितरण में प्रारंभिक (डी 18) मस्तिष्क ऑर्गेनॉइड ग्राफ्टिंग में साइटोआर्किटेक्चरल परिवर्तन का पता चला था। विशेष रूप से, हमने पाया कि एस्ट्रोसाइट्स इस प्रारंभिक चरण में केवल ग्राफ्टेड होने पर विभेदित होते हैं और उन्होंने ऑर्गेनॉइड सतह के नीचे एक छद्म कैप्सूल उत्पन्न करने के लिए खुद को वितरित किया। यह संरचना एक न्यूरोवास्कुलर इंटरफ़ेस उत्पन्न करने के लिए ऑर्गेनॉइड की क्षमता की याद दिला सकती है जो बीबीबी की नकल कर सकती है। वैकल्पिक रूप से, एक बाधा जैसी संरचना में स्थित एस्ट्रोसाइट्स की बढ़ी हुई प्रतिक्रियाशीलता, सीएएम से स्रावित सिग्नलिंग के लिए ऑर्गेनॉइड की एक इम्युनोजेनिक प्रतिक्रिया का संकेत हो सकती है। हालांकि, इस परिकल्पना को प्रदर्शित करने के लिए आगे के काम की आवश्यकता है। सारांश में, यह पत्र चिकन सीएएम में कई विकासात्मक चरणों के ऑर्गेनोइड को उकेरने के चरणों का वर्णन करता है, प्रारंभिक विकास ऑर्गेनोइड के लिए एक अधिक अनुमेय स्थिति है, और न्यूरॉन्स और जीएफएपी में इन ग्राफ्टिंग का सेलुलर प्रभाव है।

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Disclosures

लेखक हितों के किसी भी टकराव की रिपोर्ट नहीं करते हैं।

Acknowledgments

हम व्यावहारिक चर्चाओं के लिए यूबी से डॉ. अलकांतारा और डॉ. ओर्टेगा और डॉ. अकोस्टा की प्रयोगशाला के बाकी सदस्यों को धन्यवाद देते हैं। एसए सेरा-हंटर यूनिवर्सिटैट डी बार्सिलोना में जनरलिटेट डी कैटालुन्या के साथी सहायक प्रोफेसर हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-TUBB3 [Tuj1], mouse  BioLegend 801201 1:1,000
Anti-GFAP, rabbit GeneTex GTX108711 1:500
Anti-rabbit AlexaFluor 488, goat. Invitrogen A-21206 1:1,000
Anti-mouse AlexaFluor 594, goat Jackson ImmunoResearch 715-585-150 1:500
Fertilized White Leghorn chicken (Gallus gallus) eggs Granja Gibert (Cambrils, Spain)
DAPI Invitrogen D1306 1:10,000
DPX Sigma 100579 xylene-based mounting medium 
Gentle Dissociation Solution CreativeBiolabs ITS-0622-YT187 cell dissociation solution
Matrigel BD Biosciences 356234
Mowiol 4-88 mounting media Merk 81381
Paper towel, lab-grade Sigma-Aldrich Z188956
ROCK inhibitor Y27632 Millipore SCM075 10 nM
Sharp-Point Surgical Scissors VWR 470106-340
Superfrost Plus Adhesion Microscope Slides Epredia J1800AMNZ

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References

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Fiore, L., Arderiu, J.,… More

Fiore, L., Arderiu, J., Martí-Sarrias, A., Turpín, I., Pareja, R. I., Navarro, A., Holubiec, M., Bianchelli, J., Falzone, T., Spelzini, G., Scicolone, G., Acosta, S. Early Unguided Human Brain Organoid Neurovascular Niche Modeling into the Permissive Chick Embryo Chorioallantoic Membrane. J. Vis. Exp. (204), e65710, doi:10.3791/65710 (2024).

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