Summary
Здесь мы представляем подробный протокол визуализации сетей микротрубочек в нервно-мышечных соединениях и мышечных клетках. В сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек для определения роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.
Abstract
Сеть микротрубочек является важным компонентом нервной системы. Мутации во многих регуляторных белках микротрубочек связаны с нарушениями развития нервной системы и неврологическими заболеваниями, например, микротрубочки-ассоциированный белок Tau с нейродегенеративными заболеваниями, расщепляющий микротрубочки белок Spastin и Katanin 60 вызывают наследственную спастическую параплегию и аномалии развития нервной системы, соответственно. Обнаружение сетей микротрубочек в нейронах полезно для выяснения патогенеза неврологических расстройств. Однако небольшой размер нейронов и плотное расположение пучков аксональных микротрубочек затрудняют визуализацию сетей микротрубочек. В данной работе мы описываем метод рассечения нервно-мышечного соединения личинок и мышечных клеток, а также иммуноокрашивание α-тубулина и микротрубочно-ассоциированного белка Futsch для визуализации сетей микротрубочек у Drosophila melanogaster. Нервно-мышечное соединение позволяет нам наблюдать как пре-, так и постсинаптические микротрубочки, а большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Здесь, мутируя и гиперэкспрессируя катанин 60 у Drosophila melanogaster, а затем исследуя сети микротрубочек в нервно-мышечном соединении и мышечных клетках, мы точно выявляем регуляторную роль катанина 60 в развитии нервной системы. Таким образом, в сочетании с мощными генетическими инструментами Drosophila melanogaster, этот протокол значительно облегчает генетический скрининг и анализ динамики микротрубочек на предмет роли регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе.
Introduction
Микротрубочки (МТ), как один из структурных компонентов цитоскелета, играют важную роль в различных биологических процессах, включая деление клеток, рост и подвижность клеток, внутриклеточный транспорт и поддержание формы клеток. Динамика и функция микротрубочек модулируются взаимодействием с другими белками, такими как MAP1, MAP2, Tau, Katanin и Kinesin 1,2,3,4,5.
В нейронах микротрубочки необходимы для развития и поддержания аксонов и дендритов. Аномалии в микротрубочках приводят к дисфункции и даже гибели нейронов. Например, в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера гиперфосфорилирование тау-белка снижает стабильность сети микротрубочек, вызывая неврологическиенарушения. Таким образом, изучение сетей микротрубочек будет способствовать пониманию развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний.
Нервно-мышечное соединение (NMJ) представляет собой периферический синапс, образованный между окончанием аксона двигательного нейрона и мышечным волокном, который является превосходной и мощной модельной системой для изучения синаптической структуры и функций7. Futsch — белок дрозофилы, гомологичный белку MAP1B, связывающему микротрубочки, обнаруженному у млекопитающих8. Он экспрессируется только в нейронах и играет роль в развитии синаптических кнопок NMJ 8,9. У дикого типа нитевидные пучки, проходящие вдоль центра NMJ, визуализируются путем иммуноокрашивания анти-Futsch. Достигнув конца NMJ, этот пучок имеет способность либо образовывать петлю, состоящую из микротрубочек, либо терять свою нитевидную структуру, что приводит к диффузному и точечному виду10. Петли микротрубочек связаны с приостановленными конусами роста, что позволяет предположить, что массив микротрубочек стабилен11. Таким образом, мы можем косвенно определить стабильное развитие микротрубочек в NMJ с помощью окрашивания по методу Футча. Большой размер мышечных клеток у личинки дрозофилы позволяет четко визуализировать сеть микротрубочек. Факторы, влияющие на стабильность сети микротрубочек, могут быть обнаружены путем анализа плотности и формы микротрубочек. В то же время, состояние сети микротрубочек мышечных клеток может быть перепроверено с результатом NMJ для получения более полных выводов.
Для исследования сети и динамики микротрубочек было использовано множество протоколов. Тем не менее, эти исследования часто сосредотачивались на исследованиях in vitro 12,13,14,15,16. Кроме того, в некоторых экспериментах in vivo использовалась электронная микроскопия для обнаружения цитоскелета17. В соответствии со специфическим связыванием флуоресцентно меченных антител или химических красителей с белками или ДНК, представленные здесь методы позволяют обнаруживать сети микротрубочек в NMJ на уровне отдельных нейронов in vivo, причем результаты подтверждаются наблюдениями в мышечных клетках. Этот протокол прост, стабилен и воспроизводим в сочетании с мощными генетическими инструментами, доступными у Drosophila melanogaster, что позволяет проводить широкий спектр фенотипических исследований и генетических скринингов на роль регуляторных белков сети микротрубочек в нервной системе in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Вскрытие личинок
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассекающий раствор гемолимфоподобного физиологического раствора (HL3.1)18 и фиксирующий раствор 4% параформальдегида (PFA)19,20 используются при комнатной температуре, поскольку микротрубочки деполимеризуются при слишком низкой температуре.
- Выберите блуждающую личинку3-го возраста длинными тупыми щипцами. Промойте его HL3.1 и поместите на чашку для препарирования под стереомикроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Блуждающая личинка3-го возраста идентифицируется по разветвленному переднему дыхальцу и ползает по трубке примерно через 96 ч (25 °C)21. - Расположите личинку спинной или брюшной стороной вверх. Определите дорсальную сторону по двум длинным трахеям, а вентральную — по брюшным зубным поясам.
- В зависимости от ткани, которую необходимо исследовать, выберите дорсальную или вентральную диссекцию. Это позволит получить более точное и детальное представление о конкретной интересующей области. Для наблюдения за NMJ и мышечными клетками разрезают спинную и вентральную области личинки соответственно.
- Приколите рот крючками и хвостиком. Отрегулируйте штифты, чтобы сохранить личинку в вытянутом состоянии. Добавьте в личинку каплю HL3.1, чтобы она не высохла.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ca2+ -free HL 3.1 можно использовать для минимизации сокращения мышц во время рассечения. - С помощью ножниц для рассечения сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу, но не отрезайте задний конец. Затем разрезают по вентральной средней линии по направлению к переднему концу.
- Вставьте четыре булавки в виде насекомых по четырем углам личинки. Отрегулируйте булавки насекомых таким образом, чтобы личинка максимально растянулась во все стороны.
- Используйте щипцы для удаления внутренних органов, не повреждая при этом мышцы.
2. Фиксация
- Добавьте 100 мкл PFA (4%), чтобы погрузить туши на 40 минут, пока туши все еще прикреплены к чашке для препарирования.
ВНИМАНИЕ: Принимаются эффективные меры защиты, чтобы избежать прямого контакта с кожей или вдыхания, так как PFA представляет опасность. - Снимите штифты и перенесите образец в пробирку для микроцентрифуги объемом 2 мл. Смойте PFA 1x фосфатным буфером физиологического раствора, содержащим 0,2% Triton X-100 (0,2% PBST), чтобы заполнить пробирку микроцентрифуги объемом 2 мл в течение 10 минут на шейкере для обесцвечивания при 15 об/мин. Повторите процесс стирки 5 раз.
3. Иммуноцитохимия
- Погрузите туши в блокирующее средство (5% козья сыворотка в 0,2% PBST) и блокируйте на 40 мин при комнатной температуре.
- Удалите блокирующий агент и замените его 200 мкл первичного антитела (например, анти-α-тубулина, 1:1000; анти-Футча, 1:50), разбавленного 0,2% PBST при 4 °C в течение ночи. Визуализируйте мышечные микротрубочки с помощью иммуноокрашивания моноклональным анти-α-тубулином. Anti-Futsch может косвенно отражать морфологию микротрубочек в NMJ.
- После инкубации первичного антитела личинки промывают 0,2% ПБСТ в течение 10 мин. Повторить 5 раз.
- Инкубируют личинок с 200 мкл вторичного антитела (например, козьего анти-Мауса-488, 1:1000), разбавленного 0,2% PBST при комнатной температуре, в течение 1,5 ч в темноте.
- Далее добавляют ядерный краситель типа TO-PRO(R)3 йодида (T3605) в концентрации 1:1000 в инкубационную пробирку на 30 мин при окрашивании микротрубочек в темноте20,22.
- Смойте вторичное антитело и ядерный краситель 0,2% PBST в течение 10 мин. Повторите 5 раз в темноте.
4. Монтаж
- Поместите тушку личинки в 0,2% ПБСТ на предметное стекло и отрегулируйте ее под стереомикроскопом. Убедитесь, что внутренняя поверхность туши личинки обращена вверх, а все тушки личинок расположены так, как нужно.
- Излишки раствора ПБСТ впитайте салфеткой и аккуратно добавьте каплю монтажного средства против выцветания.
- Положите на предметное стекло покровный листок, чтобы медленно и осторожно накрыть препарированных личинок, чтобы избежать пузырьков.
- Нанесите лак для ногтей вокруг покровного стекла. Поместите предметное стекло в темное место, чтобы уменьшить затухание флуоресценции.
5. Получение изображения
- Для получения изображений используйте лазерный сканирующий конфокальный микроскоп, выберите 60-кратный масляный иммерсионный объектив (числовая апертура 1,42) или аналогичный и отрегулируйте мощность лазера и длину волны в зависимости от эксперимента.
- Чтобы идентифицировать NMJ, сделайте снимки в мышце 4 в сегменте A3 (как показано на рисунке 1F). Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина или Футша и 543 нм для активации трека визуализации HRP. Настройте параметры на размер кадра 800 x 800 пикселей, цифровой зум 2,0 и интервал изображения 0,8 мкм в NMJ (рис. 2).
- Чтобы идентифицировать микротрубочки в мышце, сделайте снимки мышцы 2 в сегменте A3-A5 (как показано на рисунке 1G), так как у нее меньше трахеальных ветвей. Выберите лазер с длиной волны 488 нм для активации α-тубулина и лазер с длиной волны 635 нм для активации трека визуализации T3605. Настройте параметры на размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 3,0 и интервал визуализации 0,4 мкм в мышечных клетках (рис. 3).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы продемонстрировали пошаговую процедуру визуализации сети микротрубочек как в нервно-мышечных соединениях (NMJ), так и в мышечных клетках. После вскрытия в соответствии с принципиальной схемой (рис. 1A-E) проводится иммуноокрашивание, после чего изображения наблюдаются и собираются под лазерным конфокальным микроскопом или стереоскопическим флуоресцентным микроскопом (рис. 1F,G).
Как пре-, так и постсинаптическая организация микротрубочек NMJ может быть помечена анти-α-тубулином, и, выбирая толщину слоя лазерного сканирующего конфокального микроскопа, можно отобразить морфологию микротрубочек различных срезов (рис. 2A-C). Футш также используется для трассировки нейронов, выявляя организацию микротрубочек в аксонах нейронов. Анти-HRP используется для мечения мембраны нейронов 10,23,24. Совместное окрашивание антителами к Футчу и анти-HRP проводят для определения состояния микротрубочек в аксонах нейронов. Окрашивание по Футшу может отражать обилие стабильных микротрубочек в пресинаптических нейронах NMJ9. Тубулин-специфический шаперон Е (TBCE) играет решающую роль в развитии цитоскелета МТ. Когда TBCE сбивается в пресинаптических нейронах, сигнал анти-Футча становится слабее и тоньше, а окрашивание в терминальных бутонах либо неочевидно, либо отсутствует23. Тау - это белок, связанный с микротрубочками, который играет важную роль в сборке и стабилизации микротрубочек25,26. У дрозофилы с эктопической экспрессией человеческого тау-белка дикого типа и мутантного тау-белка человека выявлено снижение интенсивности сигнала Футча на NMJ-терминалах20. По результатам окрашивания по Футчу интенсивность окрашивания ствола аксона была сильнее, чем у ветвей (рис. 2D-F). Микротрубочки на концах ветвей менее стабильны и более склонны к морфологическим изменениям, поэтому динамику микротрубочек можно отразить, окрашивая концевые микротрубочки.
Морфологические изменения микротрубочек также могут быть легко визуализированы22. Петли микротрубочек можно окрашивать анти-Futsch и анти-α-тубулином. Кроме того, форма одной петли может быть четко отображена, что облегчает количественный анализ. Например, катанин – это белок, рассекающий микротрубочки, который играет важную роль в регуляции динамики микротрубочек. Сообщается, что каталитическая субъединица катанин 60 оказывает влияние на морфологию микротрубочек22. Мао сконструировал мутант Катанин-60 путем Р-элемент-опосредованной эксцизии и uas-Катанин-60 путем вставки pUAST-attB-Katanin 60 во вторую хромосому в 51D. Было наглядно продемонстрировано увеличение петель микротрубочек, вызванное мутациями Katanin 6017A (рис. 2A,B,D,E). Кроме того, при гиперэкспрессии катанина 60 короткие фрагменты МТ также могли наблюдаться в терминальных бутонах (рис. 2В).
Сеть микротрубочек можно наблюдать при окрашивании антителами к α-тубулину в мышечных клетках. Была отчетливо видна сеть микротрубочек, простирающихся вокруг ядра (рис. 3А). Расщепляющий микротрубочки белок катанин регулирует распределение сети микротрубочек22. У мутанта Katanin 6017A мышечные клетки имели значительно повышенную интенсивность перинуклеарного МТ и демонстрировали более сильные пучки по сравнению с диким типом (рис. 3B). Представлена фрагментация волокон микротрубочек, вызванная гиперэкспрессией катанина 60 (рис. 3В). Таким образом, протокол позволяет визуализировать сеть микротрубочек как в нейронах, так и в мышечных клетках.
Рисунок 1. Процедура дорсального вскрытия личинки дрозофилы . (А-Е) Порядок подготовки личиночных тушек (видоизменен с21). (А) Вставьте по два штифта в ротовые крючки и хвост личинки. (B) С помощью ножниц для препарирования сделайте небольшой поперечный надрез близко к заднему концу. (C) Разрез вдоль вентральной срединной линии по направлению к переднему концу. (D) Вставьте четыре булавки для насекомых в четыре угла личинки. (Д) Используйте щипцы, чтобы удалить внутренние органы, и отрегулируйте положение штифтов, чтобы поместить личинку в подходящее положение для фотографирования. (F) Фаллоидин используется для мечения цитоскелета для визуализации мышцы, а HRP используется для мечения клеточной мембраны нейронов. Наблюдаемая область NMJ ограничена мышцей 4 в сегменте A3, окрашенной совместно с анти-HRP (зеленый) и фаллоидином (пурпурный). На правой панели показано схематическое изображение локальной мышечной структуры. Размер кадра 1024 x 1024 пикселя, цифровой зум 0,6 и интервал изображения около 4 мкм при использовании объектива 10x (числовая апертура 0,45). (G) Наблюдаемая область мышечных клеток ограничена мышцей 2 в сегментах от А3 до А5, окрашенной фаллоидином (пурпурным). Одиночный срез фиксируется стереоскопическим флуоресцентным микроскопом. Масштабная линейка: 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2. Конфокальные изображения микротрубочек в NMJ с помощью анти-α-тубулина или анти-Futsch. В левом столбце показаны NMJ-терминалы контроля w1118 (A), мутанта Katanin 60 17A (B) и нейрональная гиперэкспрессия Katanin 60 (C), окрашенные совместно с анти-HRP (красный) и анти-α-тубулином (зеленый). Изображения представляют собой проекции от полных z-стеков через всю мышцу 4 НМДж брюшного сегмента А3. Средний столбец показывает более четкое изображение микротрубочек в окончаниях NMJ путем удаления микротрубочек из мышцы. В правой колонке показана морфология микротрубочек в синаптических бутонах с помощью аналитического программного обеспечения. Масштабная линейка: 1 мкм. Клеммы NMJ разных генотипов, окрашенные совместно с анти-HRP (красный) и анти-Futsch (зеленый) (D-F). Петли МТ были обозначены стрелками. Масштабная линейка: 5 мкм. Эта цифра была адаптирована из22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Окрашивание перинуклеарной сети микротрубочек в мышечных клетках личинок дрозофилы . (А-С) Личиночные мышцы окрашивают анти-α-тубулином (зеленым), чтобы показать сеть микротрубочек, и T3605 (синий), чтобы показать ядро для контроля w1118 (A), мутанта Katanin 6017A (B) и катанина 60 в мышечной системе (C). Изображения представляют собой проекции полных z-стеков от появления микротрубочек до центра ядра. Масштабная линейка: 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь описан протокол вскрытия и иммуноокрашивания нервно-мышечных соединений личинок дрозофилы и мышечных клеток. Есть несколько важных моментов, которые следует учитывать. Во-первых, во время процесса рассечения очень важно избежать травмирования наблюдаемых мышц. Возможно, стоит зафиксировать филе перед удалением внутренних органов, чтобы предотвратить прямой контакт щипцов с мышцами. Чтобы избежать повреждения мышц или отрыва от личиночного эпидермиса, важно следить за тем, чтобы скорость шейкера не превышала 15 оборотов в минуту во время промывки и инкубации. Кроме того, для обеспечения четкой и полной фотографии морфологии NMJ необходим точный контроль за расширением кожи. Целесообразно проводить предварительные эксперименты для оптимизации концентрации антител, времени фиксации, блокировки и инкубации. Фиксированная продолжительность ограничена примерно 40 минутами. Слишком короткая или слишком длинная не способствует иммуноокрашиванию сети микротрубочек.
Микротрубочки в нейронах плотно упакованы, и их трудно четко визуализировать с помощью обычной микроскопии. По сравнению с нейронами, мышечные клетки дрозофилы заметно большие, причем мышца 2 сегмента А3 имеет размеры до 40 мкм х 150 мкм, что делает ее пригодной для визуализации с высоким разрешением. Таким образом, использование мышечных клеток дрозофилы для исследования регуляции белков, связанных с сетью микротрубочек, является интуитивным и ясным подходом, который имеет большое значение для валидации фенотипов NMJ20,22,23. По сравнению с предыдущим методом27 мы изменили направление рассечения с дорсального на брюшное, чтобы получить беспрепятственный объект. Элюирующий буфер мышцы с 0,2% PBST является относительно щадящим и помогает сохранить целостность мышц.
У этого подхода все еще есть некоторые ограничения. Как белок, связывающий микротрубочки, Futsch экспрессируется исключительно в нейронах и может опосредованно представлять собой полимеризованные микротрубочки. Однако, если для визуализации сети микротрубочек во время скрининга взаимодействия используется только Futsch, некоторые белки-кандидаты могут быть упущены. α-тубулин или β-тубулин могут непосредственно представлять сеть микротрубочек, однако эти два белка представлены как пресинаптическими, так и постсинаптическими, и иногда их трудно различить. Более того, в цитоплазме распределено большое количество гетеродимеров α/β-тубулина, а это означает, что мечение либо α-тубулина, либо β-тубулина может быть непригодным для живой визуализации, так как одновременно могут наблюдаться как полимеризованный, так и неполимеризованный тубулин.
Наблюдение за микротрубочками от двигательных нейронов до мышечных клеток может обеспечить всестороннее понимание механизмов движения с точки зрения нейронных цепей, облегчая изучение процессов развития нервной системы и патогенеза неврологических заболеваний. Визуализация сети микротрубочек в различных модельных системах полезна для проверки функции генов с разных точек зрения с помощью этого протокола. Этот метод также может быть использован для наблюдения за постсинаптическими рецепторами NMJ, что полезно для изучения связи между синапсами и синаптической пластичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим д-ра Ин Сюна за обсуждение и комментарии к рукописи. Эта работа поддержана грантом Национального научного фонда Китая (NSFC) C. M. (31500839).
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
Tweezers | dumont | 500342 |
References
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J.
Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010). - Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R.
Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013). - Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer's disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. Drosophila Protocols. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).