Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T4 Bakteriofag og E. coli-interaktion i murintarmen: En prototypisk model til undersøgelse af værtsbakteriofagdynamik in vivo

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65906
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

Summary

Bakteriofager (fager), vira, der inficerer bakterier, er en integreret bestanddel af tarmmikrobiomet. Selvom disse symbiotiske indbyggere driver bakteriel fitness og befolkningsdynamik, forstås der lidt om, hvordan de påvirker tarmhomeostase og sygdom. Denne protokol studerer isolerede T4-fager inden for en musemodel, der kan tilpasses andre fagbakteriepar.

Abstract

Bakteriofager (fager) er vira, der inficerer bakterier med arts- og stammeniveauspecificitet og er de mest rigelige biologiske enheder på tværs af alle kendte økosystemer. Inden for bakterielle samfund, såsom dem, der findes i tarmmikrobiotaen, er fager impliceret i regulering af mikrobiotapopulationsdynamik og driver bakteriel udvikling. Der har været fornyet interesse for fagforskning i det sidste årti, delvis på grund af lytiske fagers værtsspecifikke dræbende evner, som tilbyder et lovende værktøj til at imødegå den stigende trussel fra antimikrobielt resistente bakterier. Desuden tyder nylige undersøgelser, der viser, at fager klæber til tarmslim, på, at de kan have en beskyttende rolle i at forhindre bakteriel invasion i det underliggende epitel. Det er vigtigt, ligesom bakterielle mikrobiomer, at forstyrrede fager har været forbundet med forværrede resultater i sygdomme som inflammatorisk tarmsygdom. Tidligere undersøgelser har vist, at fager kan modulere mikrobiomet hos dyr og mennesker gennem fækale filtrattransplantationer, hvilket gavner værtsens helbred. Med denne nylige bølge af forskning kommer nødvendigheden af at etablere og standardisere protokoller til undersøgelse af fager i forbindelse med tarmmikrobiomet. Denne protokol indeholder et sæt procedurer til undersøgelse af isolerede T4-fager og deres bakterielle vært, Escherichia coli, i forbindelse med mave-tarmkanalen i murin. De metoder, der er beskrevet her, skitserer, hvordan man starter fra et faglysat, administrerer det til mus og vurderer effekter på bakteriel vært og fagniveauer. Denne protokol kan modificeres og anvendes på andre fagbakteriepar og giver et udgangspunkt for at studere værtsfagdynamik in vivo.

Introduction

Bakteriofager eller fager er vira, der inficerer og dræber bakterier med arts- og stammeniveauspecificitet1. Fager spiller vigtige roller inden for komplekse bakteriesamfund som tarmmikrobiotaen, hvor de har været impliceret i regulering af populationsdynamik og kørsel af bakteriel fitness2. I løbet af det sidste årti har der været fornyet interesse for fagforskning på grund af stigningen i antimikrobielt resistente patogener3 og potentialet for fagterapi som en alternativ behandlingsstrategi. I de senere år er lytiske fagcocktails blevet brugt intravenøst med en vis succes i alvorlige, antibiotikaresistente bakterielle septiske infektioner hos mennesker 3,4. Oral fagterapi er også blevet foreslået som et potentielt alternativ til antibiotika til behandling af tarminfektioner og betændelse. Desuden har fager været impliceret i succesen med fækale filtrattransplantationer (FFT), som er fækale mikrobiotapræparater, der er blevet filtreret for at fjerne bakterier, til behandling af tilbagevendende Clostridioides difficile-infektion (rCDI)5,6, inflammatoriske tarmlidelser (IBD)7,8 og nekrotiserende enterocolitis hos for tidligt fødte svin9. I betragtning af disse resultater er det vigtigt at overveje interaktioner både mellem fager og tarmmikrobiota og fager og pattedyrværten, da tilføjelsen af nye fager til et allerede eksisterende samfund kan have indirekte virkninger på samfundet som helhed og ikke kun dets målbakterier 2,10.

Undersøgelsen af faginteraktioner med deres målbakterier in vitro har vist sig nyttig til at forstå mekanismerne og virkningerne af- og bakterieinteraktioner i tarmen. I denne indstilling har det vist sig, at Escherichia coli-specifikke T4-fager af ordren Caudovirales kræver immunoglobulin (Ig) -lignende domæner placeret inden for stærkt antigene ydre capsid (Hoc) proteiner på virionoverfladen for at klæbe til tarmslim11. Derudover har transwell-assays vist, at T4-fager er i stand til at interagere med epitelcellekulturer og translokere gennem cellelag ved makropinocytose12,13. Disse resultater understøtter hypotesen om, at fager kan interagere med deres metazoiske vært, selvom de ikke er i stand til at inficere eukaryote celler. Disse modeller, selvom de er nyttige, mangler hele spektret af komplekse interaktioner, der forekommer i et tarmøkosystem, der er nødvendige for en omfattende udforskning af trepartsinteraktionen mellem fager, bakterier og metazoanværten.

Musemodeller er et vigtigt redskab til at undersøge fager i komplekse miljøer. En ønskelig anvendelse af fagadministration er som en alternativ strategi til behandling af antimikrobielt resistente infektioner eller patobionter forbundet med kroniske inflammatoriske sygdomme, herunder IBD. Ny litteratur antyder imidlertid, at fagadfærd in vitro ikke fuldt ud repræsenterer in vivo-funktioner. Buttimer et al.14 demonstrerede, at en fagcocktail var i stand til at nedbryde de målrettede bakterier i et forenklet humant mikrobiotakonsortium in vitro, men kunne ikke replikeres in vivo i gnotobiotiske mus koloniseret med det samme bakteriefagkonsortium. Desuden førte T7-i et konventionelt musemikrobiom til selektiv udtømning af dets måltarmbakterier, selvom gradvis genopretning blev observeret over tid, hvilket tyder på udviklet resistens15. Andre undersøgelser har vist sameksistens af oralt administrerede fager og deres målbakteriestammer in vivo 2,16. Ud over/bakterie-sameksistens førte fagadministration faktisk til udbredte ændringer i den samlede sammensætning og funktion af mikrobiotasamfundet 2,16. Dette er relevant i sygdomsindstillinger, da flere undersøgelser har fundet sammenhænge mellem øget relativ overflod af Caudovirales og IBD 7,8,17, der var uafhængige af ændringer i bakteriel overflod7. Det er fortsat ukendt, om dette er en driver eller konsekvens af sygdomspatogenese.

Det historiske fokus for fagundersøgelser har været omkring forholdet mellem en og dens målbakterie. Det er dog også vigtigt at overveje potentielle interaktioner mellem og slimhinden, epitelet og immunsystemet hos metazoværten. Disse interaktioner spiller alle en vigtig rolle i det samlede respons på tarmfaginfektion. For at demonstrere dette er fager blevet undersøgt ved hjælp af bakteriefrie (GF) mus for at belyse deres indvirkning på immunsystemet uden interferens fra mikrobiota8. I dette system blev fagnukleinsyrer påvist af tolllignende receptorer (TLR'er) placeret i endosomer af fagocytiske immunceller (makrofager og dendritiske celler). Dette aktiverede downstream-signalering og stimulerede T-celleafhængig produktion af interferon (IFN)-γ8 eller type I IFN'er18. Desuden implicerede Fluckiger et al.19 hukommelses CD8 + T-celler i genkendelsen af fagkodede (prophage) antigener, hvilket resulterede i T-cellekrydsreaktivitet med tumorantigener, hvilket resulterede i reduceret tumorbyrde. Endelig er fagspecifik antistofproduktion blevet dokumenteret i musestudier, hvor fager blev leveret til dyremodeller kontinuerligt gennem drikkevand 8,20 eller ved gentagen oral sonde over flere måneder20, hvilket demonstrerer fagproteiners evne til at fremme humorale immunresponser. Selvom disse former for faginokulation giver mulighed for optimal og kontinuerlig priming af immunsystemet, repræsenterer de muligvis ikke de naturligt forekommende interaktioner mellem fager og tarmmiljøet eller kinetikken ved oralt anvendt fagterapi. Indtil videre har et begrænset antal undersøgelser undersøgt interaktionerne mellem og en enkelt bakterieart i monokoloniserede musemodeller21. Imidlertid viste monokoloniserede mus sig kritisk til at dechiffrere mikrobespecifikke virkninger af individuelle arter på gastrointestinal (GI) kanal og immunudvikling 22,23,24, og de kan endnu vise sig nyttige til forståelse af trepartsinteraktioner mellem fager, deres målbakterier og metazoanværten.

Spændende nok er der stadig meget at lære om interaktionerne mellem tarmfag og tarmkommensale bakterier samt de interaktioner, der opstår mellem metazoværten og de fager, der bor i den. Denne protokol indeholder et sæt procedurer til undersøgelse af isoleret T4-og dets bakterielle modstykke, E. coli (K-12, BW25113), ved hjælp af en gnotobiotisk musemodel. Disse standardiserede procedurer giver også et fundament for optimering af andre/bakteriedyader ved at tilpasse vækstparametrene til de interessante par. De her beskrevne metoder skitserer: (1) Fremstilling af T4-og køretøjslysater til oral sonde af mus; (2) Oral administration af T4-til E. coli monokoloniserede gnotobiotiske mus; (3) Overvågning af T4-fagniveauer i museafføring og væv over tid.

For de repræsentative resultater, der præsenteres her, blev oprensede T4-faglysater formeret fra fagbanklagre, der blev vedligeholdt af Rohwer Lab. Phage-on-Tap-metoden til formering af T4-blev tilpasset25, som der henvises til i denne protokol. Metoden giver høje titer, endotoksin-lave fagbestande inden for tre dage. Ved hjælp af denne tilgang blev der rutinemæssigt indsamlet 10 ml ≥ 1010 plakdannende enheder (pfu) / ml T4-med < 0,5 endotoksinenheder (EU) / ml. De anbefalede endotoksinniveauer til oral eller intravenøs administration i mus er henholdsvis ≤ 20 EU / ml og ≤ 5 EU / kg / time (eller 0,1 EU administreret over 1 time for en 20 g mus), hvilket gør dette til en egnet metode til fagforberedelse til in vivo-podning . Alle fagstammer blev opbevaret ved 4 °C i saltvandsmagnesiumbuffer (SM) (opskrift i trin 1.1.5.1). E. coli blev dyrket i LB-medier. For forskellige-bakteriepar kan forskellige kulturmedier og vækstbetingelser tilpasses fra denne protokol. Fager kan også hentes fra miljøet, såsom spildevand, havvand, jord og tarmindhold og kan isoleres og renses i henhold til Sambrook og Russell26 inden forberedelse ved hjælp af passende vækst- og formeringsbetingelser for hvert-værtsparaf interesse 25. Alternativt kan fager fås fra kommercielle kilder (se materialetabel) eller fra fagbanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne fra UBC Animal Care Committee og Biosafety Committee-godkendte protokoller (A23-0113, B19-0038). Mus blev anbragt på University of British Columbia under patogenfrie forhold på Center for Disease Modelling. C57BL/6-mus blev opdrættet i anlægget i en steril fleksibel filmisolator, forsynet med steril musediæt, vand, strøelse og redemateriale. Musene blev opretholdt på en 12 timers dag/nat cyklus. Forsøgsmus, både han- og hunmus, blev aldersmatchet inden for hvert eksperiment, mellem 6 og 12 uger gamle og vejede 15-30 g for alle forsøg.

1. Klargøring af- og vehikellysater til oral sonde i mus

  1. Fagrensning og lagergenerering
    BEMÆRK: I denne undersøgelse dyrkes og titeres T4-fager ved plettering på en græsplæne af bakterier ved hjælp af enkeltagarlagsmetoden, beskrevet nedenfor. Dobbeltagarlagsmetoden er tidligere beskrevet25,27og kan også bruges med lignende effektivitet. Enkeltagarlagsmetoden blev valgt til denne protokol, da den giver forbedret plaquesynlighed28.
    1. E. coli dyrkes i 5 ml sterile LB-medier i sterile polystyren- eller glaskulturrør (med hætter). Der inkuberes reagensglas ved 37 °C ved omrystning ved 200 o/min natten over, indtil den stationære fase er nået.
    2. Forbered blød agar i en glasmedieflaske ved autoklavering af LB med 0,5% agar og afkøling til 50 °C eller derunder (mens den forbliver en væske) inden tilskud. Forbered nok blød agar til 15 ml pr. Plade.
    3. Blød agar suppleres medMgSO4 ogCaCl2 til en slutkoncentration på 1 mM for hver. Der tilsættes 100 μL E. coli-kultur natten over for hver 3 ml blød agar. Rør forsigtigt ved hjælp af en magnetisk omrøringsstang for at homogenisere kosttilskud og kultur i blød agar.
      BEMÆRK: Konsistens i volumen og densitet af E. coli , der tilsættes til det bløde agarpræparat, er kritisk (skitseret i afsnittet om repræsentative resultater).
    4. Der tilsættes 15 ml blød agar + E. coli pr. petriskål (diameter 15 cm) ved hjælp af en serologisk pipette. Lad pladerne sætte sig ved stuetemperatur til brug samme dag.
      BEMÆRK: Pladerne sættes på ca. 20 minutter med lågene åbne. Agaren forbliver blød, men skifter ikke, når pladerne vendes om.
    5. Forbered 8-10 serielle fortyndinger af kilden T4-i faktorer på 10 ved fortynding i SM-buffer. Der anbringes 5 μL af hver fortynding på pladerne. Lad pletterne tørre, vende og udruge pladerne ved 37 °C natten over.
      1. For at forberede saltvandsmagnesium (SM) fagbuffer opløses 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4·7H2O og 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) i 1 liter deioniseretH2O. Autoklave og opbevares ved stuetemperatur.
        BEMÆRK: Den næste dag skulle E. coli være vokset til en græsplæne i hele den bløde LB agar. Plaques eller ryddede vækstområder, der er synlige i E. coli-plænen, vises, hvor fagdrab på inficerede E. coli-værter fandt sted. Hver plak repræsenterer en plakdannende enhed (pfu).
    6. Vælg en enkelt plak fra den bløde agarplade ved at skubbe en steril pipettespids ind i midten af plaketten, hvilket skaber en agarprop i enden af spidsen. Opslæmp plakproppen igen i 1 ml SM-buffer i et 1,7 ml mikrocentrifugerør. Vortex røret ved maksimal hastighed i 1 min for at blande.
    7. Centrifuger røret ved 4000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at fjerne snavs fra lysatet. Supernatanten overføres til et nyt mikrocentrifugeglas.
    8. Gentag trin 1.1.1-1.1.3 for at formere den isolerede. Der tilsættes 100 μL af den isolerede til en 15 ml prøve blød agar indeholdende E. coli i et konisk rør. Vend røret tre gange for at blande og hæld agaren i en petriskål.
    9. Lad pladerne tørre, før de vendes og inkuberes natten over ved 37 °C. Forbered en plænekontrolplade uden for at bekræfte E. coli-levedygtighed .
      BEMÆRK: Efter inkubation natten over skal kontrolpladen have en græsplæne af E. coli , mens den fagholdige plade skal lyseres fuldstændigt.
    10. For at trække fagen ud af pladen tilsættes 5 ml SM-buffer til overfladen af den fagrensede plade og rystes ved 70 o / min på en vippe i 15 minutter ved stuetemperatur.
    11. Bufferen fra pladen opsamles i et 50 ml konisk centrifugerør og centrifugeres ved 4000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at pelletere eventuelt snavs fra agarpladen.
    12. T4-fagstamlysatet opsamles i et nyt glas og opbevares ved 4 °C indtil titrering og formering.
      BEMÆRK: T4-fager er stabile i over 10 år25; Stabiliteten afhænger dog af typen af og opbevaringsforhold. Phage titer vil også variere med opbevaringstid. Fager er følsomme over for frysning. Derfor anbefales kryopræservering i flydende nitrogen og undgå fryse-optøningscyklusser, da dette kan beskadige fager, hvilket reducerer fagtiter25.
    13. T4-fagstammen lyseres for at bestemme koncentrationen i pfu/ml som tidligere beskrevet 25,29,30. En T4-fagbestand med høj titer indeholder 108 pfu/ml eller mere.
  2. Fremstilling af eksperimentelle faglysater
    1. Kultur E. coli i 5 ml LB-medier i sterile polystyren- eller glaskulturrør (med hætter). Der inkuberes reagensglas natten over ved 37 °C under omrystning ved 200 o/min, indtil den stationære fase er nået.
    2. Subkultur natten over E. coli kultur 1:50 i 100 ml LB medier i en glas konisk kolbe. Der inkuberes ved 37 °C under omrystning ved 200 omdr./min., indtil bakterierne har nået tidlig til midteksponentiel fase (ca. 1,5 time).
      BEMÆRK: En indledende vækstkurve kan udføres for at bestemme den optiske densitet ved 600 nm (OD600) område, hvor bakteriekulturen er i eksponentiel fase. Kultur i et konisk glasrør foreslås, da nylige beviser har vist, at fager er i stand til at klæbe til plast som polypropylen31.
    3. Fra trin 1.1 tilsættes 100 μL af T4-fagstammen med høj titer til E. coli-subkulturen og inkuberes ved 37 °C under omrystning i 3 timer, eller indtil det nye lysat ikke længere er uklart. T4-faglysatet opsamles i 50 ml koniske rør, og der foretages enten direkte oprydning eller opbevares om nødvendigt ved 4 °C indtil næste dag.
      BEMÆRK: En større fagbristestørrelse (hvilket indikerer et højere gennemsnitligt antal virioner frigivet pr. replikationscyklus) nødvendiggør en længere inkubationsperiode for bakteriesubkulturen i trin 1.2.2. Dette giver øget bakterietæthed før spiking med fagbestande.
    4. Centrifuger lysater ved 4000 x g i 20 minutter ved stuetemperatur for at pelletere eventuelle resterende bakterier og celleaffald. Den resulterende supernatant filtreres med et 0,22 μm nylonfilter, og filtratet overføres til nye 50 ml koniske centrifugeglas.
    5. Tilsæt 0,1 volumener chloroform til hvert volumen filtreret T4-faglysat for at dræbe eventuelle resterende bakterier og forhindre bakterievækst. Vortex kort for at blande og inkubere ved stuetemperatur i 10 min.
      BEMÆRK: Lipidindhyllede fager er følsomme over for chloroform, hvilket kan reducere fagtiter25. Spring dette trin over, hvis det er nødvendigt.
      FORSIGTIG: Chloroform er et giftigt organisk opløsningsmiddel, der er farligt, når det indåndes, indtages eller absorberes gennem huden. Brug en stinkhætte og passende personlige værnemidler, når du arbejder med chloroform. Brug glas i stedet for serologiske pipetter af polystyren, når du arbejder med chloroform, da det ikke er kompatibelt med de fleste plasttyper. Chloroform kan anbringes i koniske polypropylencentrifugeglas i trin 1.2.5-1.2.6, men bør ikke opbevares på lang sigt i plastrør.
    6. Centrifuger lysatet ved 4000 x g i 5 minutter ved stuetemperatur for at adskille chloroformen fra lysatet. Brug en serologisk pipette til forsigtigt at overføre det øverste lysatlag til et nyt 50 ml konisk rør uden at forstyrre det underliggende chloroformlag. Kassér chloroformaffaldet i den relevante beholder til farligt flydende affald. Lysater opbevares ved 4 °C, indtil koncentrationen og bufferudvekslingen finder sted den følgende dag.
    7. Koncentrer faglysater i en 100 kDa centrifugalfilteranordning (se materialetabel) ved at tilsætte 13 ml faglysat til enhedens øvre reservoir og centrifugere ved 4000 x g i 5 minutter, eller indtil det meste af lysatet har passeret gennem filteret ind i det nedre reservoir.
      BEMÆRK: Målet er at have ca. 2 ml lysat i slutningen af centrifugeringstiden. Da fagkoncentrationen stiger i filteret med tilsætning af lysat, vil spintiderne sandsynligvis stige. Centrifugalfilteranordninger har et fysisk dødt stop for at forhindre dem i at spinde tørt32. Lad ikke filtermembranen tørre ud, hvis fortsat brug er tilsigtet (dvs. ved at fjerne al væske fra det øverste reservoir). Spin tider kan variere afhængigt af type og titer.
    8. Brug en P200- eller P1000-pipette til forsigtigt at pipette de resterende ~2 ml lysat op og ned i det øverste reservoir for at rense filtermembranen efter hvert spin. Kassér filtratet fra det nedre reservoir i en affaldsbeholder, og efterlad den koncentrerede i det øvre reservoir.
    9. Trin 1.2.7-1.2.8 gentages, indtil hele volumenet faglysat er passeret gennem filteranordningen, med ~2 ml koncentreret tilbageholdt i den øverste beholder efter hver centrifugering.
    10. Fjern filtermembranen efter sidste centrifugering ved at pipettere det resterende lysat (~2 ml) i det øverste reservoir op og ned. Vask fagen (bufferbytning) ved at tilsætte 12 ml SM-buffer til det øvre reservoir og centrifuger ved 4000 x g i 10 minutter, eller indtil det meste af bufferen har passeret gennem filteret.
    11. Filtratet kasseres, og vasketrinnet gentages (trin 1.2.10). Resuspender de resterende 2 ml lysat i SM-buffer til et slutvolumen på 10 ml (eller mindre) til langtidsopbevaring. Overfør lysatet til et 50 ml konisk centrifugerør og opbevar ved 4 °C, indtil endotoksinet fjernes.
      BEMÆRK: Det er valgfrit at titere fagen på dette stadium for at sikre, at faglysatet er koncentreret (> 108 pfu / ml) og for at bestemme fagtab under endotoksinfjernelsesprocessen.
    12. Fjern forurenende endotoksiner fra T4-faglysatet ved at tilsætte 0,4 volumener 1-octanol (se materialetabellen) til det samlede volumen lysat.
      BEMÆRK: Endotoksiner fjernes, da de er stærkt immunstimulatoriske, og derfor kan deres tilstedeværelse føre til induktion af et faguafhængigt medfødt immunrespons25.
      FORSIGTIG: 1-Octanol er en aromatisk, organisk, brandfarlig forbindelse med stærk lugt og er øjenirriterende. Brug passende PPE, når du arbejder med 1-oktanol. Udfør alt arbejde i en stinkhætte for at undgå dampindånding. Brug tætningsfilm for at forhindre lækage af rør, når du arbejder uden for stinkdækslet.
    13. Luk låget på det koniske centrifugerør med tætningsfilm for at forhindre lækage. Omrystes ved 120 o/min på en platform eller gyngeryster ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af inkubation ved 4 °C i 1,5 timer uden omrystning.
    14. Der centrifugeres ved 4000 x g i 10 minutter for at adskille det endotoksinrensede lysat fra 1-oktanolen. 1-oktanollaget flyder oven på lysatet. Brug en P1000-pipette til forsigtigt at fjerne så meget 1-octanol som muligt og kassere det i den passende beholder til farligt/brændbart flydende affald.
    15. Brug en 18 G kanyle og 10 ml sprøjte til at opsamle faglysatet under det resterende 1-oktanollag, og pas på ikke at opsamle 1-oktanollaget. Lysat opbevares ved 4 °C indtil hastighedsvakuum.
    16. Overfør 1 ml alikvoter T4 faglysat til sterile 1,5 ml mikrocentrifugeglas. Hastighedsvakuum med låg åbne ved 4000 x g ved stuetemperatur for at fordampe resterende 1-octanol fra lysatet. Hastighedsvakuum i 3 timer, eller indtil faglysatvolumenet er reduceret med 30%25. Opbevares ved 4 °C indtil titrering.
    17. Titer faglysatet for at bestemme koncentrationen i pfu/ml. Fortynd det resulterende T4-faglysat i SM-buffer til den ønskede koncentration og re-titer for at bekræfte.
    18. Kvantificer endotoksiner, der er til stede i T4-faglysatet ved hjælp af et kromogent endotoksinkvantificeringssæt i henhold til producentens instruktioner (se materialetabel). Sammenlign endotoksinniveauer i det endelige faglysat med en prøve til fjernelse af præendotoksin, køretøjskontrol, buffer og drikkevand til mus.
      BEMÆRK: Det kromogene endotoksinkvantificeringssæt inaktiveres af 1-octanol25. Udfør hastighedsvakuumtrin for at fjerne 1-octanol (trin 1.2.16), før endotoksiner kvantificeres. Endotoksinindholdet i destilleret vand anslås til 20 EU/ml25; Endotoksinindholdet i drikkevand fra mus kan dog variere fra anlæg til anlæg. Hvis endotoksinniveauerne i faglysatet overstiger den mængde, der er til stede i drikkevand, skal du overveje at gentage endotoksinfjernelsestrin (1.2.12-1.2.16).
    19. Opbevar koncentrerede, endotoksin-clearede T4-faglysater i SM-buffer ved 4 °C.
  3. Fremstilling af fagfrit bakterielysat til køretøjskontrol
    BEMÆRK: Et fagfrit bakterielysat kan fremstilles som et køretøj til kontrol af eventuelle virkninger på grund af bakterielle forurenende stoffer (f.eks. Endotoksin), der genereres i produktionen af faglysat i trin 1.2, hvilket kan påvirke eksperimentelle resultater, når det podes i mus.
    1. Fra en natkultur af E. coli, subkultur E. coli 1:50 til 100 ml LB-medier. Uden tilsætning af fortsættes med at dyrke bakterierne, mens de rystes ved 37 °C i 3 timer, eller inkubationstiden for faglysatet produceret i trin 1.2.
    2. Overfør E. coli-kulturen til 50 ml koniske rør og lysér celler ved hjælp af en sonikatorsonde (se materialetabel) på is ved 30 kHz for 30 s impulser (3x) for manuelt at lyse bakterieceller.
    3. Følg resten af protokollen i henhold til trin 1.2, startende ved trin 1.2.4, inklusive alle trin til oprydning, vask og fjernelse af endotoksin.
      BEMÆRK: Under koncentrering ved hjælp af centrifugalfilteranordningen vil køretøjets lysat strømme hurtigere gennem filteret end faglysatet på grund af fraværet af. Forkort derfor centrifugeringstiderne fra 5 minutter til 2-5 minutter for at sikre, at ultrafiltermembranen ikke tørrer ud under langvarig centrifugering.
    4. Titer køretøjet lysat for at bekræfte, at det ikke indeholder.
    5. Brug et kromogent endotoksinkvantificeringssæt i henhold til producentens instruktioner til måling af endotoksinniveauer i køretøjets lysat. Fortynd køretøjets lysat i SM-buffer for at matche endotoksinniveauerne i faglysatet.
  4. Alternative eksperimentelle kontroller: fremstilling af varmeinaktiveret faglysat
    BEMÆRK: Et alternativ til det fagfrie bakterielysat er et varmeinaktiveret faglysat. Varmeinaktivering dissocierer fagvirioner, mens resterende endotoksiner såsom lipopolysaccharider (LPS) er varmestabile 8,33. Denne metode blev brugt af Gogokhia et al.8 til at bestemme, om intakte, levedygtige fagvirioner var nødvendige for immunaktivering. Forskere opfordres til at teste begge metoder (fagfri vs. varmeinaktiveret) og bestemme, hvilken kontrol der er mest hensigtsmæssig til deres eksperimentelle behov. Uanset hvad der vælges, er det vigtigt at erkende, at en bufferkontrol sandsynligvis ikke vil være hensigtsmæssig på grund af den betydelige manipulation, der kræves for at koncentrere og rydde op i en fagbestand.
    1. Det nødvendige volumen renset, renset og fortyndet T4-faglysat overføres fra trin 1.2 (100 μL pr. mus) til sterile mikrocentrifugeglas udstyret med låglåse.
    2. Varme lyserer på en varmeblok ved 95 °C i 15 min16.
    3. VALGFRIT: Hvis fjernelse af/bakterienukleinsyrer er påkrævet, skal DNase I- og RNase A-behandling udføres i henhold til Jakočiūnė og Moodley34. Kort:
      1. Der tilsættes 50 μL DNase I 10x buffer, 1μL DNase I (1 E/μL) og 1 μL RNase A (10 mg/ml) (se materialetabel) til 450 μL varmeinaktiveret faglysat.
      2. Der inkuberes lysater ved 37 °C i 1,5 time i en varmeblok uden omrystning.
      3. DNase I og RNase A inaktiveres ved tilsætning af 20 μL 0,5 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA)34.
    4. Hold lysater ved stuetemperatur i 10 minutter for at afkøle og kombinere lysater, hvis der anvendes flere rør. Opbevares ved 4 °C indtil titrering.
    5. Udfør en fagtiter for at bekræfte, at der ikke er nogen levedygtig T4-til stede i lysatet. Varmeinaktiverede lysater opbevares ved 4 °C.
    6. Brug et kromogent endotoksinkvantificeringssæt i henhold til producentens instruktioner til at måle endotoksinniveauer i det varmeinaktiverede lysat. Fortynd det varmeinaktiverede lysat i SM-buffer i henhold til endotoksinniveauerne i det matchede faglysat.

2. Administration og overvågning af T4-i E. coli monokoloniserede mus

  1. Monokolonisering af mus med E. coli
    1. Forbered E. coli til administration i GF-mus8 ved at dyrke E. coli plukket fra en enkelt koloni i LB-medier natten over.
    2. Under strenge, sterile forhold35 administreres 200 μL E. coli-dyrkning til GF-mus, der er anbragt i enten sterile vinylisolatorer eller bioudelukkelse lufttætte bure med oral sonde. Hvis der anvendes aerotolerante bakterier, kan mus også koloniseres ved anvendelse af 200 μL bakteriekultur på bagsiden af hver mus.
      BEMÆRK: Podningsdosis vil være belastningsafhængig, da forskellige bakterier udviser forskellig pH-overlevelsesevne36,37. Zucoloto et al.35 anbefaler podning med 1 x 108 cfu pr. dyr. Repræsentative resultater vist her blev genereret fra mus podet med en kultur natten over (CFU blev ikke bestemt). Pilotforsøg kan udføres for at bestemme en dosis, der resulterer i pålidelig kolonisering af musestammen af interesse. Mængden af bakterier, der skal administreres med oral sonde, kan påvirkes af musenes alder og vægt. Konsulter individuel laboratorie- eller institutionel dyreetisk protokol for maksimalt tilladte doser. Den mængde, der foreslås her, er baseret på en sondegodtgørelse på 10 % af musens kropsvægt (f.eks. højst 200 μL for en mus på 20 g). Nogle bakteriearter tolererer ikke surhedsgraden i maven og undlader at kolonisere tarmen. Overvej først at gavle med 100 μL 1 M NaHCO3 for at neutralisere mavesyrer2. Hvis der anvendes en streng anaerobe til kolonisering, skal mikroben dyrkes under anaerobe forhold og overføres til det gnobiotiske dyreanlæg i individuelt forberedte lufttætte beholdere (1 for hver mus). Udfør hver sonde hurtigt, når beholderen er åbnet for at begrænse tab af mikrobiel levedygtighed på grund af ilteksponering.
    3. Overvåg mus for sundhedsskadelige virkninger.
      BEMÆRK: I tilfælde af sundhedsskadelige virkninger henvises til de standarder, der er fastsat af den relevante dyreplejefacilitet. Mulige sundhedsskadelige virkninger omfatter, men er ikke begrænset til: (1) Aspiration af sondevæske: symptomer omfatter udvisning af bobler via næsen, "åben mund" vejrtrækning / gisp. (2) Perforering af spiserøret: symptomer omfatter hurtigt skrantende helbred, hunching, sløvhed, hvilket fører til dyrets død inden for 24 timer. (3) Betændelse i spiserøret på grund af gentagne gavager: symptomer omfatter vanskeligheder med at indsætte sondenålen. (4) Diarré på grund af ændringer i mikrobiomet.
    4. Bekræft bakteriel kolonisering i fækale pellets ved dyrkning mindst en gang om ugen og / eller ved 16S rRNA-sekventering35.
      BEMÆRK: Hvis kolonisering af opdrættere inden for en gnotobiotisk isolator til produktion af forsøgsmus, skal du planlægge mindst 9 uger i forvejen for generering af 6 uger gamle første generation af afkom (F1) eksperimentelle mus. Alternativt kan GF voksne mus monokoloniseres. I denne tilgang anbefales det at vente 7 uger efter kolonisering før fagpodning, da dette er den tid, der er nødvendig for tarmslimhinden at stabilisere sig efter introduktion af en kompleks mikrobiota i GF-mus38.
  2. Oral podning af T4-i E. coli monokoloniserede mus
    1. T4-faglysater og køretøjskontroller fortyndes til en forudbestemt koncentration i SM-buffer. I henhold til Hsu et al.2, fortynd faglysater for at muliggøre administration af 2 x 106 pfu pr. mus2.
      BEMÆRK: En højere eller lavere koncentration af kan anvendes afhængigt af fagens stabilitet in vivo. Doser på 2 x 102, 2 x 104 og 2 x 106 pfu T4 pr. mus resulterede i stabil og langvarig kolonisering i tarmen, der ikke syntes at være dosisafhængig (vist i afsnittet om repræsentative resultater). Fagbakteriekinetik bør derfor piloteres in vivo forud for storskalaforsøg.
    2. Under sterile, gnotobiotiske forhold sondes hver mus med 100 μL autoklaveret 1 M NaHCO3 for at neutralisere mavesyrer. Vent 10 minutter, og lad derefter med 100 μL T4 faglysat eller køretøjsstyring.
    3. Overvåg mus for sundhedsskadelige virkninger.

3. Overvågning af T4-fagniveauer in vivo

BEMÆRK: Når mus er blevet podet med, kan koncentrationen af både fager og målbakterier måles i fækale eller vævsprøver. Dette giver information om kinetikken af faginfektionen og koloniseringsdynamikken hos begge organismer.

  1. Spotplettering T4 for at bestemme koncentrationen i fækale pellets
    1. Saml fækale pellets fra hver mus i sterile, forvejede mikrocentrifugerør for at måle T4 og E. coli niveauer. Opbevar rør på is indtil plettering.
      BEMÆRK: Placer prøver på is i mellemtiden mellem opsamling og plettering for at bremse væksten af aerotolerante bakterier. Over flere timer kan der stadig være vækst af aerobe bakterier eller en vis død af anaerobe bakterier på grund af ilteksponering, hvilket kan føre til skæve bakterietal. Derfor bør bakterier og fagbelægning udføres så hurtigt som muligt efter prøveindsamling. Obligatoriske anaerobe bakterier tolererer ikke ilteksponering. For at konservere prøven opsamles prøverne i forseglede rør og overføres til et anaerob kammer hurtigst muligt efter indsamlingen. Hvis der ikke påvises vækst i fækale prøver, skal du overveje alternativer såsom 16S rRNA qPCR til bakteriel kvantificering.
    2. De endelige vægte af hvert rør registreres, og prøvevægten beregnes ved at trække den oprindelige slangevægt fra. Dette vil blive brugt til normalisering af T4-- og E. coli-koncentration til prøvevægt (henholdsvis pfu / g eller cfu / g).
    3. Tilsæt 1 ml steril SM-buffer til hvert rør og hvirvel grundigt ved maksimal hastighed (>1 min) for at homogenisere fækale pellets. Hvis prøven er mindre end 15 mg, kan der tilsættes en mindre mængde SM-buffer. Mængden af SM-buffer, der tilsættes hver prøve, registreres til beregning af cfu/g eller pfu/g af prøven.
    4. Der fremstilles en serie på 8 (eller flere afhængigt af den forventede fagkoncentration) serielle fortyndinger på 20 μL af hver prøve i 180 μL SM-buffer i faktorer på 10. Hver homogeniseret prøve blandes kort for at blande, inden den tilsættes til det første rør/hul. Pipette til blanding mellem hver tilsætning og skift spidser mellem hver fortynding for at forhindre oppustning af- eller bakterietællinger via prøveoverførsel.
      BEMÆRK: Hvis fibre og snavs i prøven forhindrer pipettering, tilsættes yderligere buffer til fækalopslæmningen for yderligere at fortynde stamprøven.
    5. Der anbringes spot 5 μL af hver fortynding på bløde LB-agarplader indeholdende E. coli (til fagplakassays) eller LB-agarplader (1,5 % agar til bakteriekolonianalyser) for at bestemme koncentrationen af T4-og E. coli i hver prøve. For nøjagtighed skal du se hver prøve i tre eksemplarer.
      BEMÆRK: Ved fremstilling af serielle fortyndinger i en plade med 96 huller kan en 8-kanals P20-multikanalpipette anvendes til at pipette hver kolonne af serielt fortyndet prøve på plader. Skift spidser mellem hver fortynding, selvom de flyttes fra mest fortyndet til mest koncentreret, da fagen kan klæbe til pipettespidsens vægge og ændre mængden af, der tilsættes hvert nyt hul31.
    6. Lad hvert sted tørre, før du vender pladen og placerer den i inkubatoren. Der inkuberes natten over ved 37 °C.
    7. For hver prøve vælges den fortynding, hvor der er 3-30 tællelige plaques pr. Spot. Tæl og registrer antallet af plaques på stedet og den anvendte fortynding.
    8. Prøvens pfu/g beregnes ved at dividere antallet af plaques med det volumen, der er belagt på hvert sted for at give pfu/μL. Dette multipliceres med fortyndingsfaktoren og med volumenet af SM-buffer, der tilsættes hver prøve for at give pfu/prøve. Til sidst divideres prøvevægten med pfu/g30.
      Equation 1
      Equation 2
  2. Vævsprøvetagning ved forsøgsendepunkter
    1. På hvert valgt tidspunkt aflives mus i henhold til godkendt institutionel dyreetisk protokol og indsamler cecalindhold, indhold af små og store tarme og ethvert væv af interesse i sterile, vejede 2 ml rundbundede mikrocentrifugerør.
    2. De endelige vægte af hvert glas registreres for at beregne prøvevægten. Opbevar væv og cecalindhold på is indtil samme dag plettering.
    3. Tilsæt steril SM-buffer til hvert rør, og registrer de tilsatte mængder.
    4. For cekal- og tarmindhold udtages hvirvelprøver grundigt (>1 min) i henhold til trin 3.1.3.
    5. Til vævsprøver tilsættes en steril metalperle til hvert rør. Væv homogeniseres ved hjælp af en vævslyser (se materialetabellen) ved 20 Hz i 5 minutter, eller indtil vævene er dissocieret, og suspensionen er homogen.
      BEMÆRK: Hvis prøver ikke homogeniseres godt, kan du overveje at øge mængden af tilsat SM-buffer, øge homogeniseringstiden eller øge homogeniseringsfrekvensen til 30 Hz. En vævshomogenisator kan også anvendes til at dissociere væv, samtidig med at der tillades bakteriel og faggendannelse39,40. Homogenisatorer betjenes ved højere frekvenser end vævslysatorer, samtidig med at bakterieintegriteten opretholdes.
    6. Der fremstilles serielle fortyndinger af hver prøve i faktorer på 10, og der udføres plettering for at bestemme E. coli - og T4-fagkoncentrationer i hver prøve som beskrevet i trin 3.1.4-3.1.841.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at undersøge interaktionerne mellem T4-fagen / E. coli-dyaden i murintarmen blev T4-og køretøjslysater forberedt, renset og renset (figur 1A). T4-faglysater blev titeret ved plaqueanalyse og fortyndet til 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/mus) i SM-buffer. Køretøjslysater blev også titeret for at bekræfte ingen levedygtig fagtilstedeværelse og fortyndet i samme volumen SM-buffer som T4-faglysatet. Endotoksinniveauer blev kvantificeret i fortyndede lysater ved anvendelse af et kromogent endotoksinkvantificeringssæt. T4-, varmeinaktiveret og køretøjslysater havde endotoksinniveauer under acceptable niveauer for drikkevand (<20 EU/ml)25 (figur 1B). Da køretøjets lysat havde en tilsvarende mængde endotoksin som T4-faglysatet, blev det anset for at være en passende kontrol. Det varmeinaktiverede faglysat (2 x 107 pfu/ml før varmebehandling) havde mindre endotoksin end både køretøjet og T4-faglysat. I henhold til kitinstruktionerne blev prøver, der var blevet 1-octanolbehandlet, testet for analysehæmning ved tilsætning af en endotoksinstandard til køretøjets lysat (spiked vehicle) for at give en endelig koncentration på 0,5 EU / ml. De spikede endotoksinniveauer i køretøjer minus køretøjsendotoksinniveauer målte 0,5 EU/ml ±25% i henhold til producentens anbefalinger (figur 1B). Dette viste, at 1-octanol blev fjernet med succes, og at der ikke var nogen assayhæmning forårsaget af lysaterne, der kunne forstyrre resultaterne af analysen.

E. coli K-12 (BW25113) monokoloniserede C57BL/6 mus blev opdrættet i en steril fleksibel filmvinylisolator under gnotobiotiske forhold (figur 2A). F0 generation mus blev koloniseret med E. coli gennem dets tilsætning til deres miljø og co-housing. Kun afkom (F1 og F2 generation), der blev koloniseret med E. coli fra fødslen gennem vertikal transmission og co-housing, blev brugt til forsøg. Denne strategi kontrollerede for ændringerne i immunsystemet, slimproduktionen og udviklingen af mave-tarmkanalen, der opstår som reaktion på bakteriel podning22,37, hvilket tillader måling af ændringer, der kun opstår på grund af fagintroduktion. Når de var modnet, blev forsøgsmus overført til sterile isocages, hvor de hver modtog 2 x 106 pfu T4-eller et tilsvarende volumen køretøjslysat ved oral sonde ved 6-8 ugers alderen. T4 og E. coli overflod blev overvåget over fire uger ved indsamling af fækale pellets og spot plating assays på enten 0,5% (blød) agar eller 1,5% agar, henholdsvis. I løbet af dette eksperiment var T4-og E. coli i stand til at eksistere sammen, uden at nogen af populationerne blev udtømt (figur 2B, C). Oral administration af T4-i lavere doser på 2 x 102 og 2 x 104 pfu/mus reducerede ikke T4-fagens evne til at kolonisere tarmen sammenlignet med 2 x 106 pfu (figur 2D). Tilsvarende blev der ikke observeret en dosisafhængig effekt af T4-podning på E. coli-niveauer (figur 2E).

Det er vigtigt, at konsistens i plettering mellem prøver viste sig at være afgørende for plaktællingen. For eksempel, når der tilsættes bakterier i blød agar, blev det bestemt, at tætheden af bakterier i høj grad påvirkede resultatet af analysen. Tilsætning af E. coli , der blev subkultureret i 1 time, 1,5 timer eller 2 timer, resulterede i lavere plaktal end med tilsætning af E. coli subkultureret i 2,8 timer eller mere. Desuden stabiliserede plakkvantificeringen sig ved ~ 1 x 109 pfu / ml, når E. coli blev subdyrket i 2,8 timer til 16 timer (natten over), hvilket var ca. en 5 gange stigning sammenlignet med værdien beregnet ud fra en 1 h subkultur (~ 2 x 108 pfu / ml) (figur 3A). I stedet for subkultur kan målbakterier podes i blød agar fra kulturer natten over. Her er volumenet af den 16 timer (natten over) E. coli-kultur , der blev podet i den bløde agar, påvirket plaque tæller (figur 3B). Disse resultater indikerer, at densiteten af E. coli i agar kan påvirke plaque assay tæller. I begge metoder plateauerede fagkvantificeringsresultaterne med samme værdi (109 pfu / ml), hvilket tyder på, at målbakterier skal have tilstrækkelig høj densitet i blød agar til at sikre plaktællingsnøjagtighed.

Samlet set understreger disse resultater vigtigheden af at udvikle en forståelse af-bakteriekinetik gennem in vitro og in vivo pilotforsøg, før der udføres eksperimentelle manipulationer.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling af faglysater. (A) Arbejdsproces til start af et faglysat fra en fagbestand med høj titer. Lysater blev formeret, renset, koncentreret, og endotoksiner blev fjernet. Forurenende 1-octanol blev fjernet ved hastighedsvakuum. B) Endotoksiner blev kvantificeret i- og køretøjslysater ved hjælp af et kromogent endotoksinkvantificeringssæt. Stiplede blå linjer angiver de øvre og nedre grænser for at modbevise produkthæmning i produkthæmningskontrollen (0,5 EU/ml ± 25%). Hvert punkt repræsenterer en af to tekniske replikater. Søjlehøjde repræsenterer middelværdien på tværs af replikater. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Generering af monokoloniserede mus og overvågning af- og bakterieniveauer i fækale pellets. (A) Arbejdsproces til kolonisering af kimfrie mus med en enkelt bakterieart og generering af F1 og F2 monokoloniserede mus. (B-E) Niveauer af T4 og E. coli påvist i fækale pellets af C57BL / 6 mus, der blev født monokoloniseret med E. coli og blev podet med T4 ved 6-8 uger gammel. På dag 0 (prækolonisering) og de angivne dage efter koloniseringen blev T4-fagniveauerne målt ved plettering og plakanalyser ved hjælp af enkeltagarlagsmetoden. E. coli-niveauer blev målt ved plettering på 1,5% LB agar. (B, C) Kinetik af (B) T4 og (C) E. coli niveauer i genvundne fækale pellets efter podning med 2 x 106 pfu af T4 eller køretøjslysat (normaliseret for volumen og endotoksinniveauer). (D, E) D) T4-- og E-E. coli-niveauer i genvundne fækale pellets efter podning med 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu eller 2 x 106 pfu T4-. Fejlbjælker repræsenterer middel- og standardfejl for middelværdien (SEM). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Fejlfinding af nøjagtighed i plakanalyser. (A) T4-faglysattiter ved anvendelse af E. coli-natkulturer eller subkulturer til blødt agarpræparat (0,5% agar, LB). Subkulturer blev fremstillet ved hjælp af en 1:50 fortynding af E. coli-kultur natten over til frisk LB. 5 ml bløde agarpræparater blev podet med 100 μL E. coli og 20 μL T4-. CaCl2 ogMgSO4 blev ikke tilsat blød agar til disse test, men kan tilsættes, hvis det ønskes. E. coli subkultur gange under 2,8 timer resulterede i en lavere tilsyneladende fagtiter. B) T4-faglysattiter med anvendelse af forskellige E. coli-densiteter i blødt agarpræparat. Tilsætning af forskellige mængder E. coli fra en kultur natten over (ikke subkultureret, som i A) i den bløde agar resulterede i forskellige tilsyneladende fagtitere. Fejlbjælker repræsenterer beregnet fagtiterusikkerhed. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Undersøgelsen af fager i mikrobiomet udgør en betydelig udfordring sammenlignet med deres bakterielle modstykker. Specifikt indeholder fager ikke en bevaret fylogenetisk markør, der er fælles for alle fager, der er beslægtet med 16S og 18S ribosomale underenheder, der muliggør let sekventering og identifikation af henholdsvis prokaryote og eukaryote arter42. Men med fremskridt inden for næste generations sekventeringsmetoder, herunder stigende læselængder, gennemstrømning og faldende omkostninger, kommer den hurtige udvidelse af bakteriofaggenomdatabaser 42,43,44. Med meget forarbejde i fagopdagelse godt i gang, er fagforskning nu mere tilgængelig end nogensinde. Som nøglemedlemmer af tarmmikrobiomet og de mest genetisk forskelligartede organismer på Jorden udgør fager en spændende vinkel for ny forskning, der undersøger mikrobiomets kompleksitet. De her beskrevne protokoller fokuserer på at undersøge kendte fagarter hos mus, der er koloniseret med deres målbakterier. Det skal bemærkes, at disse protokoller giver en retningslinje for at studere in vivo og kan udvides med feltets vækst.

Bakteriofagforskning til terapeutisk behandling af bakterielle infektioner faldt stort set ud af mode med fremkomsten af antibiotika i 1940'erne. Overordinering og misbrug af antibiotika har imidlertid fremskyndet fremkomsten af multiresistente patogener som et stort folkesundhedsproblem3. Fager udgør et attraktivt potentielt alternativ til antibiotika på grund af deres høje grad af værtsspecificitet3. Det er vigtigt, at da fager naturligt tager ophold som medlemmer af det menneskelige tarmmikrobiom, er det nødvendigt først at forstå de roller, som fager spiller i disse komplekse miljøer. Mens mange undersøgelser har undersøgt forholdet mellem en og dens målbakterier in vitro, er det vigtigt at overveje, hvordan disse forhold kan holde op inden for GI-kanalens landskab. Som i sonderende undersøgelser, der undersøger bakteriekomponenterne i mikrobiotaen, giver forenklede musemodeller som GF og monokoloniserede mus os mulighed for at isolere effekter af på dets målarter, og hvordan dette forhold bidrager til immunresponset. Dette er et vigtigt skridt i retning af fagterapi, da nogle fager måske ikke giver gavn, når de introduceres til tarmen. For eksempel forværrer Pseudomonas aeruginosa-fagen Pf4 sygdommen forårsaget af sin vært ved at hæmme både antibakterielle immunresponser og keratinocytmigration, hvilket resulterer i nedsat sårheling18,45. De procedurer, der er beskrevet her, sigter mod at standardisere teknikker til at studere fager som medlemmer af murinmikrobiotaen. Som et ekko af banebrydende undersøgelser, der undersøger mikrobiotaens indvirkning på metazoværten, kan fortsat forskning i fager inden for rammerne af mikrobiota vise sig spændende og signifikant i den bredere forståelse af multibiomet46.

Begrænsninger
De her beskrevne protokoller er optimeret til at studere konkurrencen mellem T4-og dens målbakterier, E. coli, når T4-administreres med oral sonde til E. coli monokoloniserede mus. Ligesom bakterier opfører forskellige fagarter sig forskelligt fra hinanden og har varierende replikationstider, sprængstørrelser og intervaller af bakterielle mål47. Når man undersøger andre fagbakteriepar i lignende dyremodeller, skal man derfor sørge for at optimere disse protokoller i alle trin. For eksempel kan fager med en længere replikationstid og / eller en mindre burststørrelse kræve en længere inkubation med deres bakterielle mål til produktion af et højt titerlysat. På samme måde kan det være nødvendigt at forlænge pladeinkubationstiderne for plakanalyser. Desuden kan fager med en kort replikationstid og / eller høj burststørrelse kræve kortere pladeinkubationer, da inkubation natten over kan resultere i plaque overvækst. Hvis formeringsbetingelserne er ukendte for en bestemt af interesse, bør grundlaget for bestemmelse af vækstbetingelser fastlægges, inden in vivo-arbejdet påbegyndes48.

Ig-lignende domæner, der findes i Hoc-capsidproteinerne i T4-fagen, letter vedhæftning til tarmslim11. Afhængigt af slimbindingsevnen i den valgte kan kinetikken af fagbakterieniveauer i fækale prøver afvige fra resultaterne vist i figur 2B-E. For eksempel blev det vist i gut-on-a-chip-systemer, at indeholdende intakte Hoc-proteiner havde øget E. coli-dræbende kapacitet sammenlignet med Hoc-mangelfuld11. Mens det er mistanke om, at T4-fager bevares gennem slimbinding in vivo 11,12,13, kan virkningen af geninokulation gennem musens coprophagiske opførsel ikke udelukkes. Disse virkninger kan reduceres ved at bruge trådburbunde eller ved hyppigt at skifte bur. Da Ig-lignende domæner ikke er blevet identificeret i ssDNA- eller RNA-fager49, vil det være interessant at drille de andre strategier, som fagen bruger til at bevare ophold i tarmslimhinden.

Endelig har disse sonderende undersøgelser kun undersøgt-bakterie-værtsinteraktioner ved homeostase. I dyremodeller af menneskelig sygdom er det ukendt, hvordan ændringer i tarmbarriereintegritet, såsom i IBD, kan påvirke disse interaktioner. Nylige undersøgelser har vist, at Caudovirales fager har øget rigdom og mangfoldighed hos patienter med IBD 7,8. I musemodeller blev det vist, at kontinuerlig fagbehandling forværrede dextrannatriumsulfat (DSS)-induceret eksperimentel colitis8. Det er stadig at bestemme, hvordan-bakterier-værtsinteraktioner spiller ud i inflammatoriske miljøer, og om nedsat barriereintegritet letter faginduceret betændelse.

Fejlfinding og alternative metoder

Mus modeller
Monokoniserede musemodeller giver mulighed for forhør af en enkelt bakterieart på værtsfysiologi16. Forskning med monokoloniserede mus har spillet en afgørende rolle i at belyse, hvordan mikrobiotaen påvirker immunsystemet22. Som et modelsystem rekapitulerer monokoloniserede mus ikke fysiologien hos deres konventionelle mikrobiota-modstykker. Mere ligner GF-mus, E. coli monokoloniserede mus har reduceret slimproduktion (svarende til GF-mus50) og et umodent immunsystem23. Imidlertid har monokoloniserede mus været uvurderlige for at afsløre de mikrobespecifikke virkninger af individuelle arter på mave-tarmkanalen og immunudviklingen. Et klassisk eksempel er opdagelsen af, at segmenterede filamentøse bakterier (SFB) er potente induktorer af CD4+ T-hjælper 17-celler i mus24. Med henvisning til slim er der mikrobespecifikke virkninger på slim-gen transkription51og slimtykkelse50. Mens begrænsede, monokoloniserede mus giver mulighed for at undersøge virkningen af et-bakteriepar på pattedyrværten i en kontrolleret model. Det er vigtigt, at fager kan og bør undersøges i forbindelse med en kompleks mikrobiota. I skrivende stund har få undersøgelser behandlet virkningerne af fagprædation af kommensale bakteriearter inden for et konventionelt mikrobiom. Dette er en fremtidig anvendelse af de protokoller, der præsenteres i dette dokument, som kunne tilpasses for at lette disse undersøgelser.

Brug af passende køretøjskontroller
Passende kontrol er afgørende i ethvert eksperiment. Her blev der defineret et egnet køretøj til oral administration til mus, der styrer flertrinsrensning og oprensning af T4-faglysater. Et vigtigt krav er, at køretøjsstyringen indeholder et niveau af bakterielle endotoksiner som faglysatet for at kontrollere for ethvert endotoksinmedieret immunrespons. Chloroform og 1-octanol tilsættes til lysatet som en del af rensningsprocessen og fjernes derefter. For at kontrollere for potentielle immunresponser, der kan genereres for at spore niveauer af disse kemikalier, kan et fagfrit bakterielysat produceres som køretøjskontrol. T4-og køretøjslysater indeholdt en meget lav koncentration af bakterielle endotoksiner, langt under de tilladte niveauer i drikkevand25 (figur 1B). Alternative styringsmidler kan anvendes og kan ændres, så de passer til det tilsigtede forskningsspørgsmål. Mest enkelt kan fagbuffer indeholdende en tilsvarende mængde endotoksin anvendes, selvom dette ikke tager højde for flertrins rengørings- og rensningsprocesserne. Gogokhia et al.8rapporterede brugen af varmeinaktiveret som en kontrol for, om fagprotein uden DNA var tilstrækkeligt til at fremkalde et immunrespons. I vores hænder havde varmeinaktiveret lavere niveauer af endotoksin end T4-faglysatet (figur 1B) og blev derfor ikke brugt til at kontrollere endotoksinniveauer i denne undersøgelse. Vi opfordrer dog til afprøvning af begge protokoller for at afgøre, hvilken metode der er bedst egnet til individuelle eksperimentelle formål. Hvis vehikel og T4-faglysater afviger signifikant i mængden af endotoksin, kan lysatet indeholdende de lavere niveauer suppleres med renset endotoksin. 1-Octanol tilsættes til lysater under rensningsprocessen, men inaktiverer den kromogene endotoksinkvantificeringskittest. Det er vigtigt at teste produkthæmning af potentielt interfererende stoffer i prøven for at sikre, at endotoksinmålinger er nøjagtige. Hvis der er mistanke om produkthæmning, er det muligt, at prøven ikke blev støvsuget længe nok. Hvis problemerne fortsætter, kan dialyse bruges til at fjerne resterende 1-octanol25.

Administrationsvej og dosis
På grund af T4-fagens slimbindende evne blev musemodeller podet i en enkelt oral sondedosis. Formålet med dette var at overvåge varigheden af og E. coli samliv i mave-tarmkanalen; Imidlertid er andre tilgange til at studere i in vivo-modeller blevet rapporteret. For eksempel er fagberiget drikkevand blevet brugt til at give en kontinuerlig forsyning af til mus 8,20. Fordelen ved denne indgivelsesmetode er, at fager løbende genopfyldes, selv i fravær af en bakteriel vært, som demonstreret af Gogokhia et al.8. Dette eksperimentelle design tillod evaluering af immunresponset på fager i fravær af bakterier og tilvejebragte kontinuerlig immunstimulering i løbet af eksperimentet. Fysiologisk repræsenterer denne metode ikke et naturligt forløb af faginfektion eller fagkolonisering af et tarmmiljø, men det giver vigtig indsigt i, hvordan gentagen fageksponering kan prime immunsystemet. Dette har betydning i forbindelse med udvikling af fagterapi, da fagcocktails kan leveres som et behandlingsforløb til behandling af tarmbakterielle infektioner, svarende til antibiotikaregimer. I forbindelse med T4--E. coli-parret blev det fastslået, at reduktion af dosis T4-, der blev påført oralt på monokoloniserede mus, ikke ændrede fækal eller bakterieniveauer (figur 2D, E). Derfor er podningsdosis af T4-i dette tilfælde ikke afgørende for vedligeholdelse af stabil T4--E. coli-kolonisering i tarmen hos bikoloniserede mus. Det bemærkes, at den laveste administrerede dosis var 200 pfu/mus, og den højeste dosis var 2 x 106 pfu/mus (ifølge Hsu et al.) 2. Derfor er data, der understøtter T4--E. coli-kinetik uden for dette interval, ikke tilgængelige i denne undersøgelse.

Spot- og helpladefagtitere
Til måling af T4-fagniveauer i afføring og væv er de her skitserede protokoller afhængige af pletteringsteknikker snarere end helpladeplakassays, hvilket kan bidrage til variabiliteten i fagniveauer mellem mus (figur 2B). I helpladeteknikker tælles plaques over et større område, hvilket giver mulighed for mere nøjagtig kvantificering. En passende fortynding af hver prøve skal dog normalt bestemmes på forhånd ved plettering. Da prøverne blev analyseret på dagen for prøveindsamlingen, blev plettering anset for at være den mest hensigtsmæssige metode til en mere avanceret tilgang. Derfor er opløsningen af disse data repræsenteret mest nøjagtigt af størrelsesordenen af i hver prøve. For præcise fagmålinger er der yderligere overvejelser for hver. Mere nøjagtige målinger kan opnås ved helpladeanalyser eller ved at bruge mindre serielle fortyndingsområder for hver prøve. Hvis disse metoder stadig resulterer i variable- eller målbakterietal, ville det være klogt at vurdere, om unikke interaktioner mellem fagen og bakterierne kunne forklare forskelle mellem individuelle mus via metagenomisk sekventering eller andre metoder til eksperimentelt at vurdere co-evolution og resistens. I henhold til Bonilla et al.25 er det vigtigt at være i overensstemmelse med mængden af bakteriel vært tilsat25, når man fremstiller blød agar til plaque-assays. Som vist i figur 3 kan selv relativt små ændringer i bakteriernes dyrkningstider (figur 3A) og densitet (figur 3B) påvirke nøjagtigheden af plakanalyser. Disse resultater kan være forskellige for andre-bakteriepar, og lignende eksperimenter anbefales, når man starter med nye organismer. Derudover bør der for nye-bakteriepar udføres sonderende eksperimenter for at bestemme vækstegenskaberne for hver. For eksempel kan vækstkurver udføres for at bestemme bakteriernes forsinkelse, eksponentielle og stationære faser og væksthastighed. Et-trins væksteksperimentet kan bruges til at bestemme latent periode (tid til lysis) og burststørrelse (antal fager frigivet ved bakterielyse) af fager52,53.

Alternativ T4-fagmåling ved qPCR
Kvantificering af kan udføres med plakassays, som beskrevet ovenfor, eller via kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR). Disse to tilgange har en vigtig forskel: plaque-assays bestemmer antallet af levedygtige fager, der er i stand til at inficere og dræbe deres bakterielle værter, mens qPCR kvantificerer fagspecifikt genetisk materiale (som en proxy for antallet af, der er til stede), men giver ikke information om fagens levedygtighed og infektivitet. qPCR'er blev udført for at sammenligne kvantificeringen af faggenkopier med plaques dannet i plaque-assays ved hjælp af primere beskrevet af Hsu et al.2 (figur 4). T4 DNA blev ekstraheret og amplificeret fra cecal indholdet af T4 / E. coli bikoloniserede mus. I de fleste mus påviste qPCR- og plaque-assays lignende niveauer af T4-i cecalindholdet (figur 4A, B). Mens der blev påvist en vis amplifikation i cecalindholdet i køretøjer, lå de beregnede genkopier/g under detektionsgrænsen (LOD) (figur 4A). Fraværet af kvantificerbar i disse prøver blev bekræftet ved gelelektroforese. T4-faggenprodukter (96 bp) blev let visualiseret i DNA isoleret fra cecalindhold i T4-podede mus, men var fraværende i køretøjskontroller (figur 4C).

I disse tests blev T4-faggenkopier påvist i cecalindholdet i en T4-fagkoloniseret mus ved qPCR (figur 4A, pil) på trods af manglende evne til at detektere T4 i plaque-assays fra den samme prøve (figur 4B, pil). Disse resultater tyder på, at virale partikler, der ikke danner plaques, kan opstå in vivo, enten på grund af produktion af defekte virale partikler eller co-evolution af og / eller bakterier. Bakterielle pletteringsteknikker på hård agar kan bruges til at bestemme fækale bakteriers modtagelighed for14. Vi foreslår, at qPCR-medieret detektion kan være en værdifuld tilføjelse til in vivo-fagarbejdsgange, da det kan være mere robust over for fagudvikling i tarmmiljøet, da det er målrettet mod korte, konserverede gensekvenser. Ikke-partiske tilgange som metagenomics er værdifulde til at undersøge fagbakteriel co-evolution og relative overfloder, men kan i sidste ende være dyrere.

Figure 4
Figur 4: Påvisning afT4- ved qPCR. (A,B) T4-fagbelastninger blev målt via (A) absolut qPCR- eller (B) plaqueassay i cecalindholdet i E. coli-koloniserede C57BL/6-mus på dag 29 efter podning med T4-eller vehikel. Pilen angiver resultater fra en individuel mus, der havde påviselige T4-genomkopier, men ikke plaquable virus i cecal indhold. C) Gelelektroforese af PCR-produkter, der viser tilstedeværelsen af 96 bp-båndet i T4-faginokulerede cecalprøver, men ikke i køretøjspodede prøver. En 100 bp DNA-stige blev brugt. LOD = detektionsgrænse. Fejlbjælker repræsenterer middelværdi og SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.

Programmer
Bakteriofager repræsenterer op mod 90% af de viruslignende partikler, der er til stede i mikrobiomet44; Imidlertid er virkningen af fager på tarmmikrobiomet dårligt forstået. Indledende undersøgelser, der undersøgte bakteriekomponenten i mikrobiomet, gjorde det ved at isolere bestemte arter og studere deres indvirkning på immunmodning22,24. Lignende forhør af faget udgør en skræmmende, men nødvendig opgave og et krav om at få en omfattende forståelse af multibiomet46. Mens fokus for udvikling af fagterapi har tendens til at være rettet mod at helbrede septiske bakterielle infektioner, er det vigtigt at forstå, hvordan tilføjelsen af en fagcocktail til mave-tarmkanalen kan ændre tarmøkosystemet. Desuden bør sikkerheden ved terapeutiske fagcocktails vurderes ved at generere en immunprofil. Fager er blevet undersøgt som potentielle behandlinger for tarmbakterielle infektioner såsom C. difficile5 og Salmonella enterica serovar Typhimurium54. Nylige undersøgelser har også vist, at FFT'er er lige så eller mere effektive til behandling af nekrotiserende enterocolitis hos for tidligt fødte grise9, hvilket tyder på, at den virale komponent i fækale mikrobiotatransplantationer (FMT'er) kan spille en aktiv rolle i sygdomsreduktion. Fortsatte undersøgelser, der undersøger fagernes rolle i mikrobiomet, er berettiget til at fremme udviklingen af fagterapier mod tarmpatogener, men også for bedre at informere FMT'er som behandling for sygdom. Ved at standardisere metoder til undersøgelse af fager in vivo øges gennemsigtigheden og reproducerbarheden i fagforskning sammen med vejledning til dem, der udvider deres arbejde til musemodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkender, at det land, de udførte denne forskning på, er det traditionelle, forfædre og uceded territorium i xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation. Det land, det ligger på, har altid været et læringssted for Musqueam-folket, der i årtusinder har videregivet i deres kultur, historie og traditioner fra generation til generation på dette sted. Vi opfordrer andre til at lære mere om de oprindelige lande, hvor de bor og arbejder på https://native-land.ca. Forfatterne anerkender støtte fra Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, til MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 til C.T., RGPIN-2016-04282 til LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Mennesker og mikrobiomet (FL-001253 Appt 3362, til C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, til C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 til LCO) og Canadian Foundation for Innovation (34673 til LCO og 38277 til CT). Vi er taknemmelige for teknisk støtte fra UBC Center for Disease Modelling og ubcFLOW, som støttes af UBC GREx Biological Resilience Initiative, og til medlemmer af Osborne og Tropini laboratorierne for kritiske diskussioner og evaluering af manuskriptet. Figur 1A og figur 2A blev oprettet ved hjælp af Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Tags

Immunologi og infektion udgave 203 Bakteriofager musemodeller gnotobiotisk mikrobiota værtspatogeninteraktioner T4- E. coli
T4 Bakteriofag og <i>E. coli-interaktion</i> i murintarmen: En prototypisk model til undersøgelse af værtsbakteriofagdynamik in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pett, N., Hunter, M., Carranza… More

Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter