Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T4 bakteriofag og E. coli-interaksjon i murtarmen: En prototypisk modell for å studere vertsbakteriofagdynamikk in vivo

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65906
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

Summary

Bakteriofager (fager), virus som infiserer bakterier, er en integrert del av tarmmikrobiomet. Selv om disse symbiotiske innbyggerne driver bakteriell kondisjon og populasjonsdynamikk, forstås lite om hvordan de påvirker tarmhomeostase og sykdom. Denne protokollen studerer isolerte T4-fager i en musemodell, tilpasningsdyktig til andre fagbakterielle par.

Abstract

Bakteriofager (fager) er virus som infiserer bakterier med arts- og stammenivåspesifisitet og er de mest tallrike biologiske enhetene på tvers av alle kjente økosystemer. Innenfor bakteriesamfunn, som de som finnes i tarmmikrobiotaen, er fager involvert i å regulere mikrobiotapopulasjonsdynamikk og drive bakteriell evolusjon. Det har vært fornyet interesse for fagforskning i det siste tiåret, delvis på grunn av de vertsspesifikke drapsegenskapene til lytiske fager, som tilbyr et lovende verktøy for å motvirke den økende trusselen om antimikrobielle resistente bakterier. Videre tyder nyere studier som viser at fager holder seg til tarmslim på at de kan ha en beskyttende rolle i å forhindre bakteriell invasjon i det underliggende epitelet. Det er viktigere, som bakterielle mikrobiomer, forstyrrede fagomer har vært assosiert med forverrede utfall i sykdommer som inflammatorisk tarmsykdom. Tidligere studier har vist at fager kan modulere mikrobiomet til dyr og mennesker gjennom fekale filtrattransplantasjoner, til fordel for vertsens helse. Med denne nylige bølgen av forskning kommer nødvendigheten av å etablere og standardisere protokoller for å studere fager i sammenheng med tarmmikrobiomet. Denne protokollen gir et sett med prosedyrer for å studere isolerte T4-fager og deres bakterielle vert, Escherichia coli, i sammenheng med murine gastrointestinaltraktus. Metodene beskrevet her skisserer hvordan man starter fra et faglysat, administrerer det til mus og vurderer effekter på bakteriell vert og fagnivå. Denne protokollen kan modifiseres og brukes på andre fagbakteriepar og gir et utgangspunkt for å studere vertsfagdynamikk in vivo.

Introduction

Bakteriofager, eller fager, er virus som infiserer og dreper bakterier med arts- og stammenivåspesifisitet1. Fager spiller viktige roller i komplekse bakteriesamfunn som tarmmikrobiota, hvor de har vært involvert i å regulere populasjonsdynamikk og drive bakteriell kondisjon2. Gjennom det siste tiåret har det vært fornyet interesse for fagforskning på grunn av økningen av antimikrobielle resistente patogener3, og potensialet for fagterapi som en alternativ behandlingsstrategi. I de senere år har lytiske fagcocktailer blitt brukt intravenøst med en viss suksess i alvorlige, antibiotikaresistente bakterielle septiske infeksjoner hos mennesker 3,4. Oral fagterapi har også blitt foreslått som et potensielt alternativ til antibiotika for å behandle tarminfeksjoner og betennelser. Videre har fager vært involvert i suksessen til fekale filtrattransplantasjoner (FFT), som er fekale mikrobiotapreparater som har blitt filtrert for å fjerne bakterier, i behandlingen av tilbakevendende Clostridioides difficile-infeksjon (rCDI) 5,6, inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) 7,8 og nekrotiserende enterokolitt hos premature griser9. Gitt disse resultatene, er det viktig å vurdere interaksjoner både mellom fager og tarmmikrobiota, og fager og pattedyrverten, da tilsetning av nye fager i et eksisterende samfunn kan ha indirekte effekter på samfunnet som helhet, og ikke bare målbakteriene 2,10.

Studien av faginteraksjoner med deres målbakterier in vitro har vist seg nyttig for å forstå mekanismene og virkningene av- og bakterieinteraksjoner i tarmen. I denne innstillingen har det blitt vist at Escherichia coli-spesifikke T4-fager av rekkefølgen Caudovirales krever immunoglobulin (Ig) -lignende domener lokalisert i svært antigene ytre kapsidproteiner (Hoc) på virionoverflaten for å feste seg til tarmslim11. I tillegg har transwellanalyser vist at T4-fager er i stand til å interagere med epitelcellekulturer og translokere gjennom cellelag ved makropinocytose12,13. Disse resultatene støtter hypotesen om at fager kan samhandle med deres metazoan vert, selv om de ikke er i stand til å infisere eukaryote celler. Disse modellene, selv om de er nyttige, mangler hele spekteret av komplekse interaksjoner som forekommer i et tarmøkosystem som kreves for en omfattende utforskning av trepartsinteraksjonen mellom fager, bakterier og metazoan-verten.

Musemodeller er et viktig verktøy for å undersøke fager i komplekse miljøer. En ønskelig anvendelse av fagadministrasjon er som en alternativ strategi for å behandle antimikrobielle resistente infeksjoner eller pathobionter assosiert med kroniske inflammatoriske sykdommer, inkludert IBD. Fremvoksende litteratur antyder imidlertid at fagadferd in vitro ikke fullt ut representerer in vivo-funksjoner. Buttimer et al.14 viste at en fagcocktail var i stand til å tømme de målrettede bakteriene i et forenklet humant mikrobiotakonsortium in vitro, men kunne ikke replikeres in vivo i gnotobiotiske mus kolonisert med det samme bakteriefagkonsortiet. Videre, i et konvensjonelt musemikrobiom, førte T7-til selektiv uttømming av måltarmbakteriene, selv om gradvis gjenoppretting ble observert over tid, noe som indikerer utviklet motstand15. Andre studier har vist sameksistens av oralt administrerte fager og deres målbakteriestammer in vivo 2,16. Faktisk, utover / bakterie sameksistens, førte fagadministrasjon til utbredte endringer i total mikrobiota samfunnssammensetning og funksjon 2,16. Dette er relevant i sykdomsinnstillinger, da flere studier har funnet sammenhenger mellom økt relativ overflod av Caudovirales og IBD 7,8,17 som var uavhengige av endringer i bakteriell overflod7. Det er fortsatt ukjent om dette er en driver eller konsekvens av sykdomspatogenesen.

Det historiske fokuset på fagundersøkelse har vært rundt forholdet mellom en og dens målbakterie. Det er imidlertid også viktig å vurdere potensielle interaksjoner mellom og slimhinnen, epitelet og immunsystemet til metazoanverten. Disse interaksjonene spiller alle en viktig rolle i den generelle responsen på tarmfaginfeksjon. For å demonstrere dette har fager blitt studert ved hjelp av bakteriefrie (GF) mus for å belyse deres innvirkning på immunsystemet uten forstyrrelser fra mikrobiota8. I dette systemet ble fagnukleinsyrer detektert av Toll-lignende reseptorer (TLR) lokalisert i endosomer av fagocytiske immunceller (makrofager og dendrittiske celler). Dette aktiverte nedstrøms signalering og stimulerte T-celleavhengig produksjon av interferon (IFN)-γ 8 eller type I IFN18. Videre impliserte Fluckiger et al.19 minne CD8 + T-celler i anerkjennelsen av fagkodede (profag) antigener, noe som resulterte i T-celle kryssreaktivitet med tumorantigener, noe som resulterte i redusert tumorbelastning. Endelig har fagspesifikk antistoffproduksjon blitt dokumentert i musestudier hvor fager ble levert til dyremodeller på en kontinuerlig måte gjennom drikkevann 8,20, eller ved gjentatt oral gavage over flere måneder20, som demonstrerer kapasiteten til fagproteiner for å fremme humorale immunresponser. Selv om disse modusene for faginokulasjon tillater optimal og kontinuerlig priming av immunsystemet, kan de ikke representere de naturlig forekommende interaksjonene mellom fager og tarmmiljøet, og heller ikke kinetikken til oralt anvendt fagterapi. Så langt har et begrenset antall studier undersøkt samspillet mellom og en enkelt bakterieart i monokoloniserte musemodeller21. Imidlertid viste monokoloniserte mus seg å være kritiske for å dechiffrere mikrobespesifikke effekter av individuelle arter på gastrointestinale (GI) -kanaler og immunutvikling 22,23,24, og de kan ennå vise seg å være nyttige for å forstå trepartsinteraksjoner mellom fager, deres målbakterier og metazoan-verten.

Spennende er det fortsatt mye å lære om samspillet mellom tarmfag og tarmkommensale bakterier, samt samspillet som oppstår mellom metazoan-verten og fagene som bor i den. Denne protokollen gir et sett med prosedyrer for å studere isolert T4-og dens bakterielle motstykke, E. coli (K-12, BW25113), ved hjelp av en gnotobiotisk musemodell. Disse standardiserte prosedyrene gir også grunnlag for å optimalisere andre-/bakteriedyader ved å tilpasse vekstparametrene til interesseparene. Metodene beskrevet her skisserer: (1) Fremstilling av T4 og kjøretøylysater for oral gavage av mus; (2) Oral administrering av T4-til E. coli monokoloniserte gnotobiotiske mus; (3) Overvåking av T4 fagnivåer i mus avføring og vev over tid.

For de representative resultatene som presenteres her, ble rensede T4-faglysater forplantet fra fagbankbestander vedlikeholdt av Rohwer Lab. Phage-on-Tap-metoden for forplantning av T4-ble tilpasset25, som referert i denne protokollen. Metoden gir høye titer, endotoksin-lave fagbestander innen tre dager. Ved hjelp av denne tilnærmingen ble det rutinemessig samlet inn 10 ml ≥10 plakkdannende enheter (pfu)/ml T4-med < 0,5 endotoksinenheter (EU)/ml. De anbefalte endotoksinnivåene for oral eller intravenøs administrering til mus er henholdsvis ≤ 20 EU/ml og ≤ 5 EU/kg/time (eller 0,1 EU administrert over 1 time for en 20 g mus), noe som gjør dette til en egnet metode for fagfremstilling for in vivo inokulering. Alle fagbestandene ble lagret ved 4 °C i fagbuffer for saltvann magnesium (SM) (oppskrift gitt i trinn 1.1.5.1). E. coli ble dyrket i LB media. For ulike-bakteriepar kan ulike kulturmedier og vekstbetingelser tilpasses fra denne protokollen. Fager kan også hentes fra miljøet, for eksempel avløpsvann, marint vann, jord og tarminnhold og kan isoleres og renses i henhold til Sambrook og Russell26 før forberedelse ved hjelp av passende vekst- og forplantningsbetingelser for hvert fagvertparav interesse 25. Alternativt kan fager fås fra kommersielle kilder (se materialtabell) eller fra fagbanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene fastsatt av UBC Animal Care Committee og Biosafety Committee-godkjente protokoller (A23-0113, B19-0038). Mus ble plassert ved University of British Columbia under patogenfrie forhold ved Center for Disease Modelling. C57BL/6 mus ble avlet i anlegget i en steril fleksibel filmisolator, utstyrt med steril musediett, vann, sengetøy og hekkemateriale. Musene ble opprettholdt på en 12 timers dag / natt syklus. Eksperimentelle mus, både mannlige og kvinnelige, ble aldersmatchet i hvert forsøk, mellom 6 og 12 ukers alder og veide 15-30 g for alle eksperimenter.

1. Fremstilling av- og kjøretøylysater for oral gavage til mus

  1. Fagrensing og lagergenerering
    MERK: I denne studien dyrkes T4-fager og titeres ved plating på en plen av bakterier ved hjelp av enkeltagarlagsmetoden, beskrevet nedenfor. Dobbeltagarlagsmetoden er beskrevet tidligere25,27og kan også brukes med lignende effekt. Metoden for enkeltagarlag ble valgt for denne protokollen da den gir forbedret synlighet av plakk28.
    1. Dyrk E. coli i 5 ml sterile LB-medier i sterile polystyren- eller glasskulturrør (med lokk). Inkuber rør ved 37 °C med risting ved 200 o / min over natten, til stasjonær fase er nådd.
    2. Tilbered myk agar i en glassmedieflaske ved å autoklavere LB med 0,5 % agar og avkjøle til 50 °C eller lavere (mens du beholder væske) før tilsetning. Forbered nok myk agar til 15 ml per plate.
    3. Tilsett myk agar med MgSO4 og CaCl2 til en endelig konsentrasjon på 1 mM for hver. Tilsett 100 μL E. coli-kultur over natten for hver 3 ml myk agar. Rør forsiktig med en magnetisk rørestang for å homogenisere kosttilskudd og kultur i den myke agar.
      MERK: Konsistens i volum og tetthet av E. coli som tilsettes det myke agarpreparatet er kritisk (skissert i avsnittet om representative resultater).
    4. Tilsett 15 ml myk agar + E. coli per petriskål (15 cm diameter) ved hjelp av en serologisk pipette. La platene stivne ved romtemperatur for bruk samme dag.
      MERK: Plater vil sette seg på omtrent 20 minutter med lokk åpne. Agaren vil forbli myk, men vil ikke skifte når platene er invertert.
    5. Forbered 8-10 serielle fortynninger av kilden T4-fagen i faktorer på 10 ved å fortynne i SM-buffer. Spot 5 μL av hver fortynning på plater. La flekkene tørke, snu opp ned og inkubere platene ved 37 °C over natten.
      1. For å forberede Saline Magnesium (SM) fagbuffer, i 1 L deionisert H2O, oppløs 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4 · 7H2O og 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Autoklav og oppbevares ved romtemperatur.
        MERK: Neste dag skal E. coli ha vokst til en plen gjennom den myke LB-agaren. Plaketter, eller ryddede vekstområder som er synlige i E. coli-plenen , vil dukke opp der fagdrap av infiserte E. coli-verter skjedde. Hver plakett representerer en plakkdannende enhet (pfu).
    6. Velg en enkelt plakett fra den myke agarplaten ved å skyve en steril pipettespiss inn i midten av plakket, og lag en agarplugg på enden av spissen. Heng plakkpluggen opp igjen i 1 ml SM-buffer i et mikrosentrifugerør på 1,7 ml. Virv røret på maks hastighet i 1 min for å blande.
    7. Sentrifuger røret ved 4000 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å fjerne rusk fra lysatet. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugerør.
    8. For å forplante den isolerte fagen, gjenta trinn 1.1.1-1.1.3. Tilsett 100 μL av den isolerte fagen til en 15 ml alikot av myk agar inneholdende E. coli i et konisk rør. Snu røret tre ganger for å blande og hell agar i en petriskål.
    9. La platene tørke før de snus og ruges over natten ved 37 °C. Forbered en plenkontrollplate uten for å bekrefte E. coli-levedyktighet .
      MERK: Etter inkubasjon over natten skal kontrollplaten ha en plen av E.coli , mens fagholdig plate skal være helt lysert.
    10. For å trekke ut fagen fra platen, tilsett 5 ml SM-buffer til overflaten av fagryddet plate og rist ved 70 o / min på en vippe i 15 minutter ved romtemperatur.
    11. Samle bufferen fra platen i et 50 ml konisk sentrifugerør og sentrifuge ved 4000 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å pelletere eventuelle rusk fra agarplaten.
    12. Samle T4-fagstamlysatet i et nytt rør og oppbevar ved 4 °C til titrering og forplantning.
      MERK: T4 fager er stabile i over 10 år25; Stabiliteten vil imidlertid avhenge av type og lagringsforhold. Fagtiteren vil også variere med lagringstiden. Fager er følsomme for frysing. Derfor anbefales kryopreservering ved flytende nitrogen og unngå fryse-tine-sykluser, da dette kan skade bakteriofager, noe som reduserer fagtiter25.
    13. Titre T4 fagstamlysat for å bestemme konsentrasjonen i pfu/ml, som tidligere beskrevet 25,29,30. En høy titer T4 fagbestand vil inneholde 108 pfu/ml eller mer.
  2. Fremstilling av eksperimentelle faglysater
    1. Kultur E. coli i 5 ml LB-medier i sterilt polystyren eller glasskulturrør (med lokk). Inkuber rør over natten ved 37 °C med risting ved 200 o / min, til stasjonær fase er nådd.
    2. Subkultur over natten E. coli kultur 1:50 i 100 ml LB media i et glass konisk kolbe. Inkuber ved 37 °C med risting ved 200 o / min til bakteriene har nådd tidlig til midten av eksponentiell fase (ca. 1,5 timer).
      MERK: En innledende vekstkurve kan utføres for å bestemme den optiske tettheten ved 600 nm (OD600) rekkevidde der bakteriekulturen er i eksponentiell fase. Kultur i et glass konisk rør er foreslått som nyere bevis har funnet ut at fager er i stand til å feste seg til plast som polypropylen31.
    3. Tilsett 100 μL av den høye titer T4-fagstammen fra trinn 1,1 i E. coli-subkulturen og inkuber ved 37 °C med risting i 3 timer, eller til det nye lysatet ikke lenger er uklart. Samle T4-faglysatet i 50 ml koniske rør og fortsett enten direkte til oppryddingstrinn eller, om nødvendig, oppbevar ved 4 °C til neste dag.
      MERK: En større fagbruddstørrelse (som indikerer et høyere gjennomsnittlig antall virioner frigjort per replikasjonssyklus) nødvendiggjør en lengre inkubasjonsperiode for bakteriell subkultur i trinn 1.2.2. Dette gir økt bakterietetthet før pigging med fagbestander.
    4. Sentrifuge lyserer ved 4000 x g i 20 minutter ved romtemperatur for å pelletere eventuelle gjenværende bakterier og cellulært rusk. Filtrersteriliser den resulterende supernatanten ved hjelp av et 0,22 μm nylonfilter og overfør filtratet til nye 50 ml koniske sentrifugerør.
    5. Tilsett 0,1 volumer kloroform til hvert volum filtrert T4 faglysat for å drepe eventuelle gjenværende bakterier og forhindre bakterievekst. Vortex kort å blande og inkubere ved romtemperatur i 10 minutter.
      MERK: Lipidinnkapslede fager er følsomme for kloroform, noe som kan redusere fagtiter25. Hopp over dette trinnet om nødvendig.
      FORSIKTIG: Kloroform er et giftig organisk løsningsmiddel som er farlig ved innånding, inntak eller absorbert gjennom huden. Bruk avtrekkshette og egnet personlig verneutstyr (PPE) når du arbeider med kloroform. Bruk glass i stedet for polystyren serologiske pipetter når du arbeider med kloroform, da det ikke er kompatibelt med de fleste plast. Kloroform kan plasseres i koniske sentrifugerør av polypropylen i trinn 1.2.5-1.2.6, men bør ikke lagres på lang sikt i plastrør.
    6. Sentrifuger lysatet ved 4000 x g i 5 minutter ved romtemperatur for å skille kloroformen fra lysatet. Bruk en serologisk pipette til forsiktig overføring av det øverste lysatlaget til et nytt 50 ml konisk rør uten å forstyrre det underliggende kloroformlaget. Kast kloroformavfallet i egnet beholder for farlig væskeavfall. Oppbevares ved lysater ved 4 °C til konsentrasjon og bufferutskifting neste dag.
    7. Konsentrer faglysater i en 100 kDa sentrifugalfilteranordning (se materialfortegnelse) ved å tilsette 13 ml faglysat til det øvre reservoaret til enheten og sentrifugere ved 4000 x g i 5 minutter, eller til det meste av lysatet har passert gjennom filteret inn i det nedre reservoaret.
      MERK: Ta sikte på å ha omtrent 2 ml lysat på slutten av sentrifugeringstiden. Etter hvert som fagkonsentrasjonen øker i filteret med tilsetning av lysat, vil spinntidene sannsynligvis øke. Sentrifugalfilterenheter har et fysisk dødstopp for å forhindre at de spinner tørt32. Ikke la filtermembranen tørke ut hvis fortsatt bruk er beregnet (dvs. ved å fjerne all væske fra det øvre reservoaret). Spinntider kan variere basert på fagtype og titer.
    8. Bruk en P200- eller P1000-pipette til å pipette de resterende ~2 ml lysat forsiktig opp og ned i det øvre reservoaret for å tette filtermembranen etter hvert spinn. Kast filtratet fra det nedre reservoaret i en avfallsbeholder, og la den konsentrerte fagen ligge i det øvre reservoaret.
    9. Gjenta trinn 1.2.7-1.2.8 til hele volumet av faglysat har blitt passert gjennom filteranordningen, med ~ 2 ml konsentrert beholdt i det øvre reservoaret etter hvert spinn.
    10. Fjern filtermembranen etter siste spinn ved å pipetere det gjenværende lysatet (~2 ml) i det øvre reservoaret opp og ned. Vask fagen (bufferutveksling) ved å tilsette 12 ml SM-buffer i øvre reservoar og sentrifuge ved 4000 x g i 10 minutter, eller til mesteparten av bufferen har passert gjennom filteret.
    11. Kast filtratet og gjenta vasketrinnet (trinn 1.2.10). Resuspender de resterende 2 ml lysat i SM-bufferen til et endelig volum på 10 ml (eller mindre) for langtidslagring. Overfør lysatet til et 50 ml konisk sentrifugerør og oppbevar ved 4 °C til endotoksinfjerning.
      MERK: Det er valgfritt å titre fagen på dette stadiet for å sikre at faglysatet er konsentrert (> 108 pfu / ml), og for å bestemme fagtap under endotoksinfjerningsprosessen.
    12. Fjern forurensende endotoksiner fra T4-faglysatet ved å tilsette 0,4 volumer 1-oktanol (se materialtabell) til det totale volumet av lysat.
      MERK: Endotoksiner fjernes da de er svært immunostimulerende, og derfor kan deres tilstedeværelse føre til induksjon av en faguavhengig medfødt immunrespons25.
      FORSIKTIG: 1-oktanol er en aromatisk, organisk, brannfarlig forbindelse med sterk lukt og er øyeirriterende. Bruk passende PPE når du arbeider med 1-oktanol. Utfør alt arbeid i en avtrekkshette for å unngå innånding av damp. Bruk tetningsfolie for å forhindre lekkasje av rør når du arbeider utenfor avtrekkshetten.
    13. Forsegl lokket på det koniske sentrifugerøret med tetningsfilm for å forhindre lekkasje. Rist ved 120 o / min på en plattform eller gynggshaker ved romtemperatur i 1 time, etterfulgt av inkubasjon ved 4 ° C i 1,5 time, uten å riste.
    14. Sentrifuge ved 4000 x g i 10 minutter for å skille endotoksin-cleared lysat fra 1-oktanol. 1-oktanollaget vil flyte på toppen av lysatet. Bruk en P1000-pipette til å forsiktig fjerne så mye 1-oktanol som mulig og kast den i egnet beholder for farlig/brennbart flytende avfall.
    15. Bruk en 18 G kanyle og en 10 ml sprøyte for å samle faglysatet under det gjenværende 1-oktanollaget, og pass på at du ikke samler 1-oktanollaget. Oppbevar lysat ved 4 °C til hastighetsvakuum.
    16. Overfør 1 ml alikoter av T4 faglysat til sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør. Hastighetsvakuum med lokk åpne ved 4000 x g ved romtemperatur for å fordampe gjenværende 1-oktanol fra lysatet. Hastighetsvakuum i 3 timer eller til faglysatvolumet er redusert med 30 %25. Oppbevares ved 4 °C til titrering.
    17. Titer faglysatet for å bestemme konsentrasjonen i pfu/ml. Fortynn det resulterende T4-faglysatet i SM-buffer til ønsket konsentrasjon og re-titer for å bekrefte.
    18. Kvantifiser endotoksiner tilstede i T4-faglysatet ved hjelp av et kromogent endotoksinkvantitasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner (se materialtabellen). Sammenlign endotoksinnivåer i det endelige faglysatet med en prøve for fjerning før endotoksin, kjøretøykontroller, buffer og musedrikkevann.
      MERK: Det kromogene endotoksinkvantifiseringssettet inaktiveres av 1-oktanol25. Utfør hastighetsvakuumtrinn for å fjerne 1-oktanol (trinn 1.2.16) før du kvantifiserer endotoksiner. Endotoksininnholdet for destillert vann er estimert til 20 EU/ml25; Endotoksininnholdet i musedrikkevann kan imidlertid variere mellom anleggene. Hvis endotoksinnivåene i faglysatet overstiger mengden som er tilstede i drikkevann, bør du vurdere å gjenta trinnene for fjerning av endotoksin (1.2.12-1.2.16).
    19. Oppbevar konsentrerte, endotoksinclearede T4-faglysater i SM-buffer ved 4 °C.
  3. Fremstilling av fagfri bakteriell lysat for kjøretøykontroller
    MERK: Et fagfritt bakterielt lysat kan fremstilles som et kjøretøy for å kontrollere for eventuelle effekter på grunn av bakterielle forurensninger (f.eks. Endotoksin) generert i produksjonen av faglysat i trinn 1.2, noe som kan påvirke eksperimentelle resultater når det inokuleres i mus.
    1. Fra en overnattingskultur av E. coli, subkultur E. coli 1:50 til 100 ml LB-medier. Uten å tilsette, fortsett å dyrke bakteriene mens du rister ved 37 ° C i 3 timer, eller samsvarer med inkubasjonstiden for faglysatet produsert i trinn 1.2.
    2. Overfør E. coli-kulturen til 50 ml koniske rør og lyse celler ved hjelp av en sonatorsonde (se materialtabell) på is ved 30 kHz i 30 s pulser (3x) for å manuelt lyse bakterieceller.
    3. Følg resten av protokollen i henhold til trinn 1.2, fra og med trinn 1.2.4, inkludert alle trinn for opprydding, vask og fjerning av endotoksin.
      MERK: Under konsentrasjon ved bruk av sentrifugalfilteranordningen vil kjøretøyets lysat strømme gjennom filteret raskere enn faglysatet, på grunn av fravær av. Forkort derfor sentrifugeringstiden fra 5 minutter til 2-5 minutter for å sikre at ultrafiltermembranen ikke tørker ut under langvarig sentrifugering.
    4. Titre kjøretøyets lysat for å bekrefte at det ikke inneholder.
    5. Bruk et kromogent endotoksinkvantitasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner for å måle endotoksinnivåer i kjøretøyets lysat. Fortynn kjøretøyets lysat i SM-buffer for å matche endotoksinnivåene i faglysatet.
  4. Alternative eksperimentelle kontroller: fremstilling av varmeinaktivert faglysat
    MERK: Et alternativ til det fagfrie bakterielle lysatet er et varmeinaktivert faglysat. Varmeinaktivering dissosierer fagvirioner, mens gjenværende endotoksiner som lipopolysakkarider (LPS) er varmestabile 8,33. Denne metoden ble brukt av Gogokhia et al.8 for å avgjøre om intakte, levedyktige fagvirioner var nødvendige for immunaktivering. Forskere oppfordres til å teste begge metodene (fagfri vs. varmeinaktivert) og bestemme hvilken kontroll som passer best for deres eksperimentelle behov. Uansett hva som velges, er det viktig å erkjenne at en bufferkontroll neppe vil være hensiktsmessig på grunn av den betydelige manipulasjonen som kreves for å konsentrere og rydde opp i en fagbestand.
    1. Overfør nødvendig volum av rengjort, renset og fortynnet T4 faglysat fra trinn 1,2 (100 μL per mus) til sterile mikrosentrifugerør utstyrt med lokklås.
    2. Varmelyserer på en varmeblokk ved 95 °C i 15 min16.
    3. VALGFRITT: Hvis fjerning av / bakterielle nukleinsyrer er nødvendig, utfør DNase I og RNase A-behandling i henhold til Jakočiūnė og Moodley34. Kort:
      1. Legg til 50 μL DNase I 10x buffer, 1μL DNase I (1 U / μL) og 1 μL RNase A (10 mg / ml) (se materialtabell) til 450 μL varmeinaktivert faglysat.
      2. Inkuber lysater ved 37 °C i 1,5 timer i en varmeblokk, uten å riste.
      3. Inaktiver DNase I og RNase A ved å tilsette 20 μL 0,5 M etylendiamintetraeddiksyre (EDTA)34.
    4. Hold lysater ved romtemperatur i 10 minutter for å avkjøle og kombinere lysater hvis flere rør brukes. Oppbevares ved 4 °C til titrering.
    5. Utfør en fagtiter for å bekrefte at ingen levedyktig T4-er tilstede i lysatet. Oppbevar varmeinaktiverte lysater ved 4 °C.
    6. Bruk et kromogent endotoksinkvantitasjonssett i henhold til produsentens instruksjoner for å måle endotoksinnivåer i det varmeinaktiverte lysatet. Fortynn det varmeinaktiverte lysatet i SM-buffer i henhold til endotoksinnivåene som er tilstede i det matchede faglysatet.

2. Administrasjon og overvåking av T4-i E. coli monokoloniserte mus

  1. Monokolonisering av mus med E. coli
    1. Forbered E. coli for administrering i GF-mus8 ved å dyrke E. coli plukket fra en enkelt koloni i LB-medier over natten.
    2. Under strenge, sterile forhold35, administrer 200 μL E. coli-kultur til GF-mus som er plassert i enten sterile vinylisolatorer eller bioekskluderende lufttette bur ved oral gavage. Hvis du bruker aerotolerante bakterier, kan mus også koloniseres ved påføring av 200 μL bakteriekultur på baksiden av hver mus.
      MERK: Inokulasjonsdosen vil være belastningsavhengig, da forskjellige bakterier viser forskjellig pH-overlevelsesevne 36,37. Zucoloto et al.35 anbefaler inokulering med 1 x 108 cfu per dyr. Representative resultater vist her ble generert fra mus inokulert med en overnattingskultur (cfu ble ikke bestemt). Piloteksperimenter kan utføres for å bestemme en dose som resulterer i pålitelig kolonisering av musestammen av interesse. Volumet av bakterier som skal administreres av oral gavage kan påvirkes av alderen og vekten av musene. Rådfør deg med individuell laboratorie- eller institusjonell dyreetikkprotokoll for maksimalt tillatte doser. Volumet som foreslås her er basert på en gavage kvote på 10% av musens kroppsvekt (f.eks. 200 μL maksimum for en 20 g mus). Noen bakteriearter vil ikke tolerere surheten i magen og ikke klarer å kolonisere tarmen. Vurder først gavaging med 100 μL av 1 M NaHCO3 for å nøytralisere magesyrer2. Hvis du bruker en streng anaerobe for å kolonisere, må mikroben dyrkes under anaerobe forhold og overføres til gnotobiotisk dyreavdeling i individuelt tilberedte lufttette beholdere (1 for hver mus). Utfør hver gavage raskt når beholderen er åpnet for å begrense tap av mikrobiell levedyktighet på grunn av oksygeneksponering.
    3. Overvåk mus for negative helseeffekter.
      MERK: I tilfelle negative helseeffekter, se standardene fastsatt av det aktuelle dyrepleieanlegget. Mulige negative helseeffekter inkluderer, men er ikke begrenset til: (1) Aspirasjon av gavage væske: symptomer inkluderer utvisning av bobler via nesen, "åpen munn" pusting / gisping. (2) Perforering av spiserøret: symptomer inkluderer raskt skrantende helse, hunching, sløvhet, som fører til dyrets død innen 24 timer. (3) Betennelse i spiserøret på grunn av gjentatte gavages: symptomer inkluderer vanskeligheter med å sette inn gavage nålen. (4) Diaré på grunn av endringer i mikrobiomet.
    4. Bekreft bakteriell kolonisering i fekale pellets ved dyrking minst en gang per uke og / eller ved 16S rRNA-sekvensering35.
      MERK: Hvis koloniserende oppdrettere i en gnotobiotisk isolator for produksjon av eksperimentelle mus, planlegg minst 9 uker i forveien for generering av 6 uker gamle første generasjon av avkom (F1) eksperimentelle mus. Alternativt kan GF voksne mus monokoloniseres. I denne tilnærmingen anbefales det å vente 7 uker etter kolonisering før faginokulering, da dette er tiden som trengs for tarmslimhinnen å stabilisere seg etter innføring av en kompleks mikrobiota i GF-mus38.
  2. Oral inokulering av T4-i E. coli monokoloniserte mus
    1. Fortynn T4-faglysater og kjøretøykontroller til en forhåndsbestemt konsentrasjon i SM-buffer. I henhold til Hsu et al.2, fortynnet faglysater for å tillate administrering av 2 x 106 pfu per mus2.
      MERK: En høyere eller lavere konsentrasjon av kan brukes, avhengig av stabiliteten til fagen in vivo. Doser på 2 x 102, 2 x 104 og 2 x 106 pfu T4 per mus resulterte i stabil og langvarig kolonisering i tarmen som ikke så ut til å være doseavhengig (vist i representative resultatavsnitt). Fagbakteriekinetikken bør derfor piloteres in vivo før storskalaforsøk.
    2. Under sterile, gnotobiotiske forhold, herje hver mus med 100 μL autoklavert 1 M NaHCO3 for å nøytralisere magesyrer. Vent 10 min, og gled deretter med 100 μL faglysat T4 faglysat eller kjøretøykontroll.
    3. Overvåk mus for negative helseeffekter.

3. Overvåking av T4-fagnivåer in vivo

MERK: Når mus har blitt inokulert med, kan konsentrasjonen av både fager og målbakterier måles i fekale eller vevsprøver. Dette gir informasjon om kinetikken til faginfeksjonen og koloniseringsdynamikken til begge organismer.

  1. Spot plating T4 for å bestemme konsentrasjonen i fekale pellets
    1. Samle fekale pellets fra hver mus i sterile, forhåndsveide, mikrosentrifugerør for å måle T4-- og E. coli-nivåer . Oppbevar rør på is til plating.
      MERK: Plasser prøver på is i mellomtiden mellom oppsamling og plating for å bremse veksten av aerotolerante bakterier. Over flere timer kan det fortsatt være vekst av aerobe bakterier, eller noe død av anaerobe bakterier på grunn av oksygeneksponering som kan føre til skjeve bakterietall. Derfor bør bakterier og fagbelegg utføres så snart som mulig etter prøveinnsamling. Obligate anaerobe bakterier vil ikke tolerere oksygeneksponering. For å bevare prøven, samle prøver i forseglede rør og overfør rør til et anaerob kammer så snart som mulig etter innsamling. Hvis det ikke oppdages vekst i fekale prøver, bør du vurdere alternativer som 16S rRNA qPCR for bakteriell kvantifisering.
    2. Registrer endelige vekter av hvert rør og beregne prøvevekten ved å trekke den opprinnelige rørvekten. Dette vil bli brukt til å normalisere T4 og E. coli konsentrasjon til prøvevekt (pfu / g eller cfu / g, henholdsvis).
    3. Tilsett 1 ml steril SM-buffer til hvert rør og virvel grundig ved maksimal hastighet (>1 min) for å homogenisere fekale pellets. Hvis prøven er mindre enn 15 mg, kan et mindre volum SM-buffer tilsettes. Registrer volumet av SM-buffer lagt til hver prøve for beregninger av cfu / g eller pfu / g prøve.
    4. Forbered en serie på 8 (eller mer avhengig av forventet fagkonsentrasjon) serielle fortynninger på 20 μL av hver prøve i 180 mikrol SM-buffer, i faktorer på 10. Vortex hver homogenisert prøve kort å blande før du legger til det første røret / brønnen. Pipette som blandes mellom hver tilsetning og endrer spissene mellom hver fortynning for å forhindre oppblåsing av- eller bakterietall via prøveoverføring.
      MERKNAD: Hvis fibre og rusk i prøven hindrer pipettering, tilsett ytterligere buffer til fekaloppslemmingen for å fortynne stamprøven ytterligere.
    5. Spot 5 μL av hver fortynning på LB myke agarplater som inneholder E. coli (for fagplakkanalyser) eller LB-agarplater (1,5 % agar, for bakteriekolonianalyser) for å bestemme T4-og E. coli-konsentrasjon i hver prøve. For nøyaktighet, spot hver prøve i triplikat.
      MERK: Ved tilberedning av serielle fortynninger i en plate med 96 brønner, kan en 8-kanals P20 flerkanalspipette brukes til å pipette hver kolonne med serielt fortynnet prøve på plater. Bytt tips mellom hver fortynning, selv om du går fra mest fortynnet til mest konsentrert, da kan feste seg til pipettespissens vegger og endre mengden som tilsettes hver ny brønn31.
    6. La hvert sted tørke før du vender platen og plasserer den i inkubatoren. Inkuber over natten ved 37 °C.
    7. For hver prøve, velg fortynningen der det er 3-30 tellbare plakk per flekk. Tell og registrer antall plakk på stedet og fortynningen som brukes.
    8. Beregn pfu/g av prøve ved å dividere antall plakk med volumet som er belagt på hvert sted for å gi pfu/μL. Multipliser dette med fortynningsfaktoren og med volumet av SM-buffer som legges til hver prøve for å gi pfu/prøve. Del til slutt på prøvevekten for å gi pfu/g30.
      Equation 1
      Equation 2
  2. Vevsprøvetaking ved eksperimentelle endepunkter
    1. På hvert valgt tidspunkt, avlive mus i henhold til godkjent institusjonell dyreetikkprotokoll og samle cecalinnhold, små og store tarminnhold og eventuelle vev av interesse i sterile, forhåndsveide 2 ml rundbunns mikrosentrifugerør.
    2. Registrer endelige vekter av hvert rør for å beregne prøvevekten. Oppbevar vev og cecal innhold på is til samme dag plating.
    3. Legg til steril SM-buffer til hvert rør og registrer volumene som er lagt til.
    4. For cecal og intestinal innhold, vortex prøver grundig (>1 min) i henhold til trinn 3.1.3.
    5. For vevsprøver, legg til en steril metallperle til hvert rør. Homogeniser vev ved hjelp av en vevslyser (se materialtabell) ved 20 Hz i 5 minutter eller til vevet er dissosiert og suspensjonen er homogen.
      MERK: Hvis prøvene ikke homogeniseres godt, bør du vurdere å øke volumet av SM-buffer tilsatt, øke homogeniseringstiden eller øke homogeniseringsfrekvensen til 30 Hz. En vevshomogenisator kan også brukes til å dissosiere vev samtidig som det muliggjør bakteriell og fagutvinning39,40. Homogenisatorer drives ved høyere frekvenser enn vevslysere samtidig som bakterieintegriteten opprettholdes.
    6. Forbered serielle fortynninger av hver prøve i faktorer på 10 og utfør spotplating for å bestemme E. coli - og T4-fagkonsentrasjoner i hver prøve, som beskrevet i trinn 3.1.4-3.1.841.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å undersøke interaksjonene mellom T4-fagen/E. coli-dyaden i murintarmen ble T4-og kjøretøylysater fremstilt, rengjort og renset (figur 1A). T4 faglysater ble titerert ved plakkanalyse og fortynnet til 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/mus) i SM-buffer. Kjøretøylysater ble også titered for å bekrefte ingen levedyktig fagtilstedeværelse og fortynnet i samme volum av SM-buffer som T4-faglysatet. Endotoksinnivåene ble kvantifisert i fortynnede lysater ved bruk av et kromogent endotoksinkvantifiseringssett. T4-, varmeinaktiverte fager og kjøretøylysater hadde endotoksinnivåer under akseptable nivåer for drikkevann (<20 EU/ml)25 (figur 1B). Siden kjøretøylysatet hadde en tilsvarende mengde endotoksin som T4-faglysatet, ble det ansett å være en egnet kontroll. Det varmeinaktiverte faglysatet (2 x 107 pfu/ml før varmebehandling) hadde mindre endotoksin enn både kjøretøy og T4 faglysat. I henhold til instruksjonene i settet ble prøver som hadde blitt behandlet med 1 oktanol testet for analysehemming ved tilsetning av en endotoksinstandard til kjøretøylysatet (pigget kjøretøy), for å gi en endelig konsentrasjon på 0,5 EU/ml. De piggete endotoksinnivåene hos kjøretøy minus kjøretøyets endotoksinnivåer målte 0,5 EU/ml ±25 %, i henhold til produsentens anbefalinger (figur 1B). Dette viste at 1-oktanol ble vellykket fjernet, og at det ikke var noen analysehemming forårsaket av lysatene som kunne forstyrre resultatene av analysen.

E. coli K-12 (BW25113) monokoloniserte C57BL/6-mus ble avlet i en steril fleksibel filmvinylisolator under gnotobiotiske forhold (figur 2A). F0 generasjon mus ble kolonisert med E. coli gjennom tillegg til deres miljø og medhus. Bare avkom (F1 og F2 generasjon) som ble kolonisert med E. coli fra fødsel gjennom vertikal overføring og co-housing ble brukt til eksperimenter. Denne strategien kontrollerte for endringene i immunsystemet, slimproduksjonen og GI-kanalutviklingen som oppstår som respons på bakteriell inokulasjon22,37, og tillater derfor måling av endringer som bare skjer på grunn av fagintroduksjon. Etter kjønnsmodning ble forsøksmus overført til sterile isocages hvor de hver fikk 2 x 106 pfu T4 eller et likt volum av kjøretøylysat ved oral gavage ved 6-8 ukers alder. T4 og E. coli overflod ble overvåket over fire uker ved innsamling av fekale pellets og flekkplating analyser på henholdsvis 0,5% (myk) agar eller 1,5% agar. I løpet av dette eksperimentet var T4-og E. coli i stand til å eksistere sammen uten at noen av populasjonene ble utarmet (figur 2B, C). Oral administrering av T4-i lavere doser på 2 x 102 og 2 x 104 pfu/mus reduserte ikke T4-fagens evne til å kolonisere tarmen sammenlignet med 2 x 106 pfu (figur 2D). Tilsvarende ble det ikke observert en doseavhengig effekt av T4-inokulasjon på E. coli-nivåer (figur 2E).

Det er viktig at konsistens i plating mellom prøver ble funnet å være avgjørende for plakktellingen. For eksempel, når man tilsatte bakterier i den myke agar, ble det bestemt at tettheten av bakterier i stor grad påvirket utfallet av analysen. Tilsetning av E. coli som ble subkulturert i 1 time, 1,5 time eller 2 timer, resulterte i lavere plakkantall enn ved tillegg av E. coli subkulturert i 2,8 timer eller mer. Videre stabiliserte plakkkvantifiseringen seg ved ~1 x 109 pfu/ml når E. coli ble subdyrket i 2,8 timer til 16 timer (over natten), noe som var omtrent en 5 ganger økning sammenlignet med verdien beregnet fra en 1 h subkultur (~2 x 108 pfu/ml) (figur 3A). I stedet for subdyrking kan målbakterier inokuleres i myk agar fra kulturer over natten. Her er volumet av 16 timers (over natten) E. coli-kultur som ble inokulert i det myke agar-påvirkede plakkantallet (figur 3B). Disse resultatene indikerer at tettheten av E. coli i agar kan påvirke antall plakkanalyser. I begge tilnærmingene flatet fagkvantifiseringsresultatene ut til samme verdi (109 pfu / ml), noe som tyder på at målbakterier må være av tilstrekkelig høy tetthet i den myke agar for å sikre nøyaktighet av plakktelling.

Samlet sett fremhever disse resultatene viktigheten av å utvikle en forståelse av fagbakteriskinetikk gjennom in vitro og in vivo piloteksperimenter før du utfører eksperimentelle manipulasjoner.

Figure 1
Figur 1: Fremstilling av faglysater. (A) Arbeidsflyt for å starte et faglysat fra en høy titerfagstamme. Lysater ble forplantet, renset, konsentrert og endotoksiner ble fjernet. Forurensende 1-oktanol ble fjernet av hastighetsvakuum. (B) Endotoksiner ble kvantifisert i- og kjøretøylysater ved hjelp av et kromogent endotoksinkvantifiseringssett. Stiplede blå linjer angir øvre og nedre grense for å motbevise produkthemming i produkthemmingskontrollen (0,5 EU/ml ± 25 %). Hvert punkt representerer en av to tekniske replikater. Stanghøyde representerer gjennomsnittet på tvers av replikater. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Generering av monokoloniserte mus og overvåking av- og bakterienivåer i fekale pellets. (A) Arbeidsflyt for kolonisering av bakteriefrie mus med en enkelt bakterieart og generering av F1 og F2 monokoloniserte mus. (VG Nett) Nivåer av T4 og E. coli påvist i fekale pellets av C57BL/6 mus som ble født monokolonisert med E. coli og ble inokulert med T4 ved 6-8 uker gammel. På dag 0 (prekolonisering) og de angitte dagene etter kolonisering ble T4-fagnivåer målt ved flekkplating og plakkanalyser ved bruk av enkeltagarlagsmetoden. E. coli-nivåer ble målt ved flekkbelegg på 1,5% LB agar. (B, C) Kinetikk av (B) T4 og (C) E. coli nivåer i gjenvunnet fekal pellets etter inokulering med 2 x 106 pfu av T4 eller kjøretøy lysat (normalisert for volum og endotoksin nivåer). (D, E) (D) T4 og (E) E. coli nivåer i gjenvunnet fekal pellets etter inokulering med 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu eller 2 x 106 pfu av T4. Feilfelt representerer middel- og standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Feilsøkingsnøyaktighet i plakkanalyser. (A) T4 faglysattiter ved bruk av E. coli over natten kulturer eller subkulturer for myk agar forberedelse (0,5% agar, LB). Subkulturer ble laget ved hjelp av en 1:50 fortynning av E. coli-kultur over natten til fersk LB. 5 ml myke agarpreparater ble inokulert med 100 μL E. coli og 20 μL T4-. CaCl2 og MgSO4 ble ikke tilsatt myk agar for disse testene, men kan tilsettes om ønskelig. E. coli-subkulturtider under 2,8 timer resulterte i en lavere tilsynelatende fagtiter. (B) T4 faglysattiter ved bruk av forskjellige E. coli-tettheter i mykt agarpreparat. Tilsetning av forskjellige volumer av E. coli fra en overnattingskultur (ikke subkultivert, som i A) i den myke agaren resulterte i forskjellige tilsynelatende fagtiter. Feilfelt representerer beregnet fagtiterusikkerhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studien av fager i mikrobiomet gir en betydelig utfordring sammenlignet med deres bakterielle kolleger. Spesielt inneholder fager ikke en konservert fylogenetisk markør som er felles for alle fager som ligner på 16S og 18S ribosomale underenheter som muliggjør enkel sekvensering og identifisering av henholdsvis prokaryote og eukaryote arter, henholdsvis42. Imidlertid, med fremskritt innen neste generasjons sekvenseringsmetoder, inkludert økende leselengder, gjennomstrømning og reduserte kostnader, kommer den raske utvidelsen av bakteriofaggenomdatabaser 42,43,44. Med mye grunnarbeid i fagoppdagelse godt i gang, er fagforskning nå mer tilgjengelig enn noensinne. Som sentrale medlemmer av tarmmikrobiomet, og de mest genetisk mangfoldige organismer på jorden, presenterer fager en spennende vinkel for ny forskning som undersøker mikrobiomets kompleksitet. Protokollene beskrevet her fokuserer på å undersøke kjente fagarter hos mus kolonisert med deres målbakterier. Det skal bemerkes at disse protokollene gir en retningslinje for å studere in vivo og kan utvides med veksten av feltet.

Bakteriofagforskning for terapeutisk behandling av bakterielle infeksjoner falt i stor grad ut av mote med fremkomsten av antibiotika på 1940-tallet. Imidlertid har over-reseptbelagte og misbruk av antibiotika akselerert fremveksten av multiresistente patogener som et stort folkehelseproblem3. Fager presenterer et attraktivt potensielt alternativ til antibiotika, på grunn av deres høye grad av vertsspesifisitet3. Det er viktig at ettersom fager naturlig tar bolig som medlemmer av det menneskelige tarmmikrobiomet, er det nødvendig å først forstå rollene som fager spiller i disse komplekse miljøene. Mens mange studier har undersøkt forholdet mellom en og dens målbakterier in vitro, er det viktig å vurdere hvordan disse forholdene kan holde opp i landskapet i GI-kanalen. Som i utforskende studier som undersøker bakteriekomponentene i mikrobiotaen, tillater forenklede musemodeller som GF og monokoloniserte mus oss å isolere effekter av på målarten, og hvordan dette forholdet bidrar til immunresponsen. Dette er et viktig skritt mot fagbehandling, da noen fager kanskje ikke gir fordel når de blir introdusert til tarmen. For eksempel forverrer Pseudomonas aeruginosa-fagen Pf4 sykdommen forårsaket av verten, ved å hemme både antibakterielle immunresponser og keratinocytmigrasjon, noe som resulterer i svekket sårheling18,45. Prosedyrene beskrevet her tar sikte på å standardisere teknikker for å studere fager som medlemmer av murine mikrobiota. Som et ekko av banebrytende studier som undersøker virkningen av mikrobiota på metazoan-verten, kan fortsatt forskning i fager i sammenheng med mikrobiota vise seg å være spennende og signifikant i den bredere forståelsen av multibiomet46.

Begrensninger
Protokollene beskrevet her er optimalisert for å studere konkurransen mellom T4-og dens målbakterier, E. coli, når T4-administreres av oral gavage til E. coli monokoloniserte mus. Som bakterier oppfører forskjellige fagarter seg forskjellig fra hverandre, med varierende replikasjonstider, burststørrelser og områder av bakterielle mål47. Derfor, når man undersøker andre-bakterielle par i lignende dyremodeller, bør man passe på å optimalisere disse protokollene på alle trinn. For eksempel kan fager med lengre replikasjonstid og/eller mindre burst-størrelse kreve en lengre inkubasjon med sitt bakterielle mål for produksjon av et høyt titerlysat. På samme måte kan plateinkubasjonstider måtte forlenges for plakkanalyser. Videre kan fager med kort replikasjonstid og/eller høy burst-størrelse kreve kortere plateinkubasjoner, da inkubasjon over natten kan føre til overvekst av plakk. Dersom formeringsbetingelsene er ukjente for en bestemt av interesse, bør grunnlaget for å bestemme vekstbetingelsene fastsettes før arbeidet in vivo påbegynnes48.

Ig-lignende domener funnet i Hoc-kapsidproteinene i T4-letter adherens til tarmslim11. Avhengig av slimbindingskapasiteten til den valgte fagen, kan kinetikken til fagbakterienivåer i fekale prøver avvike fra resultatene vist i figur 2B-E. For eksempel ble det vist i tarm-on-a-chip-systemer at fager som inneholder intakte Hoc-proteiner hadde økt E. coli-drapskapasitet sammenlignet med Hoc-mangelfull11. Selv om det er mistanke om at T4-fager beholdes gjennom slimbinding in vivo 11,12,13, kan virkningen av reinokulering gjennom musens koprofagiske oppførsel ikke utelukkes. Disse effektene kan reduseres ved å bruke nettingburbunner, eller ved å skifte merder ofte. Siden Ig-lignende domener ikke er identifisert i ssDNA eller RNA-fager49, vil det være interessant å plukke fra hverandre de andre strategiene som brukes av for å beholde opphold i tarmslimhinnen.

Endelig har disse utforskende studiene kun undersøkt-bakterier-vert-interaksjoner ved homeostase. I dyremodeller av menneskelig sykdom er det ukjent hvordan endringer i tarmbarriereintegritet, som for eksempel i IBD, kan påvirke disse interaksjonene. Nylige studier har vist at Caudovirales fager har økt rikdom og mangfold hos pasienter med IBD 7,8. I musemodeller ble det vist at kontinuerlig fagbehandling forverret dekstrannatriumsulfat (DSS)-indusert eksperimentell kolitt8. Det gjenstår å bli bestemt hvordan-bakterier-vert-interaksjoner spiller ut i inflammatoriske miljøer, og om nedsatt barriereintegritet letter-indusert betennelse.

Feilsøking og alternative metoder

Musemodeller
Monokoloniserte musemodeller tillater avhør av en enkelt bakterieart på vertsfysiologi16. Forskning som involverer monokoloniserte mus har spilt en avgjørende rolle i å belyse hvordan mikrobiota påvirker immunsystemet22. Som et modellsystem rekapitulerer ikke monokoloniserte mus fysiologien til deres konvensjonelle mikrobiota-kolleger. Mer lik GF-mus har E. coli monokoloniserte mus redusert slimproduksjon (lik GF-mus50), og et umodent immunsystem23. Imidlertid har monokoloniserte mus vært uvurderlige for å unravelling de mikrobespesifikke effektene av individuelle arter på GI-kanalen og immunutviklingen. Et klassisk eksempel er oppdagelsen av at segmenterte filamentøse bakterier (SFB) er potente induktorer av CD4+ T-hjelper-17-celler hos mus24. Med henvisning til slim er det mikrobespesifikke effekter på slim-gen-transkripsjon51og slimtykkelse50. Selv om det er begrenset, gir monokoloniserte mus muligheter til å undersøke virkningen av ett fagbakteriepar på pattedyrverten i en kontrollert modell. Det er viktig at fager kan og bør undersøkes i sammenheng med en kompleks mikrobiota. I skrivende stund har få studier adressert virkningen av fagpredasjon av kommensale bakteriearter innenfor et konvensjonelt mikrobiom. Dette er en fremtidig anvendelse av protokollene som presenteres i denne artikkelen, som kan tilpasses for å lette disse studiene.

Bruk av passende kjøretøykontroller
Passende kontroller er avgjørende i ethvert eksperiment. Her ble det definert et egnet kjøretøy for oral administrering til mus som kontrollerer flertrinns rengjøring og rensing av T4-faglysater. Et viktig krav er at kjøretøykontrollen inneholder et likt nivå av bakterielle endotoksiner som faglysatet, for å kontrollere for eventuell endotoksinmediert immunrespons. Kloroform og 1-oktanol tilsettes lysatet som en del av renseprosessen og fjernes deretter. For å kontrollere for potensielle immunresponser som kan genereres for å spore nivåer av disse kjemikaliene, kan et fagfritt bakterielt lysat produseres som en kjøretøykontroll. T4-- og kjøretøylysater inneholdt en svært lav konsentrasjon av bakterielle endotoksiner, godt under nivåene tillatt i drikkevann25 (figur 1B). Alternative kontroller kan brukes og kan endres for å passe til det tiltenkte forskningsspørsmålet. Fagbuffer som inneholder en tilsvarende mengde endotoksin kan ganske enkelt brukes, selv om dette ikke tar hensyn til flertrinns rengjørings- og renseprosessene. Gogokhia et al.8rapporterte bruken av varmeinaktivert som en kontroll for om fagprotein uten DNA var tilstrekkelig til å fremkalle en immunrespons. I våre hender hadde varmeinaktivert lavere nivåer av endotoksin enn T4-faglysatet (figur 1B), og ble derfor ikke brukt til å kontrollere for endotoksinnivåer i denne studien. Vi oppfordrer imidlertid til testing av begge protokollene for å bestemme hvilken metode som er best egnet for individuelle eksperimentelle formål. Hvis kjøretøyet og T4-faglysatene varierer vesentlig i mengden endotoksin som er tilstede, kan lysatet som inneholder de lavere nivåene suppleres med renset endotoksin. 1-oktanol tilsettes lysater under renseprosessen, men inaktiverer den kromogene endotoksinkvantifiseringssetttesten. Det er viktig å teste produkthemming ved potensielt forstyrrende stoffer i prøven for å sikre at endotoksinmålingene er nøyaktige. Ved mistanke om produkthemming er det mulig at prøven ikke ble hurtigstøvsugd lenge nok. Hvis problemene vedvarer, kan dialyse brukes til å fjerne gjenværende 1-oktanol25.

Administrasjonsvei og dose
På grunn av slimbindingsevnen til T4-ble musemodeller inokulert i en enkelt oral gavagedose. Hensikten med dette var å overvåke varigheten av og E. coli-samboerskap i GI-kanalen; Imidlertid har andre tilnærminger til å studere i in vivo-modeller blitt rapportert. For eksempel har fagberiket drikkevann blitt brukt til å gi en kontinuerlig tilførsel av til mus 8,20. Fordelen med denne administrasjonsmetoden er at fager kontinuerlig etterfylles, selv i fravær av en bakteriell vert, som demonstrert av Gogokhia et al.8. Denne eksperimentelle utformingen tillot evaluering av immunresponsen mot fager i fravær av bakterier og ga kontinuerlig immunstimulering i løpet av forsøket. Fysiologisk representerer denne metoden ikke et naturlig forløp av faginfeksjon eller fagkolonisering av et tarmmiljø, men det gir viktig innsikt i hvordan gjentatt fageksponering kan prime immunsystemet. Dette har betydning i sammenheng med fagterapiutvikling, da fagcocktailer kan leveres som et behandlingsforløp for å behandle tarmbakterielle infeksjoner, som ligner på antibiotikaregimer. I sammenheng med T4 -E. coli-paret ble det bestemt at reduksjon av dosen av T4-påført oralt på monokoloniserte mus ikke endret fekale- eller bakterienivåer (figur 2D, E). Derfor er inokulasjonsdosen av T4-i dette tilfellet ikke avgjørende for vedlikehold av stabil T4 -E. coli-kolonisering i tarmen hos bikoloniserte mus. Det bemerkes at den laveste dosen som ble administrert var 200 pfu/mus, og den høyeste dosen var 2 x 106 pfu/mus (per Hsu et al.) 2. Data som støtter T4 -E. coli-kinetikk utenfor dette området er derfor ikke tilgjengelig i denne studien.

Spot- og helplatefagtitere
For å måle T4-fagnivåer i avføring og vev, er protokollene som er skissert her, avhengige av flekkplatingsteknikker i stedet for plakkanalyser av hele plater, noe som kan bidra til variasjonen i fagnivåer mellom mus (figur 2B). I hele plateteknikker telles plakk over et større område, noe som muliggjør mer nøyaktig kvantifisering. En passende fortynning av hver prøve må imidlertid vanligvis forhåndsbestemmes ved flekkbelegg. Siden prøvene ble analysert på dagen for prøveinnsamlingen, ble flekkplating ansett å være den mest hensiktsmessige metoden for en mer gjennomstrømningstilnærming. Derfor er oppløsningen av disse dataene representert mest nøyaktig av størrelsesordenen av i hver prøve. For nøyaktige fagmålinger er det flere hensyn for hver. Mer nøyaktige målinger kan oppnås ved hele plateanalyser, eller ved å bruke mindre serielle fortynningsområder for hver prøve. Hvis disse metodene fortsatt resulterer i variable- eller målbakterietall, ville det være forsvarlig å vurdere om unike interaksjoner mellom og bakterier kunne utgjøre forskjeller mellom individuelle mus via metagenomisk sekvensering eller andre metoder for eksperimentelt å vurdere samevolusjon og resistens. I henhold til Bonilla et al.25, når du forbereder myk agar for plakkanalyser, er det viktig å være konsistent med mengden bakteriell vert tilsatt25. Som vist i figur 3 kan selv relativt små endringer i bakteriekulturtider (figur 3A) og tetthet (figur 3B) påvirke nøyaktigheten av plakkanalyser. Disse funnene kan være forskjellige for andre-bakteriepar, og lignende forsøk anbefales når man starter med nye organismer. I tillegg, for nye-bakteriepar, bør utforskende eksperimenter utføres for å bestemme vekstegenskapene til hver. For eksempel kan vekstkurver utføres for å bestemme lag, eksponentielle og stasjonære faser og veksthastigheten til bakteriene. Ett-trinns veksteksperimentet kan brukes til å bestemme latent periode (tid til lysis) og burststørrelse (antall fager frigjort ved bakterielyse) av fager52,53.

Alternativ T4 fagmåling ved qPCR
Kvantifisering av kan utføres med plakkanalyser, som beskrevet ovenfor, eller via kvantitativ polymerasekjedereaksjon (qPCR). Disse to tilnærmingene har et viktig skille: plakkanalyser bestemmer antall levedyktige fager som er i stand til å infisere og drepe sine bakterielle verter, mens qPCR kvantifiserer fage-spesifikt genetisk materiale (som en proxy for antall tilstede), men gir ikke informasjon om fagens levedyktighet og smittsomhet. qPCR ble utført for å sammenligne kvantifisering av faggenkopier med plakk dannet i plakkanalyser ved hjelp av primere beskrevet av Hsu et al.2 (figur 4). T4-DNA ble ekstrahert og amplifisert fra cecalinnholdet i T4 / E. coli bikoloniserte mus. Hos de fleste mus oppdaget qPCR- og plakkanalyser lignende nivåer av T4-i cecalinnhold (figur 4A, B). Mens det ble påvist noe amplifisering i kjøretøyinokulert cekalinnhold, var de beregnede genkopiene/g under deteksjonsgrensen (LOD) (figur 4A). Fraværet av kvantifiserbar i disse prøvene ble bekreftet ved gelelektroforese. T4 faggenprodukter (96 bp) ble lett visualisert i DNA isolert fra cekalinnholdet i T4-inokulerte mus, men var fraværende fra kjøretøykontrollene (figur 4C).

I disse testene ble T4-faggenkopier påvist i cecalinnholdet i en T4-fagkolonisert mus ved qPCR (figur 4A, pil) til tross for manglende evne til å oppdage T4 i plakkanalyser fra samme prøve (figur 4B, pil). Disse resultatene antyder at viruspartikler som ikke danner plakk kan oppstå in vivo, enten på grunn av produksjon av defekte viruspartikler eller samtidig evolusjon av og/eller bakterier. Bakterielle pletteringsteknikker på hard agar kan brukes til å bestemme fekale bakteriers følsomhet for14. Vi foreslår at qPCR-mediert deteksjon kan være et verdifullt tillegg til in vivo fagarbeidsflyter, da det kan være mer robust for fagutvikling i tarmmiljøet, gitt at det retter seg mot korte, konserverte gensekvenser. Ikke-partiske tilnærminger som metagenomikk er verdifulle for å undersøke fagbakteriell samevolusjon og relative overflod, men kan til slutt være dyrere.

Figure 4
Figur 4: Påvisning avT4- ved qPCR. (A,B) T4 fagbelastninger ble målt via (A) absolutt qPCR eller (B) plakkanalyse i cekalinnholdet i E. coli koloniserte C57BL/6 mus ved dag 29 etter inokulering med T4 eller kjøretøy. Pilen indikerer resultater fra en individuell mus som hadde detekterbare T4-genomkopier, men ikke plaquable virus i cecalinnhold. (C) Gelelektroforese av PCR-produkter som viser tilstedeværelsen av 96 bp-båndet i T4-faginokulerte cekalprøver, men ikke i kjøretøyinokulerte prøver. En 100 bp DNA-stige ble brukt. LOD = deteksjonsgrense. Feilfelt representerer gjennomsnitt og SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Programmer
Bakteriofager representerer opptil 90% av de viruslignende partiklene som er tilstede i mikrobiomet44; Imidlertid er virkningen av fager på tarmmikrobiomet dårlig forstått. Innledende studier som undersøkte bakteriekomponenten i mikrobiomet gjorde det ved å isolere bestemte arter og studere deres innvirkning på immunmodning 22,24. Lignende forhør av phageome presenterer en skremmende, men nødvendig oppgave, og et krav for å få en omfattende forståelse av multibiomet46. Mens fokuset på fagterapiutvikling har en tendens til å være rettet mot herding av septiske bakterielle infeksjoner, er det viktig å forstå hvordan tilsetning av en fagcocktail til GI-kanalen kan endre tarmøkosystemet. Videre bør sikkerheten til terapeutiske fagcocktailer vurderes ved å generere en immunprofil. Fager har blitt undersøkt som potensielle behandlinger for intestinale bakterielle infeksjoner som C. difficile5 og Salmonella enterica serovar Typhimurium54. Nylige studier har også vist at FFT er like eller mer effektive i behandling av nekrotiserende enterokulitt hos premature griser9, noe som tyder på at den virale komponenten av fekale mikrobiotatransplantasjoner (FMT) kan spille en aktiv rolle i sykdomsreduksjon. Fortsatte studier som undersøker rollen som fager i mikrobiomet er berettiget til å videreutvikle fagterapier mot intestinale patogener, men også for bedre å informere FMT som behandling for sykdom. Ved å standardisere metoder for studier av fager in vivo, vil gjennomsiktighet og reproduserbarhet i fagforskning økes, sammen med veiledning for de som utvider sitt arbeid i musemodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne erkjenner at landet de utførte denne forskningen på, er det tradisjonelle, forfedre og unceded territoriet til xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation. Landet det ligger på har alltid vært et sted for læring for Musqueam-folket, som i årtusener har gått videre i sin kultur, historie og tradisjoner fra en generasjon til den neste på dette nettstedet. Vi oppfordrer andre til å lære mer om de innfødte landene der de bor og arbeider på https://native-land.ca. Forfatterne anerkjenner støtte fra Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, til MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 til CT, RGPIN-2016-04282 til LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, til CT), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, til CT), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 til LCO) og Canadian Foundation for Innovation (34673 til LCO og 38277 til CT). Vi er takknemlige for teknisk støtte fra UBC Center for Disease Modelling og ubcFLOW, som støttes av UBC GREx Biological Resilience Initiative, og til medlemmer av laboratoriene Osborne og Tropini for kritiske diskusjoner og evaluering av manuskriptet. Figur 1A og figur 2A ble laget ved hjelp av Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Tags

Immunologi og infeksjon utgave 203 bakteriofager musemodeller gnotobiotiske mikrobiota vertspatogen-interaksjoner T4- E. coli
T4 bakteriofag og <i>E. coli-interaksjon</i> i murtarmen: En prototypisk modell for å studere vertsbakteriofagdynamikk in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pett, N., Hunter, M., Carranza… More

Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter