Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

T4 Bakteriofag och E. coli interaktion i murintarmen: En prototypisk modell för att studera värd-bakteriofagdynamik in vivo

Published: January 26, 2024 doi: 10.3791/65906
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 2, 1, 1,3,4
1Department of Microbiology and Immunology, Life Sciences Institute, University of British Columbia, 2Department of Biology, San Diego State University, 3School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 4Humans and the Microbiome Program, Canadian Institute for Advanced Research

Summary

Bakteriofager (fager), virus som infekterar bakterier, är en integrerad del av tarmmikrobiomet. Även om dessa symbiotiska invånare driver bakteriell kondition och populationsdynamik, är lite förstått om hur de påverkar tarmhomeostas och sjukdomar. Detta protokoll studerar isolerade T4-fager i en musmodell, som kan anpassas till andra-bakteriepar.

Abstract

Bakteriofager (fager) är virus som infekterar bakterier med art- och stamspecificitet och är de vanligaste biologiska enheterna i alla kända ekosystem. Inom bakteriesamhällen, som de som finns i tarmmikrobiotan, är fager inblandade i att reglera mikrobiotans populationsdynamik och driva bakteriell evolution. Det har funnits ett förnyat intresse för fagforskning under det senaste decenniet, delvis på grund av den värdspecifika dödande förmågan hos lytiska fager, som erbjuder ett lovande verktyg för att motverka det ökande hotet från antimikrobiellt resistenta bakterier. Dessutom tyder nya studier som visar att fager fäster vid tarmslem på att de kan ha en skyddande roll för att förhindra bakterieinvasion i det underliggande epitelet. Det är viktigt att notera att störda fasom, precis som bakteriella mikrobiom, har förknippats med försämrade resultat vid sjukdomar som inflammatorisk tarmsjukdom. Tidigare studier har visat att fager kan modulera mikrobiomet hos djur och människor genom fekala filtrattransplantationer, vilket gynnar värdens hälsa. Med den senaste vågen av forskning kommer nödvändigheten av att upprätta och standardisera protokoll för att studera fager i samband med tarmmikrobiomet. Detta protokoll tillhandahåller en uppsättning procedurer för att studera isolerade T4-fager och deras bakterievärd, Escherichia coli, i samband med musens mag-tarmkanal. Metoderna som beskrivs här beskriver hur man utgår från ett faglysat, administrerar det till möss och bedömer effekter på bakteriella värd- och fagnivåer. Detta protokoll kan modifieras och tillämpas på andra-bakteriepar och ger en utgångspunkt för att studera värd-fagdynamik in vivo.

Introduction

Bakteriofager, eller fager, är virus som infekterar och dödar bakterier med art- och stamnivåspecificitet1. Fager spelar viktiga roller inom komplexa bakteriesamhällen som tarmmikrobiotan, där de har varit inblandade i att reglera populationsdynamik och driva bakteriell kondition2. Under det senaste decenniet har det funnits ett förnyat intresse för fagforskning på grund av ökningen av antimikrobiellt resistenta patogener3 och potentialen för fagterapi som en alternativ behandlingsstrategi. Under de senaste åren har lytiska fagcocktails använts intravenöst med viss framgång vid allvarliga, antibiotikaresistenta bakteriella septiska infektioner hos människor 3,4. Oral fagterapi har också föreslagits som ett potentiellt alternativ till antibiotika för att behandla tarminfektioner och inflammation. Dessutom har fager varit inblandade i framgången för fekala filtrattransplantationer (FFT), som är fekala mikrobiotapreparat som har filtrerats för att avlägsna bakterier, vid behandling av återkommande Clostridioides difficile-infektion (rCDI)5,6, inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD)7,8 och nekrotiserande enterokolit hos för tidigt födda grisar9. Med tanke på dessa resultat är det viktigt att ta hänsyn till interaktioner både mellan fager och tarmmikrobiotan, och fager och däggdjursvärden, eftersom tillsats av nya fager i ett redan existerande samhälle kan ha indirekta effekter på samhället som helhet, och inte bara dess målbakterier 2,10.

Studien av faginteraktioner med deras målbakterier in vitro har visat sig vara användbar för att förstå mekanismerna och effekterna av- och bakterieinteraktioner i tarmen. I denna miljö har det visats att Escherichia coli-specifika T4-fager av ordningen Caudovirales kräver immunglobulin (Ig)-liknande domäner belägna i högantigena yttre kapsidproteiner (Hoc) på virionytan för att fästa vid tarmslem11. Dessutom har transwell-analyser visat att T4-fager kan interagera med epitelcellkulturer och translokera genom cellager genom makropinocytos12,13. Dessa resultat stöder hypotesen att fager kan interagera med sin metazoiska värd, även om de är oförmögna att infektera eukaryota celler. Dessa modeller, även om de är användbara, saknar hela skalan av komplexa interaktioner som uppstår i ett tarmekosystem som krävs för en omfattande utforskning av den tredelade interaktionen mellan fager, bakterier och metazovärden.

Musmodeller är ett viktigt verktyg för att undersöka fager i komplexa miljöer. En önskvärd tillämpning av fagadministrering är som en alternativ strategi för att behandla antimikrobiellt resistenta infektioner eller patogener associerade med kroniska inflammatoriska sjukdomar, inklusive IBD. Ny litteratur tyder dock på att fagbeteende in vitro inte fullt ut representerar in vivo-funktioner. Buttimer et al.14 visade att en fagcocktail kunde utarma de riktade bakterierna i ett förenklat humant mikrobiotakonsortium in vitro, men kunde inte replikeras in vivo i gnotobiotiska möss koloniserade med samma bakterie-fagkonsortium. Dessutom, i ett konventionellt musmikrobiom, ledde T7-till selektiv utarmning av dess måltarmbakterier, även om gradvis återhämtning observerades över tid, vilket tyder på utvecklad resistens15. Andra studier har visat samexistens av oralt administrerade fager och deras bakteriestammar in vivo 2,16. Utöver/bakterie-samexistens ledde fagadministrering till omfattande förändringar i den övergripande sammansättningenoch funktionen av mikrobiotasamhället. Detta är relevant i sjukdomsmiljöer eftersom flera studier har funnit samband mellan ökad relativ förekomst av Caudovirales och IBD 7,8,17 som var oberoende av förändringar i bakteriell förekomst7. Det är fortfarande okänt om detta är en drivkraft eller konsekvens av sjukdomspatogenesen.

Historiskt har fagforskningen fokuserat på relationen mellan en och dess målbakterie. Det är dock också viktigt att ta hänsyn till potentiella interaktioner mellan och slemhinnan, epitelet och immunsystemet hos den metazoiska värden. Dessa interaktioner spelar alla en viktig roll i det övergripande svaret på tarmfaginfektion. För att demonstrera detta har fager studerats med hjälp av bakteriefria (GF) möss för att belysa deras inverkan på immunsystemet utan inblandning av mikrobiotan8. I detta system detekterades fagnukleinsyror av toll-liknande receptorer (TLR) belägna i endosomer av fagocytiska immunceller (makrofager och dendritiska celler). Detta aktiverade nedströms signalering och stimulerade T-cellsberoende produktion av interferon (IFN)-γ8 eller typ I IFN18. Dessutom implicerade Fluckiger et al.19 minnes-CD8+ T-celler i igenkänningen av fagkodade (prophage) antigener, vilket resulterade i T-cellskorsreaktivitet med tumörantigener, vilket resulterade i minskad tumörbörda. Slutligen har fagspecifik antikroppsproduktion dokumenterats i musstudier där fager levererades till djurmodeller på ett kontinuerligt sätt genom dricksvatten 8,20, eller genom upprepad oral sondmatning under flera månader20, vilket visar fagproteinernas förmåga att främja humorala immunsvar. Även om dessa metoder för faginokulering möjliggör optimal och kontinuerlig priming av immunsystemet, kanske de inte representerar de naturligt förekommande interaktionerna mellan fager och tarmmiljön, eller kinetiken för oralt applicerad fagterapi. Hittills har ett begränsat antal studier undersökt fagens interaktioner med en enda bakterieart i monokoloniserade musmodeller21. Monokoloniserade möss visade sig dock vara avgörande för att dechiffrera mikrobspecifika effekter av enskilda arter på mag-tarmkanalen (GI) och immunutveckling 22,23,24, och de kan fortfarande visa sig vara användbara för att förstå tredelade interaktioner mellan fager, deras målbakterier och den metazoiska värden.

Spännande nog finns det fortfarande mycket att lära om samspelet mellan tarmfag och tarmkommensala bakterier, liksom de interaktioner som sker mellan metazovärden och fagerna som finns i den. Detta protokoll tillhandahåller en uppsättning procedurer för att studera isolerad T4-och dess bakteriella motsvarighet, E. coli (K-12, BW25113), med hjälp av en gnotobiotisk musmodell. Dessa standardiserade procedurer ger också en grund för att optimera andra/bakteriedyader genom att anpassa tillväxtparametrarna till de intressanta paren. De metoder som beskrivs här beskriver: (1) Beredning av T4-och vehikellysat för oral sondmatning av möss; (2) Oral administrering av T4-till E. coli monokoloniserade gnotobiotiska möss; (3) Övervakning av T4-fagnivåer i avföring och vävnad från möss över tid.

För de representativa resultaten som presenteras här förökades renade T4-faglysat från fagbankslager som underhålls av Rohwer Lab. -på-kran-metoden för förökning av T4-anpassades25, som refereras till i detta protokoll. Metoden ger högtiter, endotoxin-låga faglager inom tre dagar. Med hjälp av detta tillvägagångssätt samlades rutinmässigt 10 ml ≥ 1010 plackbildande enheter (pfu)/ml T4-med < 0,5 endotoxinenheter (EU)/ml. De rekommenderade endotoxinnivåerna för oral eller intravenös administrering till möss är ≤ 20 EU/ml respektive ≤ 5 EU/kg/timme (eller 0,1 EU administrerat under 1 timme för en mus på 20 g), vilket gör detta till en lämplig metod för fagberedning för inokulering in vivo . Alla faglager förvarades vid 4 °C i fagbuffert med saltlösning av magnesium (SM) (recept finns i steg 1.1.5.1). E. coli odlades i LB media. För olika-bakteriepar kan olika odlingssubstrat och tillväxtförhållanden anpassas från detta protokoll. Fager kan också hämtas från miljön, såsom avloppsvatten, havsvatten, jord och tarminnehåll och kan isoleras och renas enligt Sambrook och Russell26 före beredning med lämpliga tillväxt- och förökningsförhållanden för varje-värdpar av intresse25. Alternativt kan fager erhållas från kommersiella källor (se Materialförteckning) eller från fagbanker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla försök utfördes i enlighet med de riktlinjer som fastställts av UBC Animal Care Committee och Biosafety Committee-godkända protokoll (A23-0113, B19-0038). Möss inhystes vid University of British Columbia under patogenfria förhållanden vid Center for Disease Modeling. C57BL/6-möss föddes upp i anläggningen i en steril flexibel filmisolator, försedd med steril musdiet, vatten, strö och bomaterial. Mössen hölls på en 12 timmars dag/natt-cykel. Försöksmöss, både hanar och honor, åldersmatchades inom varje försök, mellan 6 och 12 veckors ålder och vägde 15-30 g för alla experiment.

1. Beredning av- och vehikellysat för oral sondmatning till möss

  1. Fagrening och stamproduktion
    OBS: I denna studie odlas och titreras T4-fager genom plätering på en gräsmatta av bakterier med hjälp av metoden med ett agarskikt, som beskrivs nedan. Metoden med dubbla agarskikt har beskrivits tidigare25,27och kan också användas med liknande effekt. Metoden med ett agarskikt valdes för detta protokoll eftersom den ger förbättrad synlighet av plack28.
    1. Odla E. coli i 5 ml sterila LB-medier i sterila polystyren- eller glasodlingsrör (med lock). Inkubera rören vid 37 °C med skakning vid 200 varv per minut över natten, tills stationär fas uppnås.
    2. Förbered mjuk agar i en glasmediaflaska genom att autoklavera LB med 0,5 % agar och kyla till 50 °C eller lägre (medan den förblir flytande) före tillskott. Förbered tillräckligt med mjuk agar för 15 ml per tallrik.
    3. Tillsätt mjukagar med MgSO4 och CaCl2 till en slutlig koncentration av 1 mM för varje. Tillsätt 100 μL E. coli-kultur över natten för varje 3 ml mjuk agar. Rör om försiktigt med en magnetisk omrörningsstång för att homogenisera tillskotten och kulturen i den mjuka agar.
      OBS: Konsistens i volymen och densiteten av E. coli som tillsätts till mjukagarberedningen är avgörande (beskrivs i avsnittet om representativa resultat).
    4. Tillsätt 15 ml mjuk agar + E. coli per petriskål (15 cm i diameter) med hjälp av en serologisk pipett. Låt plattorna stelna i rumstemperatur för användning samma dag.
      OBS: Plattorna stelnar på cirka 20 minuter med öppna lock. Agarn förblir mjuk men förskjuts inte när plattorna vänds upp och ner.
    5. Bered 8-10 seriespädningar av T4-fagen i faktor 10 genom spädning i SM-buffert. Spotta ut 5 μl av varje spädning på plattorna. Låt fläckarna torka, vänd och inkubera plattorna vid 37 °C över natten.
      1. För att bereda fagbuffert med saltlösning magnesium (SM), i 1 l avjoniserad H2O, lös upp 100 mM NaCl, 8 mM MgSO4·7H2O och 50 mM Tris-HCl (pH 7,4). Autoklav och förvara i rumstemperatur.
        OBS: Nästa dag bör E. coli ha vuxit till en gräsmatta i hela den mjuka LB-agar. Plack, eller rensade tillväxtområden som är synliga i E. coli-gräsmattan , kommer att dyka upp där fagdödande av infekterade E. coli-värdar inträffade. Varje plack representerar en plackbildande enhet (pfu).
    6. Välj ett enda plack från den mjuka agarplattan genom att trycka in en steril pipettspets i mitten av placket, vilket skapar en agarplugg i slutet av spetsen. Återsuspendera plackpluggen i 1 ml SM-buffert i ett 1.7 ml mikrocentrifugrör. Virvla röret på maxhastighet i 1 minut för att blanda.
    7. Centrifugera röret vid 4000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att avlägsna eventuellt skräp från lysatet. Överför supernatanten till ett nytt mikrocentrifugrör.
    8. För att föröka den isolerade fagen, upprepa steg 1.1.1-1.1.3. Tillsätt 100 μl av den isolerade fagen till en 15 ml alikvot mjuk agar innehållande E. coli i ett koniskt rör. Vänd röret tre gånger för att blanda och häll agaren i en petriskål.
    9. Låt plattorna torka innan de vänds upp och ner och inkuberas över natten vid 37 °C. Förbered en gräsmatta utan för att bekräfta E. colis livskraft.
      OBS: Efter inkubation över natten ska kontrollplattan ha en gräsmatta av E.coli medan faginnehållande plattan ska lysas helt.
    10. För att extrahera fagen från plattan, tillsätt 5 ml SM-buffert till ytan på den fagrensade plattan och skaka vid 70 rpm på en vippa i 15 minuter vid rumstemperatur.
    11. Samla bufferten från plattan i ett 50 ml koniskt centrifugrör och centrifugera vid 4000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att pelletera eventuellt skräp från agarplattan.
    12. Samla upp T4-fagbuljonglysatet i ett nytt rör och förvara vid 4 °C tills titrering och förökning.
      OBS: T4-fager är stabila i över 10 år25; Stabiliteten beror dock på typen av och lagringsförhållandena. Fagtiter kommer också att variera med lagringstiden. Fager är känsliga för frysning. Därför rekommenderas kryokonservering i flytande kväve och att undvika frys-upptiningscykler eftersom detta kan skada fager och minska fagtiter25.
    13. Titera T4-fagstamlysat för att bestämma koncentrationen i pfu/ml, som tidigare beskrivits 25,29,30. En högtiter T4-fagstam kommer att innehålla 108 pfu/ml eller mer.
  2. Beredning av experimentella faglysat
    1. Odling av E. coli i 5 ml LB-substrat i sterila polystyren- eller glasodlingsrör (med lock). Inkubera rören över natten vid 37 °C med skakning vid 200 varv per minut tills stationär fas uppnås.
    2. Subkultur: E. coli-odling över natten 1:50 i 100 ml LB-media i en konisk glaskolv. Inkubera vid 37 °C med skakning vid 200 rpm tills bakterierna har nått tidig till mitten av exponentiell fas (ca 1,5 h).
      OBS: En initial tillväxtkurva kan utföras för att bestämma den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) intervall där bakteriekulturen är i exponentiell fas. Odling i ett koniskt glasrör föreslås eftersom nya bevis har visat att fager kan fästa vid plaster som polypropen31.
    3. Tillsätt 100 μl av T4-fagbuljongen med hög titer från steg 1.1 till E. coli-subkulturen och inkubera vid 37 °C under omskakning i 3 timmar, eller tills det nya lysatet inte längre är grumligt. Samla upp T4-faglysatet i 50 ml koniska rör och fortsätt antingen direkt till saneringsstegen eller, om så krävs, förvara vid 4 °C till nästa dag.
      OBS: En större fagsprängningsstorlek (vilket indikerar ett högre genomsnittligt antal virioner som frigörs per replikationscykel) kräver en längre inkubationstid för den bakteriella subkulturen i steg 1.2.2. Detta ger ökad bakterietäthet innan man spetsar med faglager.
    4. Centrifugera lysat vid 4000 x g i 20 minuter vid rumstemperatur för att pelletera eventuella kvarvarande bakterier och cellulärt skräp. Filtersterilisera den resulterande supernatanten med ett 0,22 μm nylonfilter och överför filtratet till nya 50 ml koniska centrifugrör.
    5. Tillsätt 0,1 volymer kloroform till varje volym filtrerat T4-faglysat för att döda eventuella kvarvarande bakterier och förhindra bakterietillväxt. Virvla kort för att blanda och inkubera i rumstemperatur i 10 minuter.
      OBS: Lipidhöljeförsedda fager är känsliga för kloroform, vilket kan minska fagtiter25. Hoppa över det här steget om det behövs.
      VARNING: Kloroform är ett giftigt organiskt lösningsmedel som är farligt vid inandning, förtäring eller absorberas genom huden. Använd dragskåp och lämplig personlig skyddsutrustning (PPE) när du arbetar med kloroform. Använd glas istället för serologiska pipetter av polystyren när du arbetar med kloroform, eftersom det inte är kompatibelt med de flesta plaster. Kloroform kan placeras i koniska centrifugrör av polypropen för steg 1.2.5-1.2.6 men bör inte förvaras under lång tid i plaströr.
    6. Centrifugera lysatet vid 4000 x g i 5 minuter vid rumstemperatur för att separera kloroformen från lysatet. Använd en serologisk pipett för att försiktigt överföra det övre lysatskiktet till ett nytt 50 ml koniskt rör utan att störa det underliggande kloroformskiktet. Släng kloroformavfallet i lämplig behållare för farligt flytande avfall. Förvara lysat vid 4 °C tills koncentration och buffertutbyte påföljande dag.
    7. Konkoncentrera faglysat i en centrifugalfilteranordning på 100 kDa (se materialförteckning) genom att tillsätta 13 ml faglysat till anordningens övre behållare och centrifugera vid 4000 x g i 5 minuter, eller tills det mesta av lysatet har passerat genom filtret till den nedre behållaren.
      OBS: Sikta på att ha cirka 2 ml lysat i slutet av centrifugeringstiden. När fagkoncentrationen ökar i filtret med tillsats av lysat kommer centrifugeringstiderna sannolikt att öka. Centrifugalfilterenheter har ett fysiskt stopp för att förhindra att de snurrar torra32. Låt inte filtermembranet torka ut om fortsatt användning är avsedd (dvs. genom att ta bort all vätska från den övre behållaren). Centrifugeringstiderna kan variera beroende på fagtyp och titer.
    8. Använd en P200- eller P1000-pipett och pipettera försiktigt de återstående ~2 ml lysat upp och ner i den övre behållaren för att täppa till filtermembranet efter varje centrifugering. Kassera filtratet från den nedre behållaren i en avfallsbehållare och lämna den koncentrerade fagen i den övre behållaren.
    9. Upprepa steg 1.2.7-1.2.8 tills hela volymen faglysat har passerat genom filteranordningen, med ~2 ml koncentrerad kvar i den övre behållaren efter varje centrifugering.
    10. Täpp till filtermembranet efter den sista centrifugeringen genom att pipettera det återstående lysatet (~2 ml) i den övre behållaren upp och ner. Tvätta fagen (buffertbytet) genom att tillsätta 12 ml SM-buffert till den övre behållaren och centrifugera vid 4000 x g i 10 minuter, eller tills det mesta av bufferten har passerat genom filtret.
    11. Kassera filtratet och upprepa tvättsteget (steg 1.2.10). Återsuspendera de återstående 2 ml lysat i SM-bufferten till en slutlig volym på 10 ml (eller mindre) för långtidsförvaring. Överför lysatet till ett 50 ml koniskt centrifugrör och förvara vid 4 °C tills endotoxinet avlägsnas.
      OBS: Det är valfritt att titera fagen i detta skede för att säkerställa att faglysatet har koncentrerats (> 108 pfu/ml) och för att bestämma fagförlusten under endotoxinborttagningsprocessen.
    12. Avlägsna kontaminerande endotoxiner från T4-faglysatet genom att tillsätta 0,4 volymer 1-oktanol (se materialförteckning) till den totala volymen lysat.
      OBS: Endotoxiner avlägsnas eftersom de är mycket immunstimulerande, och därför kan deras närvaro leda till induktion av ett fagoberoende medfött immunsvar25.
      VARNING: 1-Octanol är en aromatisk, organisk, brandfarlig förening med stark lukt och är irriterande för ögonen. Använd lämplig personlig skyddsutrustning när du arbetar med 1-oktanol. Utför allt arbete i ett dragskåp för att undvika inandning av ånga. Använd tätningsfilm för att förhindra läckage av rör när du arbetar utanför dragskåpet.
    13. Försegla locket på det koniska centrifugröret med tätningsfilm för att förhindra läckage. Skaka vid 120 varv per minut på en plattform eller gungskakare i rumstemperatur i 1 timme, följt av inkubation vid 4 °C i 1,5 timmar, utan att skaka.
    14. Centrifugera vid 4000 x g i 10 minuter för att separera det endotoxinrensade lysatet från 1-oktanolen. 1-oktanolskiktet kommer att flyta ovanpå lysatet. Använd en P1000-pipett för att försiktigt ta bort så mycket 1-oktanol som möjligt och kassera i lämplig farlig/brandfarlig behållare för flytande avfall.
    15. Använd en 18 G nål och en 10 ml spruta för att samla upp faglysatet under det återstående 1-oktanolskiktet, var noga med att inte samla upp 1-oktanolskiktet. Förvara lysat vid 4 °C tills hastigheten vakuum.
    16. Överför 1 ml alikvoter av T4-faglysat till sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör. Snabbvakuum med öppna lock vid 4000 x g vid rumstemperatur för att avdunsta kvarvarande 1-oktanol från lysatet. Varva vakuumet i 3 timmar eller tills faglysatvolymen har minskats med 30 %25. Förvaras vid 4 °C fram till titrering.
    17. Titera faglysatet för att bestämma koncentrationen i pfu/ml. Späd det resulterande T4-faglysatet i SM-buffert till önskad koncentration och titersätt för att bekräfta.
    18. Kvantifiera endotoxiner som finns i T4-faglysatet med hjälp av ett kromogent endotoxinkvantifieringskit enligt tillverkarens instruktioner (se materialförteckning). Jämför endotoxinnivåerna i det slutliga faglysatet med ett prov före endotoxinborttagning, vehikelkontroller, buffert och dricksvatten från möss.
      OBS: Kvantifieringssatsen för kromogena endotoxiner inaktiveras av 1-oktanol25. Utför snabbvakuumsteg för att avlägsna 1-oktanol (steg 1.2.16) innan endotoxiner kvantifieras. Endotoxinhalten i destillerat vatten uppskattas till 20 EU/ml25. Endotoxinhalten i dricksvattnet från möss kan dock variera mellan olika anläggningar. Om endotoxinhalterna i faglysatet överstiger den mängd som finns i dricksvatten, överväg att upprepa stegen för avlägsnande av endotoxin (1.2.12-1.2.16).
    19. Förvara koncentrerade, endotoxinrensade T4-faglysat i SM-buffert vid 4 °C.
  3. Beredning av fagfritt bakterielysat för fordonskontroller
    OBS: Ett fagfritt bakteriellt lysat kan beredas som ett medel för att kontrollera eventuella effekter på grund av bakteriella föroreningar (t.ex. endotoxin) som genereras vid produktion av faglysat i steg 1.2, vilket kan påverka experimentella resultat när det inokuleras i möss.
    1. Från en nattodling av E. coli, subkultur E . coli 1:50 till 100 ml LB-media. Utan tillsats av, fortsätt att odla bakterierna under skakning vid 37 °C i 3 timmar, eller matcha inkubationstiden för faglysatet som producerades i steg 1.2.
    2. Överför E. coli-kulturen till 50 ml koniska rör och lysceller med hjälp av en sonikatorsond (se materialtabell) på is vid 30 kHz för 30 s pulser (3x) för att manuellt lysera bakterieceller.
    3. Följ resten av protokollet enligt steg 1.2, med början i steg 1.2.4, inklusive alla steg för rengöring, tvätt och borttagning av endotoxiner.
      OBS: Under koncentration med centrifugalfilteranordningen kommer vehikellysatet att strömma genom filtret snabbare än faglysatet, på grund av frånvaron av. Förkorta därför centrifugeringstiderna från 5 minuter till 2-5 minuter för att säkerställa att ultrafiltermembranet inte torkar ut under långvarig centrifugering.
    4. Titera vehikellysatet för att bekräfta att det inte innehåller.
    5. Använd en kromogen endotoxinkvantifieringssats enligt tillverkarens instruktioner för att mäta endotoxinnivåerna i vehikellysatet. Späd vehikellysatet i SM-buffert så att det motsvarar endotoxinnivåerna i faglysatet.
  4. Alternativa experimentella kontroller: beredning av värmeinaktiverat faglysat
    OBS: Ett alternativ till det fagfria bakterielysatet är ett värmeinaktiverat faglysat. Värmeinaktivering dissocierar fagvirioner, medan kvarvarande endotoxiner som lipopolysackarider (LPS) är värmestabila 8,33. Denna metod användes av Gogokhia et al.8 för att avgöra om intakta, livskraftiga fagvirioner krävdes för immunaktivering. Forskare uppmuntras att testa båda metoderna (fagfri vs. värmeinaktiverad) och avgöra vilken kontroll som är mest lämplig för deras experimentella behov. Oavsett vilket som väljs är det viktigt att inse att en buffertkontroll sannolikt inte är lämplig på grund av den betydande manipulation som krävs för att koncentrera och sanera ett faglager.
    1. Överför erforderlig volym rengjort, renat och utspätt T4-faglysat från steg 1.2 (100 μL per mus) till sterila mikrocentrifugrör försedda med locklås.
    2. Värm lysat på ett värmeblock vid 95 °C i 15 minuter16.
    3. VALFRITT: Om avlägsnande av/bakteriella nukleinsyror krävs, utför DNas I- och RNas A-behandling enligt Jakočiūnė och Moodley34. Kort:
      1. Tillsätt 50 μL DNas I 10x buffert, 1 μL DNas I (1 E/μL) och 1 μL RNas A (10 mg/ml) (se materialförteckning) till 450 μL värmeinaktiverat faglysat.
      2. Inkubera lysat vid 37 °C i 1,5 timme i ett värmeblock, utan skakning.
      3. Inaktiverar DNas I och RNas A genom att tillsätta 20 μl 0,5 M etylendiamintetraättiksyra (EDTA)34.
    4. Håll lysat i rumstemperatur i 10 minuter för att svalna och kombinera lysat om flera rör används. Förvaras vid 4 °C fram till titrering.
    5. Utför en fagtiter för att bekräfta att det inte finns någon livskraftig T4-i lysatet. Förvara värmeinaktiverade lysat vid 4 °C.
    6. Använd ett kromogent endotoxinkvantifieringskit enligt tillverkarens instruktioner för att mäta endotoxinnivåerna i det värmeinaktiverade lysatet. Späd det värmeinaktiverade lysatet i SM-buffert i enlighet med endotoxinnivåerna i det matchade faglysatet.

2. Administrering och övervakning av T4-hos E. coli monokoloniserade möss

  1. Monokolonisering av möss med E. coli
    1. Förbered E. coli för administrering i GF-möss8 genom att odla E. coli plockad från en enda koloni i LB-media över natten.
    2. Under strikta, sterila förhållanden35 administreras 200 μL E. coli-kultur till GF-möss som är inhysta i antingen sterila vinylisolatorer eller lufttäta burar med biouteslutning genom oral sondmatning. Vid användning av aerotoleranta bakterier kan möss också koloniseras genom applicering av 200 μL bakteriekultur på ryggen på varje mus.
      OBS: Inokuleringsdosen kommer att vara stamberoende, eftersom olika bakterier uppvisar olika pH-överlevnadsförmåga36,37. Zucoloto et al.35 rekommenderar inokulering med 1 x 108 cfu per djur. Representativa resultat som visas här genererades från möss som inokulerats med en odling över natten (cfu bestämdes inte). Pilotexperiment kan utföras för att bestämma en dos som resulterar i tillförlitlig kolonisering av musstammen av intresse. Mängden bakterier som ska administreras genom oral sondmatning kan påverkas av mössens ålder och vikt. Konsultera enskilda laboratorier eller institutionella djuretiska protokoll för högsta tillåtna doser. Den volym som föreslås här är baserad på en sondmatning på 10 % av musens kroppsvikt (t.ex. högst 200 μl för en mus på 20 g). Vissa bakteriearter tolererar inte surheten i magen och misslyckas med att kolonisera tarmen. Överväg att först sondera med 100 μL 1 M NaHCO3 för att neutralisera magsyror2. Om man använder en strikt anaerob för att kolonisera, måste mikroben odlas under anaeroba förhållanden och överföras till den gnotobiotiska djuranläggningen i individuellt förberedda lufttäta behållare (1 för varje mus). Utför varje sondmatning snabbt när behållaren har öppnats för att begränsa förlusten av mikrobiell livskraft på grund av syreexponering.
    3. Övervaka möss för negativa hälsoeffekter.
      OBS: I händelse av negativa hälsoeffekter, se de standarder som fastställts av den relevanta djurvårdsanläggningen. Möjliga negativa hälsoeffekter inkluderar, men är inte begränsade till: (1) aspiration av sondvätska: symtomen inkluderar utstötning av bubblor via näsan, andning/flämtning med öppen mun. (2) Perforering av matstrupen: symtomen inkluderar snabbt sjuk hälsa, förkylningar, slöhet, vilket leder till att djuret dör inom 24 timmar. (3) Inflammation i matstrupen på grund av upprepade sondmatningar: symtomen inkluderar svårigheter att föra in sondnålen. (4) Diarré på grund av förändringar i mikrobiomet.
    4. Bekräfta bakteriell kolonisering i fekala pellets genom att odla minst en gång i veckan och/eller med 16S rRNA-sekvensering35.
      OBS: Om du koloniserar uppfödare inom en gnotobiotisk isolator för produktion av försöksmöss, planera minst 9 veckor i förväg för generering av 6 veckor gamla första generationens avkommor (F1) försöksmöss. Alternativt kan GF vuxna möss monokoloniseras. I detta tillvägagångssätt rekommenderas att vänta 7 veckor efter kolonisering innan faginokulering, eftersom detta är den tid som behövs för att tarmslemhinnan ska stabiliseras efter införandet av en komplex mikrobiota i GF-möss38.
  2. Oral inokulering av T4-i E. coli monokoloniserade möss
    1. Späd ut T4-faglysat och vehikelkontroller till en förutbestämd koncentration i SM-buffert. Enligt Hsu et al.2, späd faglysat för att möjliggöra administrering av 2 x 106 pfu per mus2.
      OBS: En högre eller lägre koncentration av kan användas beroende på fagens stabilitet in vivo. Doser på 2 x 102, 2 x 104 och 2 x 106 pfu av T4-per mus resulterade i en stabil och långvarig kolonisering i tarmen som inte verkade vara dosberoende (visas i avsnittet med representativa resultat). -bakteriers kinetik bör därför testas in vivo före storskaliga experiment.
    2. Under sterila, gnotobiotiska förhållanden, sondmatning av varje mus med 100 μL autoklaverad 1 M NaHCO3 för att neutralisera magsyror. Vänta 10 minuter och sondmatning med 100 μL T4-faglysat eller vehikelkontroll.
    3. Övervaka möss för negativa hälsoeffekter.

3. Övervakning av T4-fagnivåer in vivo

OBS: När möss har inokulerats med kan koncentrationen av både fager och målbakterier mätas i avförings- eller vävnadsprover. Detta ger information om kinetiken för faginfektionen och koloniseringsdynamiken hos båda organismerna.

  1. Punktplätering av T4-för att bestämma koncentrationen i fekala pellets
    1. Samla fekala pellets från varje mus i sterila, vägda mikrocentrifugrör för att mäta nivåerna av T4-och E. coli . Förvara rören på is tills de är pläterade.
      OBS: Placera samples på is under tiden mellan uppsamling och plätering för att bromsa tillväxten av aerotoleranta bakterier. Under flera timmar kan det fortfarande finnas tillväxt av aeroba bakterier, eller viss död av anaeroba bakterier på grund av syreexponering, vilket kan leda till skeva bakterieantal. Därför bör bakterier och fagplätering utföras så snart som möjligt efter provtagningen. Obligata anaeroba bakterier tål inte syreexponering. För att bevara provet ska proverna samlas upp i förseglade rör och rören överföras till en anaerob kammare så snart som möjligt efter insamlingen. Om ingen tillväxt upptäcks i fekala prover, överväg alternativ som 16S rRNA qPCR för bakteriell kvantifiering.
    2. Anteckna slutvikterna för varje rör och beräkna provvikten genom att subtrahera den ursprungliga rörvikten. Detta kommer att användas för att normalisera T4-- och E. coli-koncentrationen till provvikt (pfu/g respektive cfu/g).
    3. Tillsätt 1 ml steril SM-buffert till varje rör och virvla noggrant på maximal hastighet (>1 min) för att homogenisera fekala pellets. Om provet är mindre än 15 mg kan en mindre volym SM-buffert tillsättas. Registrera volymen SM-buffert som tillförs varje prov för beräkning av cfu/g eller pfu/g av provet.
    4. Bered en serie på 8 (eller fler beroende på den förväntade fagkoncentrationen) seriespädningar på 20 μL av varje prov i 180 μL SM-buffert, i faktorer om 10. Blanda varje homogeniserat prov kort innan du tillsätter det i det första röret/brunnen. Pipettera för att blanda mellan varje tillsats och byt spetsar mellan varje utspädning för att förhindra att antalet fager eller bakterier blåses upp via provöverföringen.
      OBS: Om fibrer och skräp som finns i sample hindrar pipettering, tillsätt ytterligare buffert till fekaluppslamningen för att ytterligare späda ut stamprovet.
    5. Placera 5 μl av varje spädning på mjuka agarplattor av typen LB som innehåller E. coli (för fagplackanalyser) eller LB-agarplattor (1,5 % agar för bakteriekolonianalyser) för att bestämma koncentrationen av T4-fager och E. coli i varje prov. För noggrannhet, placera varje prov i tre exemplar.
      ANM.: Vid beredning av seriespädningar i en 96-hålsplatta, kan en 8-kanals P20 flerkanalspipett användas för att pipettera varje kolonn av serieutspädd sample på plattor. Byt spetsar mellan varje utspädning, även om du går från mest utspädd till mest koncentrerad, eftersom kan fastna på pipettspetsens väggar och ändra mängden som tillsätts till varje ny brunn31.
    6. Låt varje fläck torka innan du vänder upp och ner på plattan och placerar den i inkubatorn. Inkubera över natten vid 37 °C.
    7. För varje prov, välj den utspädning vid vilken det finns 3-30 räknebara plack per fläck. Räkna och registrera antalet plack på platsen och den utspädning som används.
    8. Beräkna pfu/g av provet genom att dividera antalet plack med den volym som är plattad på varje ställe för att ge pfu/μL. Multiplicera detta med utspädningsfaktorn och med volymen SM-buffert som tillsätts till varje prov för att ge pfu/prov. Dividera slutligen med provets vikt för att ge pfu/g30.
      Equation 1
      Equation 2
  2. Vävnadsprovtagning vid experimentella effektmått
    1. Vid varje vald tidpunkt, avliva möss enligt godkänt institutionellt djuretiskt protokoll och samla in cekalinnehåll, innehåll i små och stora tarmar och eventuella vävnader av intresse i sterila, vägda 2 ml mikrocentrifugrör med rund botten.
    2. Anteckna slutvikterna för varje rör för att beräkna provvikten. Förvara näsdukar och cekalinnehåll på is tills de pläteras samma dag.
    3. Tillsätt steril SM-buffert till varje rör och registrera de volymer som tillförs.
    4. För cekal- och tarminnehåll, virvla prover noggrant (>1 min) enligt steg 3.1.3.
    5. För vävnadsprover, tillsätt en steril metallpärla till varje rör. Homogenisera vävnaderna med hjälp av en vävnadslysrör (se materialtabell) vid 20 Hz i 5 minuter eller tills vävnaderna är dissocierade och suspensionen är homogen.
      OBS: Om samples inte homogeniseras bra, överväg att öka volymen av SM-buffert som tillsätts, öka homogeniseringstiden eller öka homogeniseringsfrekvensen till 30 Hz. En vävnadshomogenisator kan också användas för att dissociera vävnader samtidigt som bakterie- och fagåtervinningmöjliggörs. Homogenisatorer används med högre frekvenser än vävnadslysörer samtidigt som bakteriernas integritet bibehålls.
    6. Bered seriespädningar av varje prov i faktorer om 10 och utför punktplätering för att bestämma E. coli - och T4-fagkoncentrationerna i varje prov, enligt beskrivningen i steg 3.1.4–3.1.841.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

För att undersöka interaktionerna mellan T4-fagen/E. coli-dyaden i murintarmen bereddes, renades och renades T4-fagen och vehikellysaten (Figur 1A). T4-faglysat titrerades med plackanalys och späddes till 2 x 107 pfu/ml (2 x 106 pfu/mus) i SM-buffert. Vehikellysat titrerades också för att bekräfta att det inte fanns någon livskraftig fagförekomst och späddes ut i samma volym SM-buffert som T4-faglysatet. Endotoxinnivåerna kvantifierades i utspädda lysat med hjälp av ett kromogent endotoxinkvantifieringskit. T4-, värmeinaktiverad och vehikelisat hade endotoxinhalter under acceptabla nivåer för dricksvatten (<20 EU/ml)25 (figur 1B). Eftersom vehikellysatet hade en liknande mängd endotoxin som T4-faglysatet ansågs det vara en lämplig kontroll. Det värmeinaktiverade faglysatet (2 x 107 pfu/ml före värmebehandling) hade mindre endotoxin än både vehikeln och T4-faglysatet. Enligt instruktionerna i satsen testades prover som hade behandlats med 1-oktanol för analyshämning genom tillsats av en endotoxinstandard till vehikellysatet (spikad vehikel), för att ge en slutlig koncentration på 0,5 EU/ml. De högsta nivåerna av vehikelendotoxiner minus vehikelendotoxinnivåerna uppmättes 0,5 EU/ml ±25 %, enligt tillverkarens rekommendationer (figur 1B). Detta visade att 1-oktanol avlägsnades framgångsrikt och att det inte fanns någon analyshämning orsakad av lysaten som kunde störa analysresultaten.

E. coli K-12 (BW25113) monokoloniserade C57BL/6-möss föddes upp i en steril flexibel filmvinylisolator under gnotobiotiska förhållanden (Figur 2A). F0-generationens möss koloniserades med E. coli genom dess tillskott till deras miljö och samboende. Endast de avkommor (F1- och F2-generationen) som koloniserades med E. coli från födseln genom vertikal överföring och samlagring användes för experiment. Denna strategi kontrollerade för förändringar i immunsystemet, slemproduktionen och utvecklingen av mag-tarmkanalen som uppstår som svar på bakteriell inokulering22,37, vilket gör det möjligt att mäta förändringar som endast uppstår på grund av fagintroduktion. När de var mogna överfördes försöksmössen till sterila isoburar, där de var och en fick 2 x 106 pfu T4-eller en lika stor volym vehikellysat genom oral sondmatning vid 6-8 veckors ålder. Förekomsten av T4-fager och E. coli övervakades under fyra veckor genom insamling av fekala pellets och spotplateringsanalyser på antingen 0,5 % (mjuk) agar respektive 1,5 % agar. Under experimentets gång kunde T4-och E. coli samexistera utan att någon av populationerna utarmades (Figur 2B, C). Oral administrering av T4-i lägre doser på 2 x 102 och 2 x 104 pfu/mus minskade inte förmågan hos T4-att kolonisera tarmen jämfört med 2 x 106 pfu (Figur 2D). På samma sätt observerades ingen dosberoende effekt av T4-inokulering på E. coli-nivåerna (figur 2E).

Det är viktigt att notera att konsistens i plätering mellan proverna visade sig vara avgörande för antalet plack. Till exempel, när man tillsatte bakterier i den mjuka agaren, bestämdes det att bakteriernas densitet i hög grad påverkade resultatet av analysen. Tillsats av E. coli som subodlades i 1 timme, 1,5 timme eller 2 timme resulterade i lägre plackantal än med tillsats av E. coli subodlad i 2,8 timmar eller mer. Dessutom stabiliserades plackkvantifieringen vid ~1 x 109 pfu/ml när E. coli subodlades i 2,8 timmar till 16 timmar (över natten), vilket var ungefär en 5-faldig ökning jämfört med värdet beräknat från en 1 timmes subkultur (~2 x 108 pfu/ml) (Figur 3A). I stället för subkultivering kan målbakterier inokuleras i mjuk agar från odlingar över natten. Här påverkade volymen av den 16 timmar långa (över natten) E. coli-kulturen som inokulerades i den mjuka agaren antalet plack (Figur 3B). Dessa resultat tyder på att tätheten av E. coli i agarn kan påverka antalet plackanalyser. I båda tillvägagångssätten platåerade fagkvantifieringsresultaten vid samma värde (109 pfu/ml), vilket tyder på att målbakterierna måste ha tillräckligt hög densitet i den mjuka agarn för att säkerställa att plackräkningen är korrekt.

Sammantaget belyser dessa resultat vikten av att utveckla en förståelse för-bakteriers kinetik genom in vitro och in vivo pilotexperiment innan experimentella manipulationer utförs.

Figure 1
Figur 1: Beredning av faglysat. (A) Arbetsflöde för att starta ett faglysat från en fagfagstam med hög titerhalt. Lysat förökades, renades, koncentrerades och endotoxiner avlägsnades. Förorenande 1-oktanol avlägsnades med snabbvakuum. (B) Endotoxiner kvantifierades i- och vehikelisat med hjälp av ett kit för kvantifiering av kromogena endotoxiner. Streckade blå linjer anger de övre och nedre gränserna för att motbevisa produkthämning i produkthämningskontrollen (0,5 EU/ml ± 25 %). Varje punkt representerar ett av två tekniska replikat. Stapelhöjden representerar medelvärdet för replikaten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Generering av monokoloniserade möss och övervakning av- och bakterienivåer i fekala pellets. (A) Arbetsflöde för kolonisering av bakteriefria möss med en enda bakterieart och generering av F1- och F2-monokoloniserade möss. (B-E) Nivåer av T4-och E. coli påvisades i fekala pellets från C57BL/6-möss som föddes monokoloniserade med E. coli och inokulerades med T4-vid 6-8 veckors ålder. Vid dag 0 (före kolonisering) och de angivna dagarna efter kolonisering mättes T4-fagnivåerna genom punktplätering och plackanalyser med hjälp av metoden med ett agarskikt. E. coli-nivåerna mättes genom punktplätering på 1,5 % LB-agar. (B, C) Kinetiken för (B) T4-- och (C) E. coli-nivåer i återvunna fekala pellets efter inokulering med 2 x 106 pfu av T4-eller vehikellysat (normaliserat för volym och endotoxinnivåer). (D, E) (D) T4-- och (E) E. coli-nivåer i återvunna fekala pellets efter inokulering med 2 x 102 pfu, 2 x 104 pfu eller 2 x 106 pfu av T4-. Felstaplar representerar medelvärdet och standardfelet för medelvärdet (SEM). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Felsökningsnoggrannhet i plackanalyser. A) T4-faglysattiter med användning av E. coli-nattkulturer eller subkulturer för beredning av mjuk agar (0,5 % agar, LB). Subkulturer gjordes med hjälp av en 1:50 utspädning av E. coli-odling över natten till färsk LB. 5 ml mjuka agarpreparat inokulerades med 100 μL E. coli och 20 μL T4-. CaCl2 och MgSO4 tillsattes inte till mjukagar för dessa tester men kan tillsättas om så önskas. E. coli subkulturtider under 2,8 timmar resulterade i en lägre skenbar fagtiter. B) T4-faglysattiter med användning av olika E. coli-densiteter vid beredning av mjuk agar. Tillsats av olika volymer av E. coli från en nattkultur (inte subkulturerad, som i A) till den mjuka agarn resulterade i olika skenbara fagtitrar. Felstaplar representerar beräknad fagtiterosäkerhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studiet av fager i mikrobiomet utgör en betydande utmaning jämfört med deras bakteriella motsvarigheter. Specifikt innehåller fager inte en bevarad fylogenetisk markör som är gemensam för alla fager och som är besläktade med 16S- och 18S-ribosomala underenheter som gör det enkelt att sekvensera och identifiera prokaryota respektive eukaryota arter42. Men med framsteg inom nästa generations sekvenseringsmetoder, inklusive ökande läslängder, genomströmning och minskande kostnader, kommer den snabba expansionen av bakteriofaggenomdatabaser 42,43,44. Med mycket grundarbete inom fagupptäckt på god väg är fagforskning nu mer tillgänglig än någonsin. Som nyckelmedlemmar i tarmmikrobiomet, och de mest genetiskt olika organismerna på jorden, utgör fager en spännande vinkel för ny forskning som undersöker mikrobiomets komplexitet. Protokollen som beskrivs här fokuserar på att undersöka kända fagarter hos möss som koloniserats med sina målbakterier. Det bör noteras att dessa protokoll ger en riktlinje för att studera fager in vivo och kan utökas med fältets tillväxt.

Bakteriofagforskning för terapeutisk behandling av bakteriella infektioner blev till stor del omodern i och med antibiotikans intåg på 1940-talet. Överförskrivning och missbruk av antibiotika har dock påskyndat framväxten av multiresistenta patogener som ett stort folkhälsoproblem3. Fager utgör ett attraktivt potentiellt alternativ till antibiotika på grund av deras höga grad av värdspecificitet3. Eftersom fager naturligt bosätter sig som medlemmar av den mänskliga tarmmikrobiomen är det nödvändigt att först förstå de roller som fager spelar i dessa komplexa miljöer. Även om många studier har undersökt förhållandet mellan en och dess målbakterier in vitro, är det viktigt att överväga hur dessa relationer kan hålla i landskapet i mag-tarmkanalen. Liksom i explorativa studier som undersöker de bakteriella komponenterna i mikrobiotan, gör förenklade musmodeller som GF och monokoloniserade möss det möjligt för oss att isolera effekterna av på dess målarter och hur detta förhållande bidrar till immunsvaret. Detta är ett viktigt steg mot fagterapi, eftersom vissa fager kanske inte ger fördelar när de introduceras i tarmen. Till exempel förvärrar Pseudomonas aeruginosa-fagen Pf4 sjukdomen som orsakas av dess värd, genom att hämma både antibakteriella immunsvar och keratinocytmigration, vilket resulterar i försämrad sårläkning18,45. De procedurer som beskrivs här syftar till att standardisera tekniker för att studera fager som medlemmar av murina mikrobiota. Som ett eko av banbrytande studier som undersöker mikrobiotans inverkan på metazovärden, kan fortsatt forskning om fager inom ramen för mikrobiotan visa sig vara spännande och betydelsefull för den bredare förståelsen av multibiomet46.

Begränsningar
Protokollen som beskrivs här har optimerats för att studera konkurrensen mellan T4-och dess målbakterie, E. coli, när T4-fager administreras genom oral sondmatning till E. coli-monokoloniserade möss. Liksom bakterier beter sig olika fagarter från varandra, med olika replikationstider, explosionsstorlekar och intervall avbakteriella mål. När man undersöker andra-bakteriepar i liknande djurmodeller bör man därför vara noga med att optimera dessa protokoll i alla steg. Till exempel kan fager med längre replikationstid och/eller mindre burststorlek kräva en längre inkubation med sitt bakteriella mål för produktion av ett högt titerlysat. På samma sätt kan plattinkubationstiderna behöva förlängas för plackanalyser. Dessutom kan fager med kort replikationstid och/eller hög sprängstorlek kräva kortare plattinkubationer, eftersom inkubation över natten kan resultera i överväxt av plack. Om förökningsförhållandena är okända för en specifik av intresse, bör grunden för att bestämma tillväxtförhållandena fastställas innan in vivo-arbete påbörjas 48.

Ig-liknande domäner som finns i Hoc-kapsidproteinerna i T4-underlättar vidhäftning till tarmslem11. Beroende på den slembindande förmågan hos den valda fagen kan kinetiken för fagbakterienivåerna i fekala prover skilja sig från resultaten som visas i figur 2B-E. Till exempel visades det i gut-on-a-chip-system att fager innehållande intakta Hoc-proteiner hade ökad E. coli-dödande kapacitet jämfört med Hoc-bristfällig11. Även om det misstänks att T4-fager behålls genom slembindning in vivo 11,12,13, kan effekten av återinokulering genom mössens koprofagiska beteende inte uteslutas. Dessa effekter kan minskas genom att använda trådburbottnar eller genom att byta burar ofta. Eftersom Ig-liknande domäner inte har identifierats i ssDNA- eller RNA-fager49 blir det intressant att reda ut de andra strategierna som fager använder för att behålla sin hemvist i tarmslemhinnan.

Slutligen har dessa explorativa studier undersökt-bakterier-värdinteraktioner endast vid homeostas. I djurmodeller av mänskliga sjukdomar är det okänt hur förändringar i tarmbarriärens integritet, såsom vid IBD, kan påverka dessa interaktioner. Nyligen genomförda studier har visat att Caudovirales fager har ökad rikedom och mångfald hos patienter med IBD 7,8. I musmodeller visades att kontinuerlig fagbehandling förvärrade dextrannatriumsulfat (DSS)-inducerad experimentell kolit8. Det återstår att avgöra hur-bakterie-värdinteraktioner utspelar sig i inflammatoriska miljöer, och om försämrad barriärintegritet underlättar faginducerad inflammation.

Felsökning och alternativa metoder

Mus modeller
Monokoloniserade musmodeller gör det möjligt att undersöka en enda bakterieart på värdfysiologi16. Forskning på monokoloniserade möss har spelat en avgörande roll för att belysa hur mikrobiotan påverkar immunsystemet22. Som modellsystem rekapitulerar monokoloniserade möss inte fysiologin hos sina konventionella mikrobiotamotsvarigheter. Mer lik GF-möss har E. coli-monokoloniserade möss minskad slemproduktion (liknande GF-möss50) och ett omoget immunsystem23. Monokoloniserade möss har dock varit ovärderliga för att reda ut de mikrobspecifika effekterna av enskilda arter på mag-tarmkanalen och immunutvecklingen. Ett klassiskt exempel är upptäckten att segmenterade filamentösa bakterier (SFB) är potenta inducerare av CD4+ T-hjälparceller 17 i möss24. När det gäller slem finns det mikrobspecifika effekter på slem-gentranskription51och slemtjocklek50. Även om de är begränsade, ger monokoloniserade möss möjligheter att undersöka effekten av ett-bakteriepar på däggdjursvärden i en kontrollerad modell. Det är viktigt att fager kan, och bör, undersökas i samband med en komplex mikrobiota. I skrivande stund har få studier behandlat effekterna av fagpredation av kommensala bakteriearter inom ett konventionellt mikrobiom. Detta är en framtida tillämpning av de protokoll som presenteras i denna artikel, som kan anpassas för att underlätta dessa studier.

Användning av lämpliga fordonsreglage
Lämpliga kontroller är viktiga i alla experiment. Här definierades en lämplig vehikel för oral administrering till möss som styr för flerstegsrengöring och rening av T4-faglysat. Ett viktigt krav är att vehikelkontrollen innehåller en lika hög nivå av bakteriella endotoxiner som faglysatet, för att kontrollera för eventuella endotoxinmedierade immunsvar. Kloroform och 1-oktanol tillsätts lysatet som en del av reningsprocessen och avlägsnas därefter. För att kontrollera potentiella immunsvar som kan genereras för att spåra nivåer av dessa kemikalier kan ett fagfritt bakterielysat produceras som en vehikelkontroll. T4-- och vehikelisat innehöll en mycket låg koncentration av bakteriella endotoxiner, långt under de nivåer som är tillåtna i dricksvatten25 (figur 1B). Alternativa kontroller kan användas och kan modifieras för att passa den tänkta forskningsfrågan. Enklast kan fagbuffert som innehåller en motsvarande mängd endotoxin användas, även om detta inte tar hänsyn till rengörings- och reningsprocesserna i flera steg. Gogokhia et al.8rapporterade användningen av värmeinaktiverad som en kontroll för huruvida fagprotein utan DNA var tillräckligt för att framkalla ett immunsvar. I våra händer hade värmeinaktiverad lägre nivåer av endotoxin än T4-faglysat (Figur 1B), och användes därför inte för att kontrollera för endotoxinnivåer i denna studie. Vi uppmuntrar dock testning av båda protokollen för att avgöra vilken metod som är mest lämplig för individuella experimentella ändamål. Om vehikeln och T4-faglysat skiljer sig signifikant i mängden endotoxin kan lysatet som innehåller de lägre halterna kompletteras med renat endotoxin. 1-oktanol tillsätts lysat under reningsprocessen men inaktiverar testet för kromogen endotoxinkvantifieringssats. Det är viktigt att testa produkthämning av potentiellt störande ämnen i provet för att säkerställa att endotoxinmätningarna är korrekta. Om produkthämning misstänks är det möjligt att provet inte snabbdammsögs tillräckligt länge. Om problemen kvarstår kan dialys användas för att avlägsna kvarvarande 1-oktanol25.

Administreringssätt och dos
På grund av den slembindande förmågan hos T4-fager inokulerades musmodeller i en enda oral sonddos. Syftet med detta var att övervaka varaktigheten av- och E. coli-samlevnad i mag-tarmkanalen; Andra metoder för att studera fager in vivo-modeller har dock rapporterats. Till exempel har fagberikat dricksvatten använts för att ge en kontinuerlig tillförsel av till möss 8,20. Fördelen med denna administreringsmetod är att fager kontinuerligt fylls på, även i frånvaro av en bakteriell värd, vilket visats av Gogokhia et al.8. Denna experimentella design möjliggjorde utvärdering av immunsvaret mot fager i frånvaro av bakterier och gav kontinuerlig immunstimulering under experimentets gång. Fysiologiskt representerar denna metod inte ett naturligt förlopp av faginfektion eller fagkolonisering av en tarmmiljö, men den ger viktiga insikter om hur upprepad fagexponering kan förbereda immunsystemet. Detta har betydelse i samband med fagterapiutveckling, eftersom fagcocktails kan levereras som en behandlingskur för att behandla bakteriella infektioner i tarmen, liknande antibiotikaregimer. I samband med T4--E. coli-paret bestämdes det att en minskning av dosen av T4-som applicerades oralt på monokoloniserade möss inte förändrade fekala- eller bakterienivåer (Figur 2D, E). Därför är inokuleringsdosen av T4-i detta fall inte avgörande för upprätthållandet av stabil T4--E. coli-kolonisering i tarmen hos bikoloniserade möss. Det noteras att den lägsta administrerade dosen var 200 pfu/mus, och den högsta dosen var 2 x 106 pfu/mus (enligt Hsu et al.) 2. Därför finns det inga data som stöder T4--E. coli-kinetik utanför detta intervall i denna studie.

Spot- och helplattafagtitrar
För mätning av T4-fagnivåer i avföring och vävnader förlitar sig protokollen som beskrivs här på punktpläteringstekniker snarare än plackanalyser på hela plattan, vilket kan bidra till variationen i fagnivåer mellan möss (figur 2B). I helplåtstekniker räknas plack över ett större område, vilket möjliggör mer exakt kvantifiering. En lämplig utspädning av varje prov måste dock vanligtvis fastställas i förväg genom punktplätering. Eftersom proverna analyserades samma dag som proverna samlades in ansågs punktplätering vara den lämpligaste metoden för en mer storskalig metod. Därför representeras upplösningen av dessa data mest exakt av storleksordningen på fagen i varje prov. För exakta fagmätningar finns det ytterligare överväganden för varje. Mer noggranna mätningar kan erhållas genom helplattanalyser eller genom att använda mindre seriella utspädningsintervall för varje prov. Om dessa metoder fortfarande resulterar i varierande antal fager eller målbakterier, skulle det vara klokt att bedöma om unika interaktioner mellan fagen och bakterierna kan förklara skillnader mellan enskilda möss via metagenomisk sekvensering eller andra metoder för att experimentellt bedöma samevolution och resistens. Enligt Bonilla et al.25 är det viktigt att vara konsekvent med mängden bakteriell värd som tillsätts25 när man förbereder mjuk agar för plackanalyser. Som visas i figur 3 kan även relativt små förändringar i bakterieodlingstider (figur 3A) och densitet (figur 3B) påverka noggrannheten i plackanalyser. Dessa fynd kan vara annorlunda för andra-bakteriepar, och liknande experiment rekommenderas när man börjar med nya organismer. Dessutom, för nya-bakteriepar, bör undersökande experiment utföras för att bestämma tillväxtegenskaperna hos var och en. Till exempel kan tillväxtkurvor utföras för att bestämma bakteriernas fördröjning, exponentiella och stationära faser och tillväxthastighet. Tillväxtexperimentet i ett steg kan användas för att bestämma latensperioden (tid till lys) och sprängstorlek (antalet fager som frisätts vid bakterielys) för fager52,53.

Alternativ T4-fagmätning med qPCR
Kvantifiering av fager kan utföras med plackanalyser, som beskrivits ovan, eller via kvantitativ polymeraskedjereaktion (qPCR). Dessa två tillvägagångssätt har en viktig skillnad: plackanalyser bestämmer antalet livskraftiga fager som kan infektera och döda sina bakterievärdar, medan qPCR kvantifierar fagspecifikt genetiskt material (som en proxy för antalet fager som finns) men ger ingen information om fagens livskraft och smittsamhet. qPCR utfördes för att jämföra kvantifieringen av faggenkopior med plack som bildats i plackanalyser med hjälp av primers som beskrivits av Hsu et al.2 (Figur 4). T4--DNA extraherades och amplifierades från cekalinnehållet i T4-/E. coli-bikoloniserade möss. Hos de flesta möss påvisades liknande nivåer av T4-i cekalinnehållet i qPCR- och plackanalyser (Figur 4A, B). Även om en viss amplifiering detekterades i vehikelinokulerat cekalinnehåll, låg de beräknade genkopiorna/g under detektionsgränsen (LOD) (Figur 4A). Frånvaron av kvantifierbar i dessa prover bekräftades med gelelektrofores. T4-faggenprodukter (96 bp) kunde lätt visualiseras i DNA isolerat från cekalinnehåll från T4-inokulerade möss, men saknades i vehikelkontroller (Figur 4C).

I dessa tester detekterades kopior av T4-faggener i cekalinnehållet hos en T4-fagkoloniserad mus med qPCR (Figur 4A, pil) trots oförmågan att detektera T4 i plackanalyser från samma prov (Figur 4B, pil). Dessa resultat tyder på att viruspartiklar som inte bildar plack kan uppstå in vivo, antingen på grund av produktion av defekta viruspartiklar eller samevolution av fager och/eller bakterier. Bakteriepläteringstekniker på hårdagar kan användas för att bestämma fekala bakteriers känslighet för14. Vi föreslår att qPCR-medierad detektion kan vara ett värdefullt tillskott till in vivo-fagarbetsflöden eftersom det kan vara mer robust för fagevolution i tarmmiljön eftersom det riktar sig mot korta, bevarade gensekvenser. Icke-partiska metoder som metagenomik är värdefulla för att undersöka-bakteriell samevolution och relativa mängder, men kan i slutändan vara mer kostsamma.

Figure 4
Figur 4: Detektion av T 4-med qPCR. (A,B) T4-fagbelastning mättes via (A) absolut qPCR eller (B) plackanalys i cekalinnehållet hos E. coli-koloniserade C57BL/6-möss vid dag 29 efter inokulering med T4-eller vehikel. Pilen visar resultat från en enskild mus som hade detekterbara T4-genomkopior men inte troligt virus i cekalinnehåll. C) Gelelektrofores av PCR-produkter som visar förekomst av 96 bp-bandet i T4-faginokulerade cekala prover, men inte i vehikelinokulerade prover. En DNA-stege på 100 bp användes. LOD = detektionsgräns. Felstaplar representerar medelvärde och SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Program
Bakteriofager utgör uppemot 90 % av de virusliknande partiklar som finns i mikrobiomet44; Fagers inverkan på tarmmikrobiomet är dock dåligt förstådd. Initiala studier som undersökte den bakteriella komponenten i mikrobiomet gjorde det genom att isolera vissa arter och studera deras inverkan på immunmognad22,24. Liknande förhör med phageome utgör en skrämmande men nödvändig uppgift, och ett krav för att få en omfattande förståelse av multibiomet46. Även om fokus för fagterapiutveckling tenderar att vara inriktat på att bota septiska bakterieinfektioner, är det viktigt att förstå hur tillsatsen av en fagcocktail till mag-tarmkanalen kan förändra tarmens ekosystem. Dessutom bör säkerheten hos terapeutiska fagcocktails bedömas genom att en immunprofil genereras. Fager har undersökts som potentiella behandlingar för bakteriella infektioner i tarmen, såsom C. difficile5 och Salmonella enterica serovar Typhimurium54. Nyligen genomförda studier har också visat att FFT är lika eller mer effektiva vid behandling av nekrotiserande enterokolit hos för tidigt födda grisar9, vilket tyder på att den virala komponenten i fekala mikrobiotatransplantationer (FMT) kan spela en aktiv roll för att minska sjukdomen. Fortsatta studier som undersöker fagers roll i mikrobiomet är motiverade för att främja utvecklingen av fagterapier mot tarmpatogener, men också för att bättre informera FMT som behandling av sjukdom. Genom att standardisera metoder för studier av fager in vivo kommer transparensen och reproducerbarheten i fagforskningen att öka, tillsammans med vägledning för dem som utvidgar sitt arbete till musmodeller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Författarna erkänner att marken de utförde denna forskning på är det traditionella, förfäderna och icke-överlåtna territoriet för xwməθkwəy̓əm (Musqueam) Nation. Marken den ligger på har alltid varit en plats för lärande för Musqueam-folket, som i årtusenden har fört vidare i sin kultur, historia och traditioner från en generation till nästa på denna plats. Vi uppmuntrar andra att lära sig mer om de hemländer där de bor och arbetar på https://native-land.ca. Författarna erkänner stöd från Natural Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC) Canadian Graduate Scholarships - Master's (NP), Michael Smith Health Research BC Trainee Award (RT-2023-3174, till MH), Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) Discovery Grants Program (RGPIN-2019-04591 till CT, RGPIN-2016-04282 till LCO), Canadian Institute for Advanced Research / Humans and the Microbiome (FL-001253 Appt 3362, till C.T.), Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award (18239, till C.T.), Canadian Institutes for Health Research (PJT-159458 till LCO) och Canadian Foundation for Innovation (34673 till LCO och 38277 till CT). Vi är tacksamma för tekniskt stöd från UBC Centre for Disease Modelling och ubcFLOW, som stöds av UBC GREx Biological Resilience Initiative, och till medlemmar i Osborne- och Tropini-laboratorierna för kritiska diskussioner och utvärdering av manuskriptet. Figur 1A och figur 2A skapades med hjälp av Biorender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-octanol (99%) Thermofisher CAAAA15977-AP
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units Millipore Sigma  SCGP00525
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) Fisher BioReagents  BP160-500
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 Millipore Sigma UFC910008
BD Microtainer® Tubes, SST BD Medical 365967
Bioexclusion airtight cages (ISO cages)  Techiplast 1245ISOCAGE
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module BioRad 1851196
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) Fisher BioReagents BP510-500
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk Andwin Scientific  16812612
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) Fisher C298-500
Copper coated steel beads (4.5 mm) Crosman Corporation 0767
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) Thermo Scientific  69504
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) Thermo Scientific  K1081
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O Sigma Aldrich E7889
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™  Fisher Bioreagents BP1423-500
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox  Fisher Bioreagents BP1427-500
GeneRuler 100 bp DNA Ladder Thermo Scientific  SM0241
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns QuantaBio 95072-012
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED Techiplast UISOHEPAXTBOX-300
Magnesium sulfate heptahydrate Fisher BioReagents BP213-1
MaxQ 6000 Incubated Shaker Thermo Scientific  8354-30-0009
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox Fisher BioReagents BP1427-500
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml Fisher 14-666-315
Parafilm sealing film Bemis PM-996
Phage stocks Carolina Biological Supply  n/a
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT LabDiet 5R58
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit Thermo Scientific  A39552S
RNase A (17,500 U) Qiagen 19101
RNase-free DNase Set Qiagen  79254
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) Fisher Chemical BP328-500
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) Fisher Chemical S271
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) Fisher scentific  n/a
Sterile flexible film isolator  Class Biologically Clean  n/a
SYBR™ Safe DNA Gel Stain Invitrogen S33102
T100 Thermal Cycler  BioRad 1861096
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) IDT n/a
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) IDT n/a
TissueLyser II  Qiagen  85300
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure Thermo Scientific  AAJ22638AE
Water, (DNASE, RNASE free) Fisher BioReagents BP2484100

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rohwer, F., Segall, A. M. A century of phage lessons. Nature. 528 (7580), 46-47 (2015).
  2. Hsu, B. B., et al. Dynamic modulation of the gut microbiota and metabolome by bacteriophages in a mouse model. Cell Host & Microbe. 25 (6), 803-814.e5 (2019).
  3. Gordillo Altamirano, F. L., Barr, J. J. Phage Therapy in the postantibiotic era. Clinical Microbiology Reviews. 32 (2), (2019).
  4. Schooley, R. T., et al. Development and use of personalized bacteriophage-based therapeutic cocktails to treat a patient with a disseminated resistant Acinetobacter baumannii infection. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 61 (10), (2017).
  5. Ott, S. J., et al. Efficacy of Sterile Fecal Filtrate Transfer for Treating Patients With Clostridium difficile Infection. Gastroenterology. 152 (4), 799-811.e7 (2017).
  6. Zuo, T., et al. Bacteriophage transfer during faecal microbiota transplantation in Clostridium difficile infection is associated with treatment outcome. Gut. 67 (4), 634-643 (2018).
  7. Norman, J. M., et al. Disease-specific alterations in the enteric virome in inflammatory bowel disease. Cell. 160 (3), 447-460 (2015).
  8. Gogokhia, L., et al. Expansion of bacteriophages is linked to aggravated intestinal inflammation and colitis. Cell Host & Microbe. 25 (2), 285-299.e8 (2019).
  9. Brunse, A., et al. Fecal filtrate transplantation protects against necrotizing enterocolitis. The ISME Journal. 16 (3), 686-694 (2022).
  10. Duerkop, B. A., Clements, C. V., Rollins, D., Rodrigues, J. L. M., Hooper, L. V. A composite bacteriophage alters colonization by an intestinal commensal bacterium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (43), 17621-17626 (2012).
  11. Barr, J. J., et al. Bacteriophage adhering to mucus provide a non-host-derived immunity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (26), 10771-10776 (2013).
  12. Nguyen, S., et al. Bacteriophage Transcytosis provides a mechanism to cross epithelial cell layers. mBio. 8 (6), (2017).
  13. Bichet, M. C., et al. Bacteriophage uptake by mammalian cell layers represents a potential sink that may impact phage therapy. iScience. 24 (4), 102287 (2021).
  14. Buttimer, C., et al. Impact of a phage cocktail targeting Escherichia coli and Enterococcus faecalis as members of a gut bacterial consortium in vitro and in vivo. Frontiers in Microbiology. 13, 936083 (2022).
  15. Li, Y., et al. Bacteriophages allow selective depletion of gut bacteria to produce a targeted-bacterium-depleted mouse model. Cell Reports Methods. 2 (11), 100324 (2022).
  16. Reyes, A., Wu, M., McNulty, N. P., Rohwer, F. L., Gordon, J. I. Gnotobiotic mouse model of phage-bacterial host dynamics in the human gut. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20236-20241 (2013).
  17. Federici, S., et al. Targeted suppression of human IBD-associated gut microbiota commensals by phage consortia for treatment of intestinal inflammation. Cell. 185 (16), 2879-2898.e4 (2022).
  18. Sweere, J. M., et al. Bacteriophage trigger antiviral immunity and prevent clearance of bacterial infection. Science (New York, N.Y.). 363 (6434), (2019).
  19. Fluckiger, A., et al. Cross-reactivity between tumor MHC class I-restricted antigens and an enterococcal bacteriophage. Science (New York, N.Y.). 369 (6506), 936-942 (2020).
  20. Majewska, J., et al. Induction of Phage-Specific Antibodies by Two Therapeutic Staphylococcal Bacteriophages Administered per os. Frontiers in Immunology. 10, 2607 (2019).
  21. Weiss, M., et al. In vivo replication of T4 and T7 bacteriophages in germ-free mice colonized with Escherichia coli. Virology. 393 (1), 16-23 (2009).
  22. Thomson, C. A., Morgan, S. C., Ohland, C., McCoy, K. D. From germ-free to wild: modulating microbiome complexity to understand mucosal immunology. Mucosal Immunology. 15 (6), 1085-1094 (2022).
  23. Al-Asmakh, M., Zadjali, F. Use of germ-free animal models in microbiota-related research. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (10), 1583-1588 (2015).
  24. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  25. Bonilla, N., et al. Phage on tap-a quick and efficient protocol for the preparation of bacteriophage laboratory stocks. PeerJ. 4, e2261 (2016).
  26. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 1, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, NY. (2001).
  27. Kropinski, A. M., Mazzocco, A., Waddell, T. E., Lingohr, E., Johnson, R. P. Enumeration of bacteriophages by double agar overlay plaque assay. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 501, 69-76 (2009).
  28. Manikantha, B., Karthika, R., Murugadas, V., Vishnuvinayagam, S., Rao, B. M. Comparison of the single agar and double agar layer methods for enumeration of bacteriophages. Fishery Technology. 59, 60-63 (2022).
  29. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
  30. Louten, J. Chapter 7 - Detection and diagnosis of viral infections. Essential Human Virology. , 111-132 (2016).
  31. Richter, Ł, et al. Adsorption of bacteriophages on polypropylene labware affects the reproducibility of phage research. Scientific Reports. 11 (1), 7387 (2021).
  32. Merck KGaA. Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Devices. , Darmstadt, Germany. https://www.emdmillipore.com/CA/en/product/Amicon-Ultra-15-Centrifugal-Filter-Unit,MM_NF-UFC901024#documentation (2018).
  33. Hecker, W., Witthauer, D., Staerk, A. Validation of dry heat inactivation of bacterial endotoxins. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology. 48 (4), 197-204 (1994).
  34. Jakočiūnė, D., Moodley, A. A Rapid bacteriophage DNA extraction method. Methods and Protocols. 1 (3), 27 (2018).
  35. Zucoloto, A. Z., Yu, I. L., McCoy, K. D., McDonald, B. Generation, maintenance, and monitoring of gnotobiotic mice. STAR Protocols. 2 (2), 100536 (2021).
  36. Ng, K. M., et al. Single-strain behavior predicts responses to environmental pH and osmolality in the gut microbiota. mBio. 14 (4), e0075323 (2023).
  37. McCallum, G., Tropini, C. The gut microbiota and its biogeography. Nature Reviews. Microbiology. , (2023).
  38. Bergstrom, K., Xia, L. The barrier and beyond: Roles of intestinal mucus and mucin-type O-glycosylation in resistance and tolerance defense strategies guiding host-microbe symbiosis. Gut Microbes. 14 (1), 2052699 (2022).
  39. Askar, M., Ashraf, W., Scammell, B., Bayston, R. Comparison of different human tissue processing methods for maximization of bacterial recovery. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 149-155 (2019).
  40. Redanz, S., Podbielski, A., Warnke, P. Improved microbiological diagnostic due to utilization of a high-throughput homogenizer for routine tissue processing. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 82 (3), 189-193 (2015).
  41. Bhinder, G., et al. The Citrobacter rodentium mouse model: studying pathogen and host contributions to infectious colitis. Journal of Visualized Experiments. 72, e50222 (2013).
  42. Reyes, A., Semenkovich, N. P., Whiteson, K., Rohwer, F., Gordon, J. I. Going viral: next-generation sequencing applied to phage populations in the human gut. Nature Reviews Microbiology. 10 (9), 607-617 (2012).
  43. Camarillo-Guerrero, L. F., Almeida, A., Rangel-Pineros, G., Finn, R. D., Lawley, T. D. Massive expansion of human gut bacteriophage diversity. Cell. 184 (4), 1098-1109.e9 (2021).
  44. Reyes, A., et al. Viruses in the faecal microbiota of monozygotic twins and their mothers. Nature. 466 (7304), 334-338 (2010).
  45. Bach, M. S., et al. Filamentous bacteriophage delays healing of Pseudomonas-infected wounds. Cell Reports. Medicine. 3 (6), 100656 (2022).
  46. Filyk, H. A., Osborne, L. C. The multibiome: The intestinal ecosystem's influence on immune homeostasis, health, and disease. EBioMedicine. 13, 46-54 (2016).
  47. Rohwer, F., Merry, Y., Maughan, H., Hisakawa, N. Heather Life in Our Phage World: A Centennial Field Guide to the Earth's Most Diverse Inhabitants. Wholon. , San Diego. (2014).
  48. Glonti, T., Pirnay, J. P. In Vitro techniques and measurements of phage characteristics that are important for phage therapy success. Viruses. 14 (7), 1490 (2022).
  49. Fraser, J. S., Yu, Z., Maxwell, K. L., Davidson, A. R. Ig-like domains on bacteriophages: a tale of promiscuity and deceit. Journal of Molecular Biology. 359 (2), 496-507 (2006).
  50. Li, H., et al. The outer mucus layer hosts a distinct intestinal microbial niche. Nature Communications. 6, 8292 (2015).
  51. Bergström, A., et al. Nature of bacterial colonization influences transcription of mucin genes in mice during the first week of life. BMC Research Notes. 5, 402 (2012).
  52. Adams, M. H. Bacteriophages. , Interscience Publishers. https://books.google.co.uk/books?id=3wVrAAAAMAAJ (1959).
  53. Kutter, E., Sulakvelidze, A. Bacteriophages: Biology and Applications. , CRC Press. https://books.google.co.uk/books?id=flHOvAEACAAJ (2004).
  54. Bao, H., et al. Dysbiosis and intestinal inflammation caused by Salmonella Typhimurium in mice can be alleviated by preadministration of a lytic phage. Microbiological Research. 260, 127020 (2022).

Tags

Immunologi och infektion utgåva 203 Bakteriofager musmodeller gnotobiotiska mikrobiota värd-patogeninteraktioner T4- E. coli
T4 Bakteriofag och <i>E. coli</i> interaktion i murintarmen: En prototypisk modell för att studera värd-bakteriofagdynamik in vivo
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Pett, N., Hunter, M., Carranza… More

Pett, N., Hunter, M., Carranza García, N. A., Seo, J. H., Collins, S. R., Rohwer, F., Osborne, L. C., Tropini, C. T4 Bacteriophage and E. coli Interaction in the Murine Intestine: A Prototypical Model for Studying Host-Bacteriophage Dynamics In Vivo. J. Vis. Exp. (203), e65906, doi:10.3791/65906 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter