Summary
細菌に感染するウイルスであるバクテリオファージ(ファージ)は、腸内細菌叢の不可欠な構成要素です。これらの共生生物は細菌の適応度と個体群動態を促進しますが、腸の恒常性や疾患にどのような影響を与えるかについてはほとんどわかっていません。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に適応可能なマウス モデル内の隔離されたT4バクテリオファージを調査する。
Abstract
バクテリオファージ(ファージ)は、種レベルおよび株レベルの特異性を持つ細菌に感染するウイルスであり、既知のすべての生態系で最も豊富な生物学的実体です。腸内細菌叢に見られるような細菌群集内では、ファージは微生物叢の個体群動態を調節し、細菌の進化を促進することに関与しています。過去10年間でファージ研究への関心が再燃しており、その理由の一つは、溶解性ファージの宿主特異的な殺傷能力が、抗菌薬耐性菌の脅威の高まりに対抗するための有望なツールを提供していることです。さらに、ファージが腸粘液に付着することを示す最近の研究では、ファージが下にある上皮への細菌の侵入を防ぐ保護的な役割を担っている可能性があることが示唆されています。重要なことは、細菌のマイクロバイオームと同様に、ファジョームの破壊は炎症性腸疾患などの疾患の転帰の悪化と関連していることです。これまでの研究では、ファージが糞便濾液移植によって動物やヒトのマイクロバイオームを調節し、宿主の健康に利益をもたらすことが実証されています。この最近の研究の波により、腸内細菌叢の文脈でファージを研究するためのプロトコルを確立し、標準化する必要性が生じています。 このプロトコルはマウスの胃腸管において隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の宿主、 大腸菌を、調査する一組のプロシージャを提供する。ここで説明する方法は、ファージライセートから開始し、それをマウスに投与し、細菌の宿主とファージレベルへの影響を評価する方法を概説します。このプロトコルは他のバクテリオファージ細菌の組に修正され、加えることができ、生体内で宿主バクテリオファージの原動力を調査するための出発点を提供する 。
Introduction
バクテリオファージ(ファージ)は、細菌に感染して殺すウイルスで、種と菌株レベルの特異性があります1。ファージは、腸内細菌叢などの複雑な細菌群集で重要な役割を果たしており、個体群動態の調節や細菌の適応度の向上に関与しています2。過去10年間、抗菌薬耐性病原体の台頭3と、代替治療戦略としてのファージ療法の可能性により、ファージ研究への関心が再燃しています。近年、溶解性ファージカクテルは静脈内投与され、ヒトの重篤な抗生物質耐性細菌性敗血症感染症に一定の成功を収めています3,4。経口ファージ療法は、腸の感染症や炎症を治療するための抗生物質の潜在的な代替手段としても提案されています。さらに、ファージは、早産ブタの再発性クロストリジオイデス・ディフィシル感染症(rCDI)5,6、炎症性腸疾患(IBD)7,8、壊死性腸炎の治療において、細菌を除去するためにろ過された糞便微生物叢製剤である糞便濾液移植(FFT)の成功に関与しています9.これらの結果を考えると、既存のコミュニティに新規ファージを追加すると、標的細菌だけでなくコミュニティ全体に間接的な影響を与える可能性があるため、ファージと腸内細菌叢、およびファージと哺乳類宿主の両方との相互作用を考慮することが重要です2,10。
in vitroでのファージと標的細菌との相互作用の研究は、腸内におけるファージと細菌の相互作用のメカニズムと影響を理解するのに役立つことが証明されています。この設定では、カウドビラール目の大腸菌特異的T4ファージが腸粘液に付着するために、ビリオン表面の高抗原外カプシド(Hoc)タンパク質内に位置する免疫グロブリン(Ig)様ドメインを必要とすることが示されている11。さらに、トランズウェルアッセイは、T4ファージが上皮細胞培養と相互作用し、マクロピノサイトーシスによって細胞層を通過できることが示されています12,13。これらの結果は、ファージが真核細胞に感染できないにもかかわらず、後生動物の宿主と相互作用できるという仮説を支持しています。これらのモデルは有用ではあるが、ファージ、バクテリア、および後生動物の宿主間の三者間相互作用を包括的に調査するために必要な、腸内生態系で発生する複雑な相互作用の全範囲を欠いている。
マウスモデルは、複雑な環境下でファージを調査するための重要なツールです。ファージ投与の望ましい適用は、IBDを含む慢性炎症性疾患に関連する抗菌薬耐性感染症または病原菌を治療するための代替戦略としてである。しかし、新しい文献は、in vitroでのファージの挙動がin vivoの機能を完全には表していないことを示唆しています。Buttimerら14は、ファージカクテルは、簡略化されたヒト微生物叢コンソーシアムでは標的細菌を枯渇させることができたが、同じ細菌-ファージコンソーシアムでコロニーを形成したgnotobioticマウスではin vivoで再現できなかったことを実証した。さらに、従来のマウスマイクロバイオームでは、T7ファージは標的腸内細菌の選択的枯渇を引き起こしたが、時間の経過とともに緩やかな回復が観察され、耐性が進化したことを示している15。他の研究では、経口投与されたファージとその標的細菌株がin vivoで共存していることが実証されています2,16。実際、ファージとバクテリアの共存を超えて、ファージ投与は全体的な微生物叢群集の構成と機能に広範な変化をもたらしました2,16。いくつかの研究で、細菌量の変化とは無関係に、カウドウイルス類の相対存在量の増加とIBD 7,8,17との関連が明らかになっているため、これは疾患状況に関連しています7。これが病気の病因の要因なのか結果なのかは不明のままです。
ファージ調査の歴史的焦点は、ファージとその標的細菌との関係に関するものでした。ただし、ファージと後生動物の粘膜、上皮、および免疫系との間の潜在的な相互作用を考慮することも重要です。これらの相互作用はすべて、腸管ファージ感染に対する全体的な反応において重要な役割を果たします。これを実証するために、ファージは微生物叢8による干渉なしで免疫系への影響を解明するために無菌(GF)マウスを使用して研究されています。このシステムでは、ファージ核酸は、食作用免疫細胞(マクロファージおよび樹状細胞)のエンドソーム内に位置するToll様受容体(TLR)によって検出されました。これにより、下流のシグナル伝達が活性化され、インターフェロン(IFN)-γ 8またはI型IFN18のT細胞依存性産生が刺激された。さらに、Fluckigerらは、ファージコード(プロファージ)抗原の認識にメモリーCD8+ T細胞を関与させ、その結果、T細胞が腫瘍抗原と交差反応し、腫瘍負荷が軽減されたことを示しました。最後に、ファージ特異的抗体産生は、ファージが飲料水を介して継続的に動物モデルに送達されたマウス研究で文書化されており8,20、または数ヶ月にわたって繰り返し経口強制経口投与によって20、ファージタンパク質が体液性免疫応答を促進する能力を実証しています。ファージ接種のこれらのモードは、免疫系の最適かつ継続的なプライミングを可能にしますが、ファージと腸環境との間の自然に発生する相互作用や、経口適用されたファージ療法の動態を表していない可能性があります。これまでのところ、限られた数の研究が、単一コロニー化されたマウスモデルにおけるファージと単一の細菌種との相互作用を調べた21。しかし、単コロニー化されたマウスは、消化管(GI)と免疫発達に対する個々の種の微生物特異的な影響を解読する上で重要であることが証明され22,23,24、ファージ、標的細菌、および後生動物の宿主の間の三者間相互作用を理解するのに有用であることが証明される可能性があります。
興味深いことに、腸内ファージと腸内共生細菌の相互作用、および後生動物の宿主とその中に存在するファージとの間で発生する相互作用については、まだ学ぶべきことがたくさんあります。このプロトコルはgnotobioticマウス モデルを使用して隔離されたT4バクテリオファージおよび細菌の同等、 エシェリヒ属大腸菌 (K-12、BW25113)を調査する一組のプロシージャを提供する。また、これらの標準化された手順は、増殖パラメータを目的のペアに適合させることにより、他のファージ/バクテリアダイアドを最適化するための基盤を提供します。ここで説明する方法は、(1)マウスの経口強制経口投与のためのT4ファージおよびビヒクルライセートの調製;(2) 大腸菌 モノコロニー化gnotobioticマウスへのT4ファージの経口投与;(3)マウスの糞便および組織のT4ファージレベルを経時的に監視する。
ここで紹介した代表的な結果として、精製したT4ファージライセートは、Rohwer Labが管理するファージバンクストックから増殖させました。T4ファージを伝播させるためのファージ・オン・タップ法は、このプロトコルで参照されているように、適合させた25。この方法では、3日以内に高力価のエンドトキシン低ファージストックが得られます。このアプローチを利用して、10 mLの≥ 1010プラーク形成単位(pfu)/mLのT4ファージと<0.5エンドトキシン単位(EU)/mLを日常的に収集しました。マウスへの経口投与または静脈内投与の推奨エンドトキシンレベルは、それぞれ≤ 20 EU/mLおよび≤ 5 EU/kg/h(または20 gマウスの場合は0.1 EU)であり、in vivo 接種に適したファージ調製法です。すべてのファージストックを生理食塩水マグネシウム(SM)ファージバッファー(ステップ1.1.5.1で提供)に4°Cで保存しました。 大腸菌 はLB培地で培養した。さまざまなバクテリオファージとバクテリアのペアについて、多様な培地と成長条件をこのプロトコルから適合させることができます。ファージはまた、廃水、海水、土壌および腸内容物などの環境から供給することができ、SambrookおよびRussell26に従って、対象の各ファージ−宿主対25に対する適切な増殖および増殖条件を用いて調製前に単離および精製することができる。あるいは、ファージは、市販の供給源( 材料表を参照)またはファージバンクから得ることができる。
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Protocol
すべての実験は、UBC動物管理委員会およびバイオセーフティ委員会が承認したプロトコル(A23-0113、B19-0038)によって確立されたガイドラインに従って実施されました。マウスは、ブリティッシュコロンビア大学の疾病モデリングセンターの病原体のない条件下で飼育されました。C57BL/6マウスは、無菌マウスの餌、水、寝具、巣材を備えた無菌フレキシブルフィルムアイソレーターで施設内で飼育されました。マウスは12時間の昼/夜サイクルで維持された。実験用マウスは、雄と雌の両方で、各実験内で年齢を一致させ、生後6〜12週、体重15〜30gでした。
1. マウスへの経口強制経口投与用ファージおよびビヒクルライセートの調製
- ファージの精製とストック生成
注:この研究では、T4ファージを増殖させ、以下に説明する単一寒天層法を使用して細菌の芝生にメッキすることによって滴定します。二重寒天層法については、すでに説明したとおりである25,27また、同様の効果で使用することもできます。このプロトコルでは、プラークの視認性が向上するため、寒天単層法が選択されました28.- 大 腸菌 を滅菌ポリスチレンまたはガラス培養チューブ(キャップ付き)の滅菌LB培地5 mLで増殖させます。チューブを37°Cでインキュベートし、200rpmで一晩振とうし、固定相に達するまで加熱します。
- 添加前に、0.5%寒天でLBをオートクレーブし、50°C以下(液体のまま)に冷却することにより、ガラス培地ボトルに軟寒天を調製します。プレートあたり15 mLの十分な軟寒天を調製します。
- 軟寒天にMgSO4 およびCaCl2をそれぞれ最終濃度1 mMになるまで添加します。軟寒天培地3mLごとに100μLの一晩中 大腸菌 培養液を加えます。磁気攪拌子を使用して静かに攪拌し、サプリメントを均一化し、軟寒天で培養します。
注:軟寒天培地に添加される 大腸菌の量と密度の一貫性は非常に重要です(代表的な結果のセクションで概説されています)。 - ペトリ皿(直径15cm)1枚あたり15 mLの軟寒天+ 大腸菌 を血清ピペットを用いて添加します。プレートを室温にセットして、同日使用できるようにします。
注意: プレートは蓋を開けた状態で約20分で固まります。寒天は柔らかいままですが、プレートを反転させても移動しません。 - SM緩衝液で希釈することにより、10の要因でソースT4ファージの8〜10回の連続希釈を準備します。各希釈液 5 μL をプレートにスポットします。スポットを乾燥させ、プレートを反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。
- 生理食塩水マグネシウム(SM)ファージバッファーを調製するには、1 Lの脱イオン化H2Oに、100 mM NaCl、8 mM MgSO4·7H2O、および50 mM Tris-HCl(pH 7.4)を溶解します。オートクレーブし、室温で保管してください。
注:翌日、 大腸菌 は柔らかいLB寒天培地全体に芝生に成長しているはずです。プラーク、または 大腸菌 の芝生に見える成長のクリア領域は、感染した 大腸菌 宿主のファージ殺傷が発生した場所に現れます。各プラークは、プラーク形成単位(pfu)を表す。
- 生理食塩水マグネシウム(SM)ファージバッファーを調製するには、1 Lの脱イオン化H2Oに、100 mM NaCl、8 mM MgSO4·7H2O、および50 mM Tris-HCl(pH 7.4)を溶解します。オートクレーブし、室温で保管してください。
- 滅菌ピペットチップをプラークの中央に押し込み、チップの端に寒天プラグを作成することにより、柔らかい寒天プレートからプラークを1つ選びます。プラークプラグを1.7 mLの微量遠心チューブ内の1 mLのSMバッファーに再懸濁します。チューブを最高速度で1分間ボルテックスして混合します。
- チューブを室温で4000 x g で5分間遠心分離し、ライセートから破片を取り除きます。上清を新しい微量遠心チューブに移します。
- 単離されたファージを増殖させるには、ステップ1.1.1-1.1.3を繰り返します。単離されたファージ100 μLを、コニカルチューブ内の 大腸菌を含む軟寒天培地の15 mLアリコートに加えます。チューブを3回ひっくり返して寒天を混ぜ合わせ、シャーレに注ぎます。
- プレートを乾燥させてから反転させ、37°Cで一晩インキュベートします。 大 腸菌 の生存率を確認するために、ファージを含まない芝生コントロールプレートを準備します。
注:一晩のインキュベーション後、コントロールプレートには 大腸菌 の芝生があり、ファージ含有プレートは完全に溶解する必要があります。 - プレートからファージを抽出するには、ファージクリアプレートの表面に5 mLのSMバッファーを加え、ロッカー上で70 rpmで室温で15分間振とうします。
- プレートからバッファーを50 mLのコニカル遠心チューブに集め、室温で4000 x g で5分間遠心分離して、寒天プレートから破片をペレット化します。
- T4ファージストックライセートを新しいチューブに集め、滴定および増殖するまで4°Cで保存します。
注:T4ファージは10年以上安定しています25;ただし、安定性はファージの種類と保管条件によって異なります。ファージ力価は、保管時間によっても変化します。ファージは凍結に敏感です。したがって、凍結保存は液体窒素で推奨され、凍結融解サイクルはファージに損傷を与え、ファージ力価を低下させる可能性があるため、避けてください25。 - 前述のように、T4ファージストックライセートを力価で示し、pfu/mL単位の濃度を決定します25,29,30。高力価T4ファージストックには、108 pfu/mL以上が含まれます。
- 実験的ファージライセートの調製
- 大 腸菌 を5 mLのLB培地で滅菌ポリスチレンまたはガラス培養チューブ(キャップ付き)で培養します。チューブを37°Cで一晩インキュベートし、200rpmで振とうし、固定相に達するまでインキュベートします。
- ガラス製円錐フラスコに入れた100mLのLB培地で一晩大 腸菌 培養を1:50で継代培養します。37°Cでインキュベートし、バクテリアが初期から中期(約1.5時間)に達するまで200rpmで振とうします。
注:初期成長曲線を実行して、細菌培養が指数関数的な相にある600 nm(OD600)の範囲での光学密度を決定できます。ガラス円錐管での培養は、ファージがポリプロピレン31などのプラスチックに付着できることが最近の証拠で判明しているため、提案されています。 - ステップ1.1の高力価T4ファージストック100 μLを大 腸菌 継代培養物に加え、37°Cで3時間振とうするか、新しいライセートが曇らなくなるまでインキュベートします。T4ファージライセートを50 mLのコニカルチューブに集め、直接クリーンアップステップに進むか、必要に応じて翌日まで4°Cで保存します。
注:ファージバーストサイズが大きい(複製サイクルごとに放出されるビリオンの平均数が多いことを示す)と、ステップ1.2.2の細菌継代培養のインキュベーション期間が長くなります。これにより、ファージストックをスパイクする前に細菌密度が高まります。 - 室温で4000 x g で20分間遠心分離し、残っている細菌や細胞破片をペレット化します。得られた上清を0.22 μmのナイロンフィルターでろ過滅菌し、濾液を新しい50 mLのコニカル遠心チューブに移します。
- ろ過したT4ファージライセートの各容量に0.1容量のクロロホルムを添加して、残っている細菌を殺し、細菌の増殖を防ぎます。ボルテックスを短時間混合し、室温で10分間インキュベートします。
注:脂質エンベロープファージはクロロホルムに敏感であり、ファージ力価25を低下させる可能性があります。必要に応じて、この手順をスキップします。
注意: クロロホルムは有毒な有機溶剤であり、吸入、摂取、または皮膚から吸収すると危険です。クロロホルムを扱うときは、ドラフトと適切な個人用保護具(PPE)を使用してください。クロロホルムを扱う場合は、ほとんどのプラスチックと互換性がないため、ポリスチレン製の血清ピペットの代わりにガラスを使用してください。クロロホルムは、ステップ1.2.5〜1.2.6のポリプロピレン円錐形遠心分離管に入れることができますが、プラスチック管に長期間保管しないでください。 - 溶解液を室温で4000 x g で5分間遠心分離し、溶解物からクロロホルムを分離します。血清ピペットを使用して、下にあるクロロホルム層を乱すことなく、上部ライセート層を新しい50 mLコニカルチューブに慎重に移します。クロロホルム廃棄物は、適切な有害液体廃棄物容器に廃棄してください。ライセートは、翌日の濃縮およびバッファー交換まで4°Cで保存します。
- ファージライセートを100 kDa遠心フィルターデバイス( 材料表を参照)で濃縮するには、デバイスの上部リザーバーに13 mLのファージライセートを添加し、4000 x g で5分間、またはライセートのほとんどがフィルターを通過して下部リザーバーに入るまで遠心分離します。
注:スピン時間終了時に約2 mLのライセートを摂取することを目指してください。ライセートの添加によりフィルター内のファージ濃度が上昇すると、スピン時間が長くなる可能性があります。遠心濾過装置は、それらが乾燥して回転するのを防ぐための物理的な行き止まりを有する32。継続して使用する場合は、フィルターメンブレンを乾燥させないでください(つまり、上部リザーバーからすべての液体を除去することによって)。スピン時間は、ファージの種類と力価によって異なる場合があります。 - P200 または P1000 ピペットを使用して、残りの ~2 mL のライセートを上部リザーバー内で静かに上下にピペット操作し、各スピン後にフィルターメンブレンの詰まりを取り除きます。下部リザーバーから廃棄物容器に濾液を廃棄し、濃縮されたファージを上部リザーバーに残します。
- ステップ1.2.7-1.2.8を、全量のファージライセートがフィルター装置を通過するまで繰り返し、各スピン後に~2 mLの濃縮ファージが上部リザーバーに保持されます。
- 最後のスピン後に、上部リザーバーに残っているライセート(~2 mL)を上下にピペッティングして、フィルターメンブレンの詰まりを取り除きます。上部リザーバーに12 mLのSM緩衝液を添加し、4000 x g で10分間、またはほとんどの緩衝液がフィルターを通過するまで遠心分離することにより、ファージを洗浄(緩衝液交換)します。
- 濾液を捨て、洗浄ステップ(ステップ1.2.10)を繰り返します。残りの2 mLのライセートをSMバッファーに再懸濁し、最終容量が10 mL(またはそれ以下)になるようにして長期保存します。ライセートを50 mLのコニカル遠心チューブに移し、エンドトキシンが除去されるまで4°Cで保存します。
注:この段階でファージを滴定して、ファージ溶解物が濃縮されていることを確認し(> 108 pfu/mL)、エンドトキシン除去プロセス中のファージ損失を測定することはオプションです。 - ライセートの総容量に0.4容量の1-オクタノール( 材料表を参照)を添加することにより、T4ファージライセートから汚染されたエンドトキシンを除去します。
注:エンドトキシンは免疫賦活性が高いため除去されるため、その存在はファージ非依存性の自然免疫応答の誘導につながる可能性があります25。
注意:1-オクタノールは、強い臭いを持つ芳香族、有機、可燃性の化合物であり、眼を刺激します。1-オクタノールを扱うときは、適切なPPEを着用してください。蒸気の吸入を避けるために、すべての作業をドラフトで行ってください。ドラフトの外で作業するときにチューブが漏れないように、シーリングフィルムを使用してください。 - 円錐形遠心分離管の蓋をシールフィルムで密封し、漏れを防ぎます。プラットホームまたはロッキングシェーカーで室温で120rpmで1時間振とうした後、振とうせずに4°Cで1.5時間インキュベートします。
- 4000 x g で 10 分間遠心分離し、エンドトキシンを除去したライセートを 1-オクタノールから分離します。1-オクタノール層はライセートの上に浮かびます。P1000ピペットを使用して、できるだけ多くの1-オクタノールを慎重に除去し、適切な危険/可燃性の液体廃棄物容器に廃棄します。
- 18 Gの針と10 mLのシリンジを使用して、1-オクタノール層が収集しないように注意しながら、残りの1-オクタノール層の下にファージライセートを回収します。ライセートは、速度真空になるまで4°Cで保存してください。
- T4ファージライセートの1 mLアリコートを滅菌1.5 mL微量遠心チューブに移します。室温で4000 x g で蓋を開けて真空に加速し、ライセートから残留1-オクタノールを蒸発させます。3時間またはファージ溶解液の体積が30%減少するまで、真空を速めます25。滴定するまで4°Cで保存してください。
- ファージライセートを滴定して、pfu/mL単位の濃度を決定します。得られたT4ファージライセートをSM緩衝液で所望の濃度に希釈し、力価を再測定して確認します。
- メーカーの指示に従って、発色性エンドトキシン定量キットを使用して、T4ファージライセート中に存在するエンドトキシンを定量します( 材料表を参照)。最終ファージライセート中のエンドトキシンレベルを、エンドトキシン除去前のサンプル、ビヒクルコントロール、緩衝液、およびマウス飲料水と比較します。
注:発色性エンドトキシン定量キットは、1-オクタノール25によって不活性化されます。エンドトキシンを定量する前に、速度真空ステップを実行して1-オクタノールを除去します(ステップ1.2.16)。蒸留水のエンドトキシン含有量は 20 EU/mL25 と推定されます。ただし、マウス飲料水のエンドトキシン含有量は施設によって異なる場合があります。ファージ溶解液中のエンドトキシンレベルが飲料水中に存在する量を超える場合は、エンドトキシン除去ステップ(1.2.12-1.2.16)を繰り返すことを検討してください。 - エンドトキシンを除去した濃縮T4ファージライセートをSMバッファーに4°Cで保存します。
- ビヒクルコントロールのためのファージフリー細菌溶解物の調製
注:ファージフリー細菌ライセートは、ステップ1.2でファージライセートの産生時に発生する細菌汚染物質(エンドトキシンなど)による影響を制御するための媒体として調製できます。- 大腸菌の一晩培養から、大腸菌を1:50のLB培地に継代培養します。ファージを添加せずに、37°Cで3時間振とうしながら、またはステップ1.2で生成したファージライセートのインキュベーション時間に合わせて、細菌の培養を続けます。
- 大腸菌培養物を50 mLのコニカルチューブに移し、超音波プローブ(材料表を参照)を使用して、30 kHz、30秒パルス(3x)の氷上で細胞を溶解し、細菌細胞を手動で溶解します。
- ステップ1.2.4から始めて、ステップ1.2に従って、すべてのクリーンアップ、洗浄、エンドトキシン除去ステップを含む残りのプロトコルに従います。
注:遠心フィルター装置を使用した濃縮中、ビヒクルライセートはファージが存在しないため、ファージライセートよりも速くフィルターを通過します。したがって、遠心分離時間を5分から2〜5分に短縮して、長時間の遠心分離中に限外フィルターメンブレンが乾燥しないようにします。 - ビヒクルライセートを力価決定して、ファージが含まれていないことを確認します。
- メーカーの指示に従って発色性エンドトキシン定量キットを使用し、ビヒクルライセート中のエンドトキシンレベルを測定します。ビヒクルライセートをSMバッファーで希釈して、ファージライセート中のエンドトキシンレベルに合わせます。
- 代替実験的コントロール:熱不活化ファージライセートの調製
注:ファージフリー細菌溶解物の代替品は、熱不活化ファージ溶解物です。熱不活性化はファージビリオンを解離させますが、リポ多糖類(LPS)などの残留エンドトキシンは熱安定性があります8,33。この方法は、免疫活性化に無傷で生存可能なファージビリオンが必要かどうかを判断するためにGogokhiaらによって使用されました8。研究者は、両方の方法(ファージフリーと熱不活化)をテストし、どちらのコントロールが実験ニーズに最も適しているかを判断することをお勧めします。どちらを選択するにしても、バクテリオファージストックを濃縮してクリーンアップするために必要な重要な操作のために、バッファーコントロールが適切である可能性は低いことを認識することが重要です。- ステップ1.2で洗浄、精製、希釈したT4ファージライセート(マウスあたり100 μL)を、リッドロックを取り付けた滅菌微量遠心チューブに移します。
- ヒートブロック上で95°Cで15分間加熱溶解します16。
- オプション:ファージ/細菌核酸の除去が必要な場合は、JakočiūnėおよびMoodley34に従ってDNaseIおよびRNaseA処理を実行します。一通り:
- 50 μLのDNase I 10xバッファー、1 μLのDNase I(1 U/μL)および1 μLのRNase A(10 mg/mL)( 資料表を参照)を450 μLの熱不活化ファージライセートに加えます。
- ライセートを37°Cで1.5時間、ヒートブロック中で振とうせずにインキュベートします。
- 20 μLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を添加して、DNase IおよびRNase Aを不活性化します34。
- ライセートを室温で10分間保持して冷却し、複数のチューブを使用する場合はライセートを結合します。滴定するまで4°Cで保存してください。
- ファージ力価を実施して、ライセート中に生存可能なT4ファージが存在しないことを確認します。熱不活化ライセートは4°Cで保存してください。
- メーカーの指示に従って発色性エンドトキシン定量キットを使用し、熱不活化ライセート中のエンドトキシンレベルを測定します。熱不活化ライセートをSMバッファーで希釈し、一致したファージライセート中に存在するエンドトキシンレベルに従って希釈します。
2. 大腸菌 モノコロニーマウスにおけるT4ファージの投与とモニタリング
- 大腸菌によるマウスの単コロニー形成
- LB培地で単一のコロニーから選抜した大腸菌を一晩培養することにより、GFマウス8に投与する大腸菌を準備します。
- 厳密な無菌条件35下で、200μLの 大腸菌 培養物を、滅菌ビニールアイソレーターまたはバイオ排除気密ケージのいずれかに収容されたGFマウスに経口強制経口投与する。好気性細菌を使用する場合、各マウスの背中に200μLの細菌培養物を施用することにより、マウスにコロニーを形成することもできます。
注:異なる細菌が異なるpH生存能力を示すため、接種量は株に依存します36,37。Zucoloto et al.35は、1匹あたり1 x 108 cfuの接種を推奨しています。ここに示した代表的な結果は、一晩培養したマウスから得られたものです(cfuは決定されていません)。パイロット実験を実施して、目的のマウス系統の信頼性の高いコロニー形成をもたらす用量を決定することができます。経口強制経口投与による細菌の量は、マウスの年齢と体重によって影響を受ける可能性があります。最大許容用量については、個々のラボまたは施設の動物倫理プロトコルを参照してください。ここで提案する容量は、マウス体重の10%の強制経口許容量に基づいています(例:20 gマウスで最大200 μL)。一部の細菌種は胃の酸性度に耐えられず、腸にコロニーを形成することができません。まず、胃酸を中和するために、100 μL の 1 M NaHCO3 を強制経口投与することを検討してください2。厳密な嫌気性菌を使用してコロニーを形成する場合、微生物は嫌気性条件下で増殖させ、個別に準備された気密容器(マウスごとに1つ)でgnotobiotic動物施設に移す必要があります。容器を開けたら、酸素曝露による微生物の生存率の低下を抑えるために、各強制経口検査を迅速に行ってください。 - マウスの健康への悪影響を監視します。
注:健康に悪影響がある場合は、関連する動物飼育施設が設定した基準を参照してください。考えられる健康への悪影響には、(1)強制経口液の誤嚥:症状には、鼻からの泡の排出、「口を開けた」呼吸/あえぎが含まれます。(2)食道の穿孔:症状には、急激な体調不良、猫背、嗜眠などがあり、24時間以内に動物が死亡します。 (3)強制経口投与の繰り返しによる食道の炎症:強制経口注射針の挿入が困難などの症状があります。(4)マイクロバイオームの変化による下痢。 - 糞便ペレット中の細菌のコロニー形成は、少なくとも週に1回培養するか、16S rRNAシーケンシングによって確認する35。
注:実験用マウスの生産のためにgnotobioticアイソレーター内でブリーダーにコロニーを形成する場合は、6週齢の第一世代の子孫(F1)実験マウスの生成について、少なくとも9週間前に計画してください。あるいは、GF成体マウスを単植民地化することもできる。このアプローチでは、ファージ接種の前にコロニー形成後7週間待つことが推奨されます、これはGFマウスに複雑な微生物叢を導入した後に腸粘膜が安定するのに必要な時間であるためです38。
- 大腸菌モノコロニー化マウスへのT4ファージの経口接種
- T4ファージライセートおよびビヒクルコントロールをSM緩衝液中で所定の濃度に希釈します。Hsu et al.2 によると、ファージ溶解物を希釈して、マウス2 あたり 2 x 106 pfu の投与を可能にします。
注:高濃度または低濃度のファージは、 in vivoでのファージの安定性に応じて使用できます。マウス1匹あたり2 x 102、2 x 104 および2 x 106 pfuのT4ファージの用量は、用量依存的ではないと思われる腸内の安定した長期コロニー形成をもたらした(代表的な結果のセクションに示されている)。したがって、ファージバクテリアの動態は、大規模な実験の前に in vivo で試験的に行う必要があります。 - 無菌のグノトバイオティクス条件下で、各マウスに100 μLのオートクレーブ処理した1 M NaHCO3 を強制経口投与し、胃酸を中和します。10分間待ってから、100μLのT4ファージライセートで強制経口投与するか、ビヒクルコントロールします。
- マウスの健康への悪影響を監視します。
- T4ファージライセートおよびビヒクルコントロールをSM緩衝液中で所定の濃度に希釈します。Hsu et al.2 によると、ファージ溶解物を希釈して、マウス2 あたり 2 x 106 pfu の投与を可能にします。
3. in vivoでのT4ファージレベルのモニタリング
注:マウスにファージを接種すると、糞便または組織サンプルでファージと標的細菌の両方の濃度を測定できます。これにより、ファージ感染の動態と両生物のコロニー形成動態に関する情報が得られます。
- 糞便ペレット中の濃度を測定するためのT4ファージのスポットプレーティング
- 各マウスの糞便ペレットを滅菌済みの計量済み微量遠心チューブに集めて、T4ファージと 大腸菌 のレベルを測定します。チューブはメッキされるまで氷上に保管してください。
注意: 採取とメッキの間の間にサンプルを氷上に置き、耐空性バクテリアの増殖を遅らせます。数時間にわたって、好気性細菌の増殖や、酸素曝露による嫌気性細菌の死滅があり、細菌数が歪む可能性があります。したがって、バクテリアとファージのプレーティングは、サンプル採取後できるだけ早く行う必要があります。偏性嫌気性細菌は酸素曝露に耐えられません。サンプルを保存するには、サンプルを密閉されたチューブに収集し、収集後できるだけ早くチューブを嫌気性チャンバーに移します。糞便サンプルで増殖が検出されない場合は、細菌定量に 16S rRNA qPCR などの代替手段を検討してください。 - 各チューブの最終的な重量を記録し、最初のチューブ重量を差し引いてサンプル重量を計算します。これは、T4ファージと 大腸菌 の濃度をサンプル重量(それぞれpfu / gまたはcfu / g)に正規化するために使用されます。
- 各チューブに1 mLの滅菌SM緩衝液を加え、最高速度(>1分)で完全にボルテックスして糞便ペレットを均質化します。サンプルが15 mg未満の場合は、少量のSMバッファーを追加できます。サンプルのcfu/gまたはpfu/gを計算するために、各サンプルに添加されたSMバッファーの量を記録します。
- 180 μL の SM バッファー中に各サンプル 20 μL の 8 個 (または予想されるファージ濃度に応じてそれ以上) の連続希釈液を 10 倍に調製します。ホモジナイズした各サンプルを短時間ボルテックスして混合してから、最初のチューブ/ウェルに添加します。ピペットで添加の合間に混合し、希釈液ごとにチップを交換して、サンプルのキャリーオーバーによるファージやバクテリア数の膨張を防ぎます。
注:サンプル中に存在する繊維や破片がピペッティングを妨げる場合は、糞便スラリーにバッファーを追加して、ストックサンプルをさらに希釈します。 - 各希釈液 5 μL を大 腸菌 を含む LB 軟寒天培地(ファージプラークアッセイ用)または LB 寒天培地(1.5% 寒天培地、細菌コロニーアッセイ用)にスポットし、各サンプル中の T4 ファージおよび 大腸菌 の濃度を測定します。正確を期すために、各サンプルを 3 つに分けて見つけます。
注:96 ウェルプレートで段階希釈を調製する場合は、8 チャンネル P20 マルチチャンネルピペットを使用して、段階希釈したサンプルの各カラムをプレートにピペットで移すことができます。ファージがピペットチップの壁に付着し、各新しいウェルに添加されるファージの量を変える可能性があるため、最も希薄なものから最も濃縮されたものへと移動しても、各希釈液の間でチップを交換する31。 - プレートを反転させてインキュベーターに入れる前に、各スポットを乾かしてください。37°Cで一晩インキュベートします。
- 各サンプルについて、スポットごとに3〜30個の可算プラークがある希釈率を選択します。スポットのプラークの数と使用した希釈液を数えて記録します。
- プラークの数を各スポットにめっきされた体積で割ってpfu/μLを与え、これに希釈係数と各サンプルに添加されたSMバッファーの体積を掛けてpfu/サンプルを与えることにより、サンプルのpfu/gを計算します。最後に、サンプル重量で割って、pfu/g30 を求めます。
- 各マウスの糞便ペレットを滅菌済みの計量済み微量遠心チューブに集めて、T4ファージと 大腸菌 のレベルを測定します。チューブはメッキされるまで氷上に保管してください。
- 実験エンドポイントでの組織サンプリング
- 選択した各時点で、承認された施設の動物倫理プロトコルに従ってマウスを安楽死させ、盲腸内容物、小腸内容物、大腸内容物、および目的の組織を滅菌済みの計量済み2 mL丸底微量遠心チューブに収集します。
- 各チューブの最終重量を記録して、サンプル重量を計算します。組織と盲腸の内容物は、同じ日にメッキされるまで氷上に保管してください。
- 滅菌SM緩衝液を各チューブに添加し、添加した容量を記録します。
- 盲腸および腸の内容物については、ステップ3.1.3に従って完全に(>1分)サンプルをボルテックスします。
- 組織サンプルの場合は、各チューブに滅菌金属ビーズを1つずつ添加します。組織ライザー( 材料表を参照)を使用して、20 Hzで5分間、または組織が解離して懸濁液が均一になるまで、組織をホモジナイズします。
注:サンプルの均質化がうまくいかない場合は、添加するSMバッファーの量を増やすか、均質化時間を長くするか、均質化周波数を30 Hzに上げることを検討してください。組織ホモジナイザーは、細菌およびファージの回収を可能にしながら、組織を解離するためにも使用できます39,40。ホモジナイザーは、細菌の完全性を維持しながら、組織溶解器よりも高い周波数で操作されます。 - ステップ3.1.4-3.1.841に記載されているように、各サンプルの段階希釈液を10倍に調製し、スポットプレーティングを実行して、各サンプル中の大腸菌およびT4ファージの濃度を決定する。
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Representative Results
マウス腸内のT4ファージ/大腸菌 ダイアド間の相互作用を調べるために、T4ファージとビヒクルライセートを調製、洗浄、精製しました(図1A)。T4ファージライセートをプラークアッセイで力価測定し、SM緩衝液中で2 x 107 pfu/mL(2 x 106 pfu/マウス)に希釈した。ビヒクルライセートも力価を計上して、生存可能なファージの存在がないことを確認し、T4ファージライセートと同じ量のSMバッファーで希釈しました。エンドトキシンレベルは、発色性エンドトキシン定量キットを使用して希釈ライセートで定量しました。T4ファージ、熱不活化ファージ、およびビヒクルライセートのエンドトキシンレベルは、飲料水の許容レベル(<20 EU/mL)を下回っていました25(図1B)。ビヒクルライセートはT4ファージライセートと同量のエンドトキシンを有していたため、適切なコントロールであると見なされた。熱不活性化ファージライセート(熱処理前の2 x 107 pfu/mL)は、ビヒクルおよびT4ファージライセートの両方よりもエンドトキシンが少なかった。キットの説明書に従って、1-オクタノール処理したサンプルをビヒクルライセート(スパイクビヒクル)にエンドトキシン標準試料を添加してアッセイ阻害について試験し、最終濃度を 0.5 EU/mL にしました。スパイクしたビヒクルエンドトキシンレベルからビヒクルエンドトキシンレベルを引いた値は、メーカーの推奨に従って 0.5 EU/mL±25%)でした(図 1B)。これにより、1-オクタノールの除去に成功し、アッセイの結果を妨げる可能性のあるライセートによって引き起こされるアッセイ阻害がないことが確認されました。
大腸菌 K-12(BW25113)モノコロニー化されたC57BL/6マウスを、無菌フレキシブルフィルムビニルアイソレーター内でgnotobiotic条件下で繁殖させた(図2A)。F0世代のマウスは、大腸菌を環境に加え、共同飼育することでコロニーを形成しました。出生時から垂直伝播と共飼育によって大腸菌にコロニーを形成した子孫(F1世代とF2世代)のみを実験に使用しました。この戦略は、細菌の接種に応答して発生する免疫系、粘液産生、および消化管の発達の変化を制御し22,37、したがって、ファージの導入によってのみ発生する変化の測定を可能にします。成熟後、実験マウスを無菌アイソケージに移し、そこでそれぞれ2 x 106 pfuのT4ファージまたは等量のビヒクルライセートを経口強制経口投与した。T4ファージおよび大腸菌の存在量は、糞便ペレットの収集および0.5%(軟)寒天培地または1.5%寒天培地のいずれかのスポットプレーティングアッセイによって4週間にわたってモニターされました。この実験の過程で、T4ファージと大腸菌は、どちらの集団も枯渇することなく共存することができました(図2B、C)。2 x 102および2 x 104 pfu/マウスの低用量でのT4ファージの経口投与は、2 x 106 pfuと比較して、T4ファージが腸にコロニーを形成する能力を低下させませんでした(図2D)。同様に、大腸菌レベルに対するT4接種の用量依存的な効果は観察されませんでした(図2E)。
重要なことに、サンプル間のめっきの一貫性がプラーク数にとって重要であることがわかりました。例えば、軟寒天に細菌を添加した場合、細菌の密度がアッセイの結果に大きく影響すると判断されました。1時間、1.5時間、または2時間継代培養した大腸菌を添加すると、2.8時間以上継代培養した大腸菌を添加した場合よりもプラーク数が少なくなりました。さらに、大腸菌を 2.8 時間から 16 時間 (一晩) 継代培養した場合、プラークの定量は ~1 x 109 pfu/mL で安定し、1 時間の代培養から計算した値(~2 x 108 pfu/ml)と比較して約 5 倍の増加でした(図 3A)。継代培養ではなく、一晩培養した軟寒天に標的菌を接種することができます。ここで、軟寒天に接種した16時間(一晩)の大腸菌培養液の量は、プラーク数に影響を与えました(図3B)。これらの結果は、寒天培地内の大腸菌の密度がプラークアッセイ数に影響を与える可能性があることを示しています。どちらのアプローチでも、ファージ定量の結果は同じ値(109 pfu/ml)で横ばいとなり、プラーク数の精度を確保するためには、標的細菌が軟寒天培地で十分に高密度でなければならないことが示唆された。
まとめると、これらの結果は、実験操作を行う前に、 in vitro および in vivo のパイロット実験を通じてファージ-バクテリアの動態を理解することの重要性を強調しています。
図1:ファージ溶解物の調製。 (A)高力価ファージストックからファージライセートを開始するためのワークフロー。ライセートを増殖させ、洗浄し、濃縮し、エンドトキシンを除去しました。汚染された1-オクタノールは、速度真空によって除去された。(B)エンドトキシンは、発色性エンドトキシン定量キットを使用して、ファージおよびビヒクルライセートで定量しました。青色の破線は、生成物阻害コントロールにおける生成物阻害を反証するための上限と下限を示しています(0.5 EU/mL ± 25%)。各ポイントは、2 つのテクニカル レプリケートのうちの 1 つを表します。棒の高さは、反復間の平均を表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:単コロニー化マウスの作製と糞便ペレット中のファージおよび細菌レベルのモニタリング。 (A)単一細菌種を有する無菌マウスのコロニー形成とF1およびF2単菌マウスの作製ワークフロー。(B-E)大腸菌で単コロニー化されて生まれ、6〜8週齢でT4ファージを接種したC57BL / 6マウスの糞便ペレットで検出されたT4ファージと大腸菌のレベル。0日目(コロニー形成前)およびコロニー形成後指示された日数で、T4ファージレベルをスポットプレーティングおよびプラークアッセイにより、単寒天培地法を用いて測定した。大腸菌レベルは、1.5%LB寒天培地にスポットメッキして測定しました。(B、C)2 x 106 pfuのT4ファージまたはビヒクルライセート(容量およびエンドトキシンレベルで正規化)を接種した後の回収された糞便ペレット中の(B)T4ファージおよび(C)大腸菌レベルの動態。(D、E)(D)T4ファージの2 x 102 pfu、2 x 104 pfuまたは2 x 106 pfuの接種後の回収糞便ペレット中のT4ファージおよび(E)大腸菌レベル。エラーバーは、平均と平均の標準誤差(SEM)を表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:プラークアッセイにおけるトラブルシューティングの精度。 (A)軟寒天培地(0.5%寒天培地、LB)用の大腸菌の一晩培養または継代培養を使用したT4ファージライセート力価。継代培養は、一晩で大腸菌培養液を1:50に希釈して新鮮なLBに入れ、5 mLの軟寒天培地に100 μLの大腸菌と20 μLのT4ファージを接種しました。CaCl2 と MgSO4 は、これらの試験では軟寒天培地に添加していませんが、必要に応じて添加できます。大腸菌の継代培養時間が2.8時間未満では、見かけのファージ力価が低くなりました。(B)軟寒天培地における異なる大腸菌密度を用いたT4ファージライセート力価。一晩培養した大腸菌(Aのように継代培養ではない)の異なる量の大腸菌を軟寒天培地に添加すると、異なる見かけのファージ力価が得られました。エラーバーは、計算されたファージ力価の不確かさを表します。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
マイクロバイオームにおけるファージの研究は、細菌のファージと比較して大きな課題を提示します。具体的には、ファージは、原核生物と真核生物の種の配列決定と同定を容易にする16Sおよび18Sリボソームサブユニットに類似したすべてのファージに共通する保存された系統発生マーカーを含んでいない42。しかし、リード長、スループットの増加、コストの削減など、次世代シーケンシングアプローチの進歩に伴い、バクテリオファージゲノムデータベースは急速に拡大しています42,43,44。ファージの発見に関する多くの基礎工事が順調に進んでいるため、ファージ研究はこれまで以上にアクセスしやすくなっています。腸内細菌叢の主要メンバーであり、地球上で最も遺伝的に多様な生物であるファージは、マイクロバイオームの複雑さを調査する新しい研究にとってエキサイティングな視点を提示しています。ここに記述されているプロトコルはターゲット細菌とコロニーでコロニーを作ったマウスの知られていたバクテリオファージ種を調査することに焦点を合わせる。これらのプロトコルは、生体内でバクテリオファージを研究するためのガイドラインを提供し、分野の成長とともに拡張することができることに注意する必要があります。
細菌感染症の治療治療のためのバクテリオファージの研究は、1940年代の抗生物質の出現により、ほとんど時代遅れになりました。しかし、抗生物質の過剰処方と誤用により、公衆衛生上の主要な懸念事項として多剤耐性病原体の出現が加速しています3。ファージは、宿主特異性が高いため、抗生物質に代わる魅力的な選択肢となる可能性があります3。重要なことは、ファージはヒトの腸内細菌叢の一員として自然に居住するため、まずファージがこれらの複雑な環境で果たす役割を理解する必要があるということです。多くの研究がファージとその標的細菌との関係をin vitroで調査していますが、これらの関係が消化管のランドスケープ内でどのように維持されるかを検討することが重要です。微生物叢の細菌成分を調査する探索的研究と同様に、GFや単コロニー形成マウスなどの簡略化されたマウスモデルにより、標的種に対するファージの影響と、この関係が免疫応答にどのように寄与するかを分離することができます。これはファージセラピーに向けた重要なステップであり、一部のファージは腸に導入されても利益をもたらさない可能性があります。例えば、緑膿菌ファージPf4は、抗菌性免疫応答とケラチノサイト遊走の両方を阻害することにより、宿主によって引き起こされる疾患を悪化させ、創傷治癒障害をもたらす18,45。ここで説明する手順は、マウス微生物叢のメンバーとしてファージを研究するための技術を標準化することを目的としています。微生物叢が宿主後生動物に及ぼす影響を調査する先駆的な研究に呼応して、微生物叢の文脈におけるファージの継続的な研究は、マルチバイオームのより広い理解においてエキサイティングで重要であることが証明されるかもしれません46。
制限
ここに記述されているプロトコルはT4バクテリオファージが口頭強制経口によってエシェリヒア属大腸菌のmonocolonizedマウスに管理されるときT4バクテリオファージとターゲット細菌、エシェリヒア属大腸菌間の競争を研究するために最大限に活用された。バクテリアと同様に、異なるファージ種は互いに異なる振る舞いをし、複製時間、バーストサイズ、およびバクテリア標的の範囲が異なる47。したがって、類似の動物モデルで他のファージとバクテリアのペアを調査する場合は、すべてのステップでこれらのプロトコルを最適化するように注意する必要があります。例えば、複製時間が長い、および/またはバーストサイズが小さいファージは、高力価ライセートの産生のために、細菌標的とのより長いインキュベーションを必要とする場合があります。同様に、プラークアッセイではプレートのインキュベーション時間を延長する必要があるかもしれません。さらに、複製時間が短い、および/またはバーストサイズが大きいファージは、一晩のインキュベーションがプラークの異常増殖を引き起こす可能性があるため、より短いプレートインキュベーションを必要とする場合があります。増殖条件が関心のある特定のファージについて不明である場合、増殖条件を決定するための基礎は、in vivo作業を開始する前に確立されるべきである48。
T4ファージのHocキャプシドタンパク質内に見られるIg様ドメインは、腸粘液への付着を促進する11。選択したファージの粘液結合能力に応じて、糞便サンプル中のファージ細菌レベルの動態は、図2B-Eに示す結果とは異なる場合があります。例えば、インタクトなHocタンパク質を含むファージは、Hoc欠損ファージと比較して大腸菌の殺傷能力が向上することが、腸チップシステムにおいて示されました11。T4ファージはin vivoで粘液結合を介して保持されていると疑われていますが11,12,13、マウスの食糞行動を介した再接種の影響を排除することはできません。これらの影響は、ワイヤーケージの底部を使用するか、ケージを頻繁に交換することで軽減できます。Ig様ドメインはssDNAまたはRNAファージで同定されていないので49、腸粘膜内の居住を保持するためにファージが使用する他の戦略をからかうことは興味深いでしょう。
最後に、これらの探索的研究では、ホメオスタシスのみにおけるファージ-細菌-宿主の相互作用を調べました。ヒト疾患の動物モデルでは、IBDなどの腸管バリアの完全性の変化がこれらの相互作用にどのように影響するかは不明です。最近の研究では、CaudoviralesファージがIBD患者の豊かさと多様性を増加させたことが示されています7,8。マウスモデルでは、継続的なファージ処理がデキストラン硫酸ナトリウム(DSS)誘発性実験的大腸炎を悪化させることが示されました8。ファージ-バクテリア-宿主の相互作用が炎症環境でどのように展開するか、また、バリアの完全性の障害がファージ誘発性炎症を促進するかどうかは、まだ解明されていません。
トラブルシューティングと代替方法
マウスモデル
単コロニー化マウスモデルでは、単一種の細菌を宿主の生理機能に調査することができます16。単コロニー化されたマウスを用いた研究は、微生物叢が免疫系にどのように影響するかを解明する上で重要な役割を果たしてきた22。モデルシステムとして、モノコロニー化されたマウスは、従来の微生物叢の生理機能を再現しません。GFマウスに類似した、 大腸菌 単植民地化マウスは粘液産生を減少させ(GFマウスと同様50)、免疫系が未熟である23。しかし、単コロニー形成マウスは、消化管と免疫発達に対する個々の種の微生物特異的影響を解明する上で非常に貴重です。典型的な例は、分節糸状細菌(SFB)がマウスのCD4+ Tヘルパー17細胞の強力な誘導因子であるという発見である24。粘液に関しては、粘液遺伝子転写51および粘液の厚さ50に対する微生物特異的な影響がある。限定的ではあるが、単コロニー化されたマウスは、対照モデルにおいて、1つのファージとバクテリアのペアが哺乳類宿主に及ぼす影響を調査する機会を提供する。重要なことは、ファージは複雑な微生物叢の文脈で調査することができ、またそうすべきであるということです。本稿執筆時点では、従来のマイクロバイオームにおける共生細菌種のファージ捕食の影響を扱った研究はほとんどありません。これは、この論文で提示されたプロトコルの将来のアプリケーションであり、これらの研究を促進するために適応される可能性があります。
適切な車両制御の使用
どのような実験でも、適切な管理が不可欠です。ここで、T4ファージ溶解物の多段階の洗浄および精製を制御するマウスへの経口投与に適したビヒクルが定義された。重要な要件は、ビヒクルコントロールにバクテリオファージライセートと同レベルの細菌性エンドトキシンが含まれていることであり、エンドトキシンを介した免疫応答を制御することです。クロロホルムと1-オクタノールは、精製プロセスの一環としてライセートに添加され、その後除去されます。これらの化学物質の微量レベルに対して発生する可能性のある潜在的な免疫応答を制御するために、ファージフリーの細菌ライセートをビヒクルコントロールとして製造することができます。T4ファージおよびビヒクルライセートには、非常に低濃度の細菌性エンドトキシンが含まれており、飲料水中で許容されるレベルをはるかに下回っていました25(図1B)。代替コントロールを使用することができ、意図した研究課題に合わせて変更することができます。最も簡単に言えば、同量のエンドトキシンを含むファージバッファーを使用できますが、これは多段階の洗浄および精製プロセスを考慮していません。Gogokhiaら8は、DNAを含まないファージタンパク質が免疫応答を誘発するのに十分であるかどうかのコントロールとして、熱不活化ファージの使用を報告しました。私たちの手では、熱不活化ファージはT4ファージライセートよりもエンドトキシンのレベルが低かったため(図1B)、この研究ではエンドトキシンレベルの制御には使用しませんでした。ただし、どちらの方法が個々の実験目的に最も適しているかを判断するために、両方のプロトコルをテストすることをお勧めします。ビヒクルとT4ファージの溶解物が存在するエンドトキシンの量が有意に異なる場合、より低いレベルを含む溶解物に精製されたエンドトキシンを補給することができる。1-オクタノールは精製プロセス中にライセートに添加されますが、発色性エンドトキシン定量キット試験は不活性化されます。エンドトキシン測定が正確であることを確認するために、サンプル中の潜在的に干渉する物質による生成物阻害をテストすることが重要です。生成物の阻害が疑われる場合は、サンプルが十分な時間真空にされていない可能性があります。問題が解決しない場合は、透析を使用して残りの1-オクタノール25を除去できます。
投与経路と投与量
T4ファージの粘液結合能力により、マウスモデルに単回経口強制経口投与を接種した。これの目的は、消化管のファージと大腸菌の共存期間を監視することでした。しかし、in vivoモデルでファージを研究するための他のアプローチが報告されています。例えば、ファージを豊富に含む飲料水は、マウスにファージを継続的に供給するために用いられてきた8,20。この投与方法の利点は、Gogokhiaらによって実証されたように、細菌宿主が不在の場合でも、ファージが継続的に補充されることである。8.この実験デザインは、細菌の非存在下でのファージに対する免疫応答の評価を可能にし、実験の過程で継続的な免疫刺激を提供しました。生理学的には、この方法はファージ感染の自然な経過や腸内環境のファージコロニー形成を表すものではありませんが、ファージへの繰り返しの曝露が免疫系をどのように呼び起こすかについて重要な洞察を提供します。これは、ファージカクテルが抗生物質レジメンと同様に腸内細菌感染症を治療するための治療コースとして提供される可能性があるため、ファージ療法の開発の文脈において重要です。T4ファージ-大腸菌ペアの文脈では、モノコロニー化されたマウスに経口投与されたT4ファージの用量を減らしても、糞便ファージまたは細菌のレベルは変化しないと判断されました(図2D、E)。したがって、この場合、T4ファージの接種量は、バイコロニー化されたマウスの腸における安定したT4ファージ-E.大腸菌コロニー形成の維持にとって重要ではありません。投与された最低用量は200 pfu/マウスであり、最高用量は2 x 106 pfu/マウスであったことが注目される(Hsu et al.による)。2.したがって、この範囲外のT4ファージ-E.大腸菌動態をサポートするデータは、この研究では利用できません。
スポットおよび全プレートファージ力価
糞便および組織中のT4ファージレベルを測定するために、ここで概説するプロトコルは、マウス間のファージレベルのばらつきに寄与する可能性のある全プレートプラークアッセイではなく、スポットプレーティング技術に依存しています(図2B)。ホールプレート技術では、プラークがより広い領域にわたってカウントされるため、より正確な定量が可能になります。ただし、各サンプルの適切な希釈は、通常、スポットめっきによって事前に決定する必要があります。サンプルは採取当日にアッセイされるため、スポットプレーティングは、よりハイスループットなアプローチに最も適した方法であると考えられました。したがって、このデータの分解能は、各サンプル中のファージの大きさによって最も正確に表されます。ファージを正確に測定するためには、各ファージについて追加の考慮事項があります。より正確な測定は、全プレートアッセイ、または各サンプルのより短い段階希釈範囲を使用することで得ることができます。これらの方法でもファージや標的細菌の数が変動する場合は、メタゲノム配列決定やその他の方法で、ファージと細菌の間のユニークな相互作用が個々のマウス間の違いを説明できるかどうかを評価し、共進化と耐性を実験的に評価することが賢明です。Bonilla et al.25によると、プラークアッセイのために軟寒天を調製する場合、添加する宿主細菌の量と一致することが重要です25。図3に示すように、細菌の培養時間(図3A)と密度(図3B)の比較的わずかな変化でさえ、プラークアッセイの精度に影響を与える可能性があります。これらの知見は、他のファージとバクテリアのペアでは異なる場合があり、新しい生物で始める際には同様の実験が推奨されます。さらに、新しいファージとバクテリアのペアについては、探索的実験を実施して、それぞれの増殖特性を決定する必要があります。例えば、増殖曲線を実行して、細菌の遅れ、指数関数的および静止期、および増殖速度を決定することができる。ワンステップ増殖実験は、ファージの潜伏期間(溶解までの時間)およびバーストサイズ(細菌溶解時に放出されるファージの数)を決定するために使用することができる52,53。
qPCRによる代替T4ファージ測定
ファージの定量は、上記のようにプラークアッセイで、または定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)を介して行うことができます。プラークアッセイは、細菌の宿主に感染して殺すことができる生存可能なファージの数を決定しますが、qPCRはファージ特異的な遺伝物質を(存在するファージの数の代理として)定量化しますが、ファージの生存率と感染性に関する情報は提供しません。qPCRを実施して、ファージ遺伝子コピーの定量を、Hsuらが記載したプライマーを用いたプラークアッセイで形成されたプラークと比較しました2(図4)。T4ファージDNAは、T4ファージ/大腸菌バイコロニー化マウスの盲腸内容物から抽出および増幅されました。ほとんどのマウスでは、qPCRおよびプラークアッセイにより、盲腸内容物中に同レベルのT4ファージが検出されました(図4A、B)。ビヒクル接種した盲腸内容物ではある程度の増幅が検出されましたが、計算された遺伝子コピー/gは検出限界(LOD)を下回っていました(図4A)。これらのサンプル中に定量可能なファージが存在しないことは、ゲル電気泳動によって確認されました。T4ファージ遺伝子産物(96 bp)は、T4接種マウスの盲腸内容物から単離されたDNAで容易に可視化されましたが、ビヒクルコントロールには存在しませんでした(図4C)。
これらの試験では、同じサンプルからのプラークアッセイではT4を検出できないにもかかわらず、qPCRによって1匹のT4ファージコロニー形成マウスの盲腸内容物からT4ファージ遺伝子のコピーが検出されました(図4A、矢印)。これらの結果は、プラークを形成しないウイルス粒子が、欠陥のあるウイルス粒子の産生またはファージやバクテリアの共進化のいずれかにより、in vivoで発生する可能性があることを示唆しています。硬質寒天への細菌プレーティング技術は、ファージ14に対する糞便細菌の感受性を決定するために使用できます。qPCRを介した検出は、短く保存された遺伝子配列を標的としているため、腸内環境内でのファージの進化に対してより頑健である可能性があるため、in vivoファージワークフローへの貴重な追加となる可能性があることを示唆しています。メタゲノミクスなどのバイアスのないアプローチは、ファージとバクテリアの共進化と相対存在量を調べるのに価値がありますが、最終的にはコストが高くなる可能性があります。
図4:qPCRによるT4ファージの検出。 (A、B)T4ファージ負荷は、T4ファージまたはビヒクル接種後29日目に大腸菌コロニーを形成したC57BL/6マウスの盲腸内容物中の(A)絶対qPCRまたは(B)プラークアッセイによって測定されました。矢印は、盲腸内容物中にT4ゲノムコピーが検出されたが、プラッカブルウイルスが検出されなかった個々のマウスの結果を示しています。(C)T4ファージ接種盲腸サンプルに96 bpバンドが存在するが、ビヒクル接種サンプルには存在しないことを示すPCR産物のゲル電気泳動。100 bp の DNA ラダーを使用しました。LOD = 検出限界。エラーバーは平均とSEMを表します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
アプリケーション
バクテリオファージは、マイクロバイオームに存在するウイルス様粒子の90%以上を占める44。しかし、ファージが腸内細菌叢に及ぼす影響はよくわかっていません。マイクロバイオームの細菌成分を調査する最初の研究では、特定の種を分離し、免疫成熟への影響を研究することによって行われました22,24。ファジョームに対する同様の尋問は、気が遠くなるような、しかし必要な作業であり、マルチバイオームの包括的な理解を得るための要件である46。ファージセラピーの開発の焦点は敗血症性細菌感染症の治癒に向けられる傾向がありますが、消化管にファージカクテルを追加すると腸の生態系がどのように変化するかを理解することが重要です。さらに、治療用ファージカクテルの安全性は、免疫プロファイルを生成することによって評価する必要があります。ファージは、C. difficile5やSalmonella enterica serovar Typhimurium54などの腸内細菌感染症の潜在的な治療法として研究されています。最近の研究では、FFTが早産ブタの壊死性腸炎の治療に同等またはそれ以上に有効であることも実証されており9、糞便微生物叢移植(FMT)のウイルス成分が疾患の減少に積極的な役割を果たす可能性があることが示唆されています。腸内細菌叢におけるファージの役割を調査する継続的な研究は、腸内病原体に対するファージ療法の開発を促進するためだけでなく、疾患の治療としてのFMTにより良い情報を提供するためにも必要です。in vivoでのファージ研究の方法を標準化することにより、ファージ研究の透明性と再現性が向上し、マウスモデルに研究を拡張する研究者へのガイダンスも提供されます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
著者らは、この研究を行った土地が、xwməθkwəy̓əm(Musqueam)民族の伝統的で先祖代々の未割譲の領土であることを認めている。それが置かれている土地は、何千年もの間、この場所で世代から世代へと文化、歴史、伝統を受け継いできたマスケアムの人々にとって、常に学習の場でした。私たちは、他の人々が https://native-land.ca で生活し、働いている故郷についてもっと学ぶことを奨励しています。著者らは、カナダ自然科学工学評議会(NSERC)のカナダ大学院奨学金-修士号(N.P.)、Michael Smith Health Research BC Trainee Award(RT-2023-3174、MHへ)、カナダ自然科学工学研究評議会(NSERC)のディスカバリー助成プログラム(RGPIN-2019-04591からCT、RGPIN-2016-04282からLCO)、カナダ高等研究所/人間とマイクロバイオーム(FL-001253 Appt 3362、 CTへ)、Michael Smith Foundation for Health Research Scholar Award(18239、CTへ)、Canadian Institutes for Health Research(PJT-159458からLCO)、Canadian Foundation for Innovation(LCOへ34673、CTへ38277)。UBC Centre for Disease ModellingとubcFLOWはUBC GREx Biological Resilience Initiativeの支援を受けており、 Osborne研究室とTropini研究室のメンバーには、原稿の批判的な議論と評価をしてくれたことに感謝しています。 図1A と 図2A は、Biorender.com を使用して作成されました。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1-octanol (99%) | Thermofisher | CAAAA15977-AP | |
50 ml PES Steriflip Sterile Disposable Vacuum Filter Units | Millipore Sigma | SCGP00525 | |
Agarose (Low-EEO/Multi-Purpose/Molecular Biology Grade) | Fisher BioReagents | BP160-500 | |
Amicon® 100kDa Ultra-15 centrifugal filter device, Ultracel-100 | Millipore Sigma | UFC910008 | |
BD Microtainer® Tubes, SST | BD Medical | 365967 | |
Bioexclusion airtight cages (ISO cages) | Techiplast | 1245ISOCAGE | |
C1000 Touch™ Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BioRad | 1851196 | |
Calcium Chloride Dihydrate (White Crystals to Powder) | Fisher BioReagents | BP510-500 | |
Cap Locks For 1.5ML Tube 100/pk | Andwin Scientific | 16812612 | |
Chloroform (Ethanol as Preservative/Certified ACS) | Fisher | C298-500 | |
Copper coated steel beads (4.5 mm) | Crosman Corporation | 0767 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit (50) | Thermo Scientific | 69504 | |
DreamTaq Green PCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K1081 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt solution, for molecular biology, 0.5 M in H2O | Sigma Aldrich | E7889 | |
Fisher BioReagents™ Agar, Powder / Flakes, Fisher BioReagents™ | Fisher Bioreagents | BP1423-500 | |
Fisher BioReagents™ Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox | Fisher Bioreagents | BP1427-500 | |
GeneRuler 100 bp DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0241 | |
Green FastMix® qPCR mix, 1250 rxns | QuantaBio | 95072-012 | |
HEPA filters for isocage lids, AUTOCLAVABLE H14 FILTERS FOR ISO LINE- IRRADIATED | Techiplast | UISOHEPAXTBOX-300 | |
Magnesium sulfate heptahydrate | Fisher BioReagents | BP213-1 | |
MaxQ 6000 Incubated Shaker | Thermo Scientific | 8354-30-0009 | |
Microbiology Media: LB Broth (Powder) - Lennox | Fisher BioReagents | BP1427-500 | |
Microcentrifuge Tubes with Locking Snap Cap, 2ml | Fisher | 14-666-315 | |
Parafilm sealing film | Bemis | PM-996 | |
Phage stocks | Carolina Biological Supply | n/a | |
PicoLab® Mouse Diet 20 EXT | LabDiet | 5R58 | |
Pierce™ Chromogenic Endotoxin Quant Kit | Thermo Scientific | A39552S | |
RNase A (17,500 U) | Qiagen | 19101 | |
RNase-free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
Sodium Bicarbonate (Fine White Powder) | Fisher Chemical | BP328-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Chemical | S271 | |
Sonicator (probe model CL-18; power source model FB50) | Fisher scentific | n/a | |
Sterile flexible film isolator | Class Biologically Clean | n/a | |
SYBR™ Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
T4 phage primer, forward (CCACACATAGCGCGAGTATAA) | IDT | n/a | |
T4 phage primer, forward (GAAACTCGGTCAGGCTATCAA) | IDT | n/a | |
TissueLyser II | Qiagen | 85300 | |
Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | AAJ22638AE | |
Water, (DNASE, RNASE free) | Fisher BioReagents | BP2484100 |
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