Summary
تعد تفاعلات البروتين والبروتين مهمة لتوضيح وظيفة البروتينات المستهدفة ، ويمكن أن يؤكد الترسيب المناعي المشترك (co-IP) بسهولة مثبطات مضخة البروتون. لقد نقلنا بشكل عابر بلازميد يشفر بروتينا موسوما بالحواتم إلى خلايا HEK-293 وطورنا طريقة ترسيب مناعي لتأكيد ارتباط اثنين من البروتينات المستهدفة بسهولة.
Abstract
تلعب تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) دورا محوريا في الظواهر البيولوجية ، مثل التنظيم الخلوي ، ونقل الإشارات داخل الخلايا ، وتنظيم النسخ. لذلك ، يعد فهم مثبطات مضخة البروتون نقطة انطلاق مهمة لمزيد من التحقيق في وظيفة البروتين المستهدف. في هذه الدراسة ، نقترح طريقة بسيطة لتحديد ارتباط اثنين من البروتينات المستهدفة عن طريق إدخال ناقلات تعبير الثدييات في خلايا HEK-293 باستخدام طريقة polyethylenimine ، وتحلل الخلايا في مخزن تحلل البروتين محلي الصنع ، وسحب البروتينات المستهدفة على هلام تقارب علامة epitope. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تأكيد PPI بين البروتينات المنصهرة المختلفة لعلامة epitope باستخدام الأجسام المضادة للتقارب ضد كل علامة بدلا من هلام تقارب علامة epitope. يمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول للتحقق من مختلف PPIs ، بما في ذلك المستخلصات النووية ، من خطوط الخلايا الأخرى. لذلك ، يمكن استخدامه كطريقة أساسية في مجموعة متنوعة من تجارب PPI. تتحلل البروتينات عن طريق الدورة الزمنية الممتدة ودورات التجميد والذوبان المتكررة. لذلك ، يجب إجراء تحلل الخلايا ، والترسب المناعي ، والنشاف المناعي بسلاسة قدر الإمكان.
Introduction
تلعب البروتينات دورا رئيسيا في جميع الوظائف الخلوية ، بما في ذلك معالجة المعلومات ، والتمثيل الغذائي ، والنقل ، واتخاذ القرار ، والتنظيم الهيكلي. تتوسط البروتينات وظائفها من خلال التفاعل جسديا مع الجزيئات الأخرى. تعتبر تفاعلات البروتين والبروتين (PPIs) مهمة للتوسط في الوظائف الخلوية ، مثل التوسط في نقل الإشارات ، واستشعار البيئة ، وتحويل الطاقة إلى حركة فيزيائية ، وتنظيم نشاط الإنزيمات الأيضية والإشارات ، والحفاظ على التنظيم الخلوي1. وبالتالي ، يمكن استخدام PPIs لتوضيح الوظائف غير المعروفة2. يمكن تصنيف طرق الكشف عن مثبطات مضخة البروتون إلى ثلاثة أنواع: في المختبر ، في الجسم الحي ، وفي السيليكو. تم استخدام الترسيب المناعي المشترك (co-IP) ، وكروماتوغرافيا التقارب ، وتنقية التقارب الترادفي ، ومصفوفات البروتين ، وعرض العاثية ، وتكملة شظايا البروتين ، وعلم البلورات بالأشعة السينية ، والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي للكشف عن PPI في المختبر 3. من بين هذه الطرق ، يتم استخدام co-IP على نطاق واسع بسبب بساطته.
تتكون علامة الانصهار FLAG من ثمانية أحماض أمينية (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK) ، بما في ذلك موقع انقسام إنتيريوكيناز ، وقد تم تصميمه خصيصا لكروماتوغرافيا التقارب المناعي4. يتم التعرف على البروتينات الموسومة ب DYKDDDDK والتقاطها باستخدام جسم مضاد مضاد ل DYKDDDDK. لذلك ، يتم سحبها بكفاءةباستخدام حبات الأغاروز 5 المرتبطة ب DYKDDDDK لتأكيد ارتباطها ببروتينات معينة بطريقة بسيطة. يمكن إجراء الترسيب المناعي في مجموعة متنوعة من الخلايا ، ويمكن تأكيد مجموعة واسعة من مثبطات مضخة البروتون باستخدام الأجسام المضادة ضد البروتين محل الاهتمام. تم الإبلاغ سابقا عن الترسيب المناعي وشطف الببتيد مع حبات الأغاروز المضادة ل DYKDDDDK5.
هنا ، نقدم طريقة ترسيب مناعي بسيطة يتم فيها إدخال بلازميد يشفر بروتينا موسوما ب DYKDDDDK بشكل عابر في خلايا HEK-293 لتأكيد ارتباط بروتينين مهمين. يمكن أن ترتبط بعض الأجسام المضادة DYKDDDDK بكل من N-terminus و C-terminus لبروتينات الاندماج ولكن ليس غيرها6. لذلك ، لتجنب الالتباس ، يجب اختيار الجسم المضاد الذي يتعرف على العلامة المنصهرة في كل من N- و C-terminus. عند إدخال علامة حاتمة ، قد يكون من الممكن تجنب التغييرات التوافقية في البروتين عن طريق إدخال 3 إلى 12 زوجا أساسيا بين علامة الخاتم والبروتين المستهدف. ومع ذلك ، يجب أن يكون التسلسل المدرج زوجا أساسيا بمضاعفات 3 لتجنب إزاحة الإطار.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
يقدم الشكل 1 لمحة عامة عن البروتوكول.
1. إعداد الحلول والمخازن المؤقتة
- المخزن المؤقت لتحلل البروتين: قم بإعداد المخزن المؤقت لتحلل البروتين بعد تقرير منشور مسبقا7 (الجدول 1).
- محلول تحلل البروتين + مثبط الأنزيم البروتيني (PI): أضف مثبط الأنزيم البروتيني (انظر جدول المواد) إلى المخزن المؤقت المعد أعلاه (الخطوة 1.1). يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- عينة عازلة: امزج 900 ميكرولتر من 4x Laemmli عينة عازلة (انظر جدول المواد) و 100 ميكرولتر من 2-mercaptoethanol. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية.
- محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي سوربيتان (PBS-P): امزج 1.998 لتر من PBS و 2 مل من بولي أوكسي إيثيلين (20) أحادي سوربيتان (انظر جدول المواد). يحفظ في درجة حرارة الغرفة.
- 1x Tris / Glycine / SDS buffer: امزج 450 مل من DDW و 50 مل من 10x Tris / Glycine / SDS. تحضير في درجة حرارة الغرفة في يوم الاستخدام.
2. نقل البلازميد
- استزرع خلايا HEK-293 في طبق مغطى بالكولاجين 10 سم إلى التقاء فرعي (80٪ -95٪) باستخدام وسط النسر المعدل من Dulbecco الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني و 1٪ بنسلين-ستربتومايسين (10000 وحدة / مل بنسلين G و 10000 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) (انظر جدول المواد).
- تحضير 1-10 ميكروغرام من البلازميد7 ليتم نقلها لكل طبق وجعل مزيج transfection. أضف 150 mM NaCl إلى الحجم النهائي 250 ميكرولتر لكل طبق. دوامة وتدور أسفل الخليط.
- أضف 60 ميكرولتر من 1 مجم / مل بولي إيثيلين إنيمين (PEI ، انظر جدول المواد) لكل طبق ، متبوعا ب 150 mM NaCl إلى الحجم النهائي 250 ميكرولتر من محلول PEI.
- أضف محلول PEI إلى مزيج النقل لعمل محلول مختلط. دوامة على الفور (بأقصى سرعة لمدة 3-5 ثوان ، قم بنفس الشيء بعد ذلك) وتدور لأسفل.
- احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 15-30 دقيقة. خلال هذا الوقت ، قم بتغيير وسيط خلايا HEK-293.
- يرش 500 ميكرولتر / طبق من محلول مختلط في جميع أنحاء طبق خلايا HEK-293 ويحتضن طوال الليل (13-14 ساعة).
- أداء تبادل المتوسطة في اليوم التالي.
3. تحلل الخلية وإعداد العينة
ملاحظة: لتجنب تدهور البروتين ، يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة دون حفظ العينة أو تجميدها قدر الإمكان.
- بعد حوالي 48 ساعة من النقل ، اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد ، وأضف 500 ميكرولتر / طبق من محلول تحلل البروتين + PI ، واجمع الخلايا بواسطة مكشطة الخلايا وماصة في أنبوب به امتصاص منخفض للبروتين على الجليد.
- دوامة كل 5 دقائق واحتضان العينات على الجليد لمدة 10 دقائق.
- أجهزة الطرد المركزي عند 16400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع امتصاص منخفض للبروتين. يمكن تخزين العينات عند -80 درجة مئوية.
- حدد تركيز البروتين للعينات باستخدام مجموعة قياس تركيز البروتين وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
- افصل 200-1000 ميكروغرام من نفس الكمية من البروتين في كل عينة ، ثم أضف محلول تحلل البروتين + PI لضبط الحجم الكلي إلى 500-1000 ميكرولتر.
ملاحظة: يتم تنفيذ الخطوات التالية على الجليد.
4. إعداد الطين
ملاحظة: قم بإعداد ملاط 1: 1 من هلام البروتين G وهلام تقارب علامة epitope في اليوم السابق أو في يوم الترسيب المناعي.
- إعداد هلام البروتين G
- باستخدام طرف مع قطع النهاية ، امزج جيدا ثم افصل البروتين G gel (انظر جدول المواد) بحيث يتم تحضير 20 ميكرولتر من الخرز لكل عينة.
- أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ووضع الخرز على الجليد لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالاستواء. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل البروتين G المحضر في الخطوة 4.1.2 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
- كرر الخطوة 4.1.3 ثلاث مرات.
- أضف حجما متساويا من محلول تحلل البروتين إلى هلام البروتين G لعمل ملاط جل G بروتين 1: 1. يمكن تخزين ملاط جل البروتين G عند 4 °C لمدة 1 يوم تقريبا.
- إعداد هلام تقارب علامة epitope
- باستخدام طرف مع قطع النهاية ، قم بتحريكه جيدا ثم افصل جل تقارب علامة الخلاصة (انظر جدول المواد) بحيث يتم تحضير 10-15 ميكرولتر من الخرز لكل عينة.
- أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وانتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل تقارب علامة epitope المحضر في الخطوة 4.2.2 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرز بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- كرر الخطوة 4.2.3 مرتين.
- أضف 500 ميكرولتر من 0.1 M جليكاين (درجة الحموضة 3.5) إلى جل تقارب علامة الختم المحضر في الخطوة 4.2.4 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. يتم تنفيذ هذه الخطوة لإزالة الأجسام المضادة لعلامة epitope المجانية. في غضون 20 دقيقة بعد إضافة الجلايسين ، أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
- أضف 500 ميكرولتر من محلول تحلل البروتين + PI إلى جل تقارب علامة epitope المحضر في الخطوة 4.2.5 واخلطه عن طريق النقر والتقليب. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية ، ضع الخرزات على الثلج لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالتسوية ، وتخلص من المادة الطافية.
- كرر الخطوة 4.2.6 ثلاث مرات.
- أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت لتحلل البروتين إلى جل تقارب علامة epitope لتحضير ملاط جل تقارب علامة epitope 1: 1. يمكن تخزين ملاط جل التقارب بعلامة epitope عند 4 °C لمدة 1 يوم تقريبا.
5. المقاصة المسبقة باستخدام جل البروتين G والتقاط مجمعات البروتين باستخدام جل تقارب علامة الخاتمة
- امزج 1: 1 بروتين G ملاط (محضر في الخطوة 4) مع ماصة مزودة بطرف مقطوع وأضف 40 ميكرولتر في المرة الواحدة إلى العينة.
- قم بتدوير العينة لمدة 1 ساعة على دوار (انظر جدول المواد) في حوالي 30 ثانية لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية).
- أجهزة الطرد المركزي عند 12000 × جم لمدة 20 ثانية عند 4 درجات مئوية ووضع الخرز على الجليد لمدة 1 دقيقة للسماح للخرزات بالاستواء.
- اجمع المادة الطافية وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل مع امتصاص منخفض البروتين.
- افصل العينة لإدخالها عن العينة في الخطوة 5.4 وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 1.5 mL.
- أضف 20-30 ميكرولتر من ملاط جل علامة 1: 1 إلى العينة.
- قم بالتدوير على الدوار لمدة 30 ثانية تقريبا لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية) لمدة 2 ساعة.
- أضف عينة عازلة إلى المدخلات المعدة في الخطوة 5.5 لتخفيفها إلى 4x ، وقم بتسخينها عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. يمكن تخزين المدخلات عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: نظرا لاحتمال تدهور البروتين بسبب التجميد والذوبان ، يجب تنفيذ الخطوات اللاحقة دون الحفاظ على البروتين قدر الإمكان.
6. غسل واستخلاص البروتينات المترسبة
- اضبط درجة حرارة كتلة الحرارة على 98 درجة مئوية.
- أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية وانتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية. تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة.
- أضف 1 مل من محلول تحلل البروتين + PI واخلطه عن طريق النقر والتقليب. قم بالتدوير على الدوار لمدة 30 ثانية تقريبا لكل دورة في غرفة مبردة (4 درجات مئوية) لمدة 5 دقائق. أجهزة الطرد المركزي عند 5000 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 °C ، انتظر لمدة 1 دقيقة على الجليد للسماح للخرز بالتسوية ، وتجاهل المادة الطافية.
- كرر الخطوة 6.3 5-10 مرات.
- أضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة إلى العينة المعدة في الخطوة 6.4. تغلي على حرارة 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- أجهزة طرد مركزي عند 5000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 30 ثانية.
- ضع عمودا في أنبوب جديد مع امتصاص منخفض للبروتين وانقل الجل إلى العمود باستخدام ماصة ذات طرف مقطوع. يستخدم عمود لتجنب تلوث الجل.
- أجهزة الطرد المركزي عند 9730 × جم لمدة 1 دقيقة عند 4 درجات مئوية. اجمع التدفق من خلال. يمكن تخزين العينة عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: إذا كان تدهور العينة مصدر قلق ، فيجب إجراء النشاف المناعي التالي دون تجميد.
7. النشاف المناعي
ملاحظة: تستند إجراءات النشاف المناعي إلى التقارير السابقة 7,8.
- قم بتحميل عينات كاملة على هلام بولي أكريلاميد دوديسيل سلفات الصوديوم (SDS-PAGE ، انظر جدول المواد).
ملاحظة: إذا لزم الأمر ، استخدم المواد الهلامية ذات الآبار الكبيرة بحيث يمكن نقل العينة بأكملها. تم استخدام المواد الهلامية مع آبار 50 ميكرولتر هنا. - اضبط المواد الهلامية في غرفة الرحلان الكهربائي وأضف 1x Tris / Glycine / SDS buffer (انظر جدول المواد) حتى الحجم المناسب حول المواد الهلامية.
- المواد الهلامية الكهربائي في 100 فولت و 400 مللي أمبير.
- نقل إلى أغشية فلوريد البولي فينيليدين (PVDF ، انظر جدول المواد).
- سد بقع غشاء PVDF مع 5٪ حليب خالي الدسم في PBS-P لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS-P على شاكر بأقصى سرعة لمدة 5 دقائق. نفذ نفس الإجراء بعد ذلك عند الغسيل.
- احتضان طوال الليل على شاكر مع الجسم المضاد الأساسي (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية.
- اغسل الغشاء ثلاث مرات باستخدام PBS-P في اليوم التالي.
- احتضان لمدة 1 ساعة مع الجسم المضاد الثانوي على شاكر في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: إذا كان الوزن الجزيئي للبروتين المستهدف قريبا من سلسلة IgG الثقيلة ، والتي يبلغ وزنها الجزيئي حوالي 50 كيلو دالتون ، فيمكن استخدام جسم مضاد ثانوي خاص بالسلسلة الخفيفة لتجنب تداخل النطاق المستهدف مع سلسلة IgG الثقيلة. استخدمت هذه الدراسة الأجسام المضادة الخاصة بالسلسلة الخفيفة7 أو Veriblot ككاشف للكشف عن IP (انظر جدول المواد). - تحديد نطاقات البروتينات مع ركائز الانارة البيروكسيديز. يمكن حفظ الغشاء في PBS بعد غسله مرتين باستخدام PBS-P.
- قم بتجريده لمدة 10 دقائق بمحلول تجريد (انظر جدول المواد).
- اغسليها ثلاث مرات واحجبيها بالحليب الخالي من الدسم بنسبة 5٪ في PBS-P. والبروتوكول بعد ذلك هو نفسه كما في الخطوة 7-6 وما بعدها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
الخلايا الشحمية الحرارية ، والمعروفة أيضا باسم الخلايا الشحمية البنية والبيج ، لها تأثيرات محتملة مضادة للسمنة ومضادة لعدم تحمل الجلوكوز. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homologous) المجال الذي يحتوي على 16 (PRDM16) هو عامل مساعد للنسخ يلعب دورا مهما في تحديد هوية الخلايا الدهنية الحرارية 9,10.
EHMT1 (euchromatic histone-lysine N-methyltransferase 1) ، المعروف أيضا باسم GLP ، يحفز في المقام الأول أحادي وثنائي ميثيل ليسين 9 من هيستون H3 (H3K9) باستخدام العامل المساعد S-adenosyl methionine11. أشار تقرير سابق إلى أن EHMT1 هو ميثيل ترانسفيراز أساسي في مركب PRDM16 الذي يتحكم في مصير الخلايا الدهنية الحرارية من خلال مثيلة هيستون 12,13. علاوة على ذلك ، أبلغنا سابقا أن مستويات التعبير عن PRDM16 و EHMT1 ترتبط ارتباطا كبيرا بتلك الخاصة بالجينات الحرارية في الأنسجة الدهنية البنية المحيطة بالكلى البشرية (BAT) ، مما يشير إلى أن كلا من PRDM16 و EHMT1 يلعبان أدوارا مهمة في تطوير أفضل التقنيات المتاحة البشرية8.
لإثبات كفاءة هذا البروتوكول كطريقة لتأكيد مثبطات مضخة البروتون ، قمنا بنقل DYKDDDDK-PRDM16 و HA-EHMT1 إلى خلايا HEK-293 و DYKDDDDK-PRDM16 المترسب مناعيا باستخدام البروتوكول أعلاه. تم إدخال PRDM16 الموسوم ب DYKDDDDK و EHMT1 الموسوم ب HA في مواقع استنساخ ناقل تعبير الثدييات pcDNA3.1 (انظر جدول المواد). أكد النشاف المناعي الارتباط بين DYKDDDDK-PRDM16 و HA-EHMT1 في مجموعات تم نقلها باستخدام DYKDDDDK-PRDM16 و HA-EHMT1 (الشكل 2).
الشكل 1: التمثيل التخطيطي للترسيب المناعي المشترك. يظهر الرسم التخطيطي للبروتوكول هنا. يظهر الجانب الأيمن سير عمل البروتوكول ؛ يظهر الجانب الأيسر تمثيلا بيانيا لردود الفعل. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: يرتبط PRDM16 ب EHMT1. تم نقل خلايا HEK-293 باستخدام ناقل (تحكم سلبي) أو DYKDDDDK-PRDM16 أو DYKDDDDK-PRDM16 و HA-EHMT1. تم إجراء الترسيب المناعي المشترك لاحقا باستخدام جل تقارب علامة DYKDDDDK ، متبوعا بالنشاف المناعي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| محلول تحلل البروتين 250 مل (ترشيح 0.22 ميكرومتر ، يخزن في 4 درجات مئوية) | ||
| مل | التركيز النهائي | |
| 1 متر تريس درجة الحموضة 8.0 | 12.5 | 50 مللي متر |
| 5 م كلوريد الصوديوم | 7.5 | 150 مللي متر |
| 0.5 متر حمض الإيثيلين ديامينيترايتيك | 0.5 | 1 مللي متر |
| الجلسرين | 25 | 10% |
| بولي أوكسي إيثيلين(10) أوكتيل فينيل الأثير | 2.5 | 1% |
| DDW | 202 | |
| مجموع | 250 | |
الجدول 1: تكوين المخزن المؤقت لتحلل البروتين.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يشبه هذا البروتوكول تقريبا البروتوكولات التي تم الإبلاغ عنهاسابقا 5،7،14،15. النقطة المهمة في هذا البروتوكول هي أننا لا نوقف التجربة أبدا من خطوة تحلل الخلية إلى خطوة الترسيب المناعي. تدهور البروتين يعيق اكتشاف PPI. تؤدي الدورة الزمنية الممتدة ودورات التجميد والذوبان المتكررة إلى تحلل البروتينات. يجب أيضا إجراء الرحلان الكهربائي في SDS-PAGE في نفس يوم هطول الأمطار المناعي ليس فقط لتقليل تدهور البروتين ولكن أيضا لزيادة اكتشاف PPI.
في الخلايا الشحمية الحرارية ، تم الإبلاغ عن التفاعل بين EHMT1 و PRDM16 في دراسة سابقة13. ينظم مركب EHMT1 - PRDM16 مصير الخلايا الشحمية البنية وتوليد الحرارة13. EHMT1 يجعل PRDM16 يستقر عن طريق مقاطعة تفاعل PRDM16 - بروتين ربط بروتين الأميلويد (APPBP) 216. يتم تنظيم تثبيت PRDM16 هذا بواسطة cullin (CUL) 2-APPBP2 و EHMT116.
في هذه الدراسة ، تم استخدام خلايا HEK-293 لأن خلايا HEK-293 تستخدم على نطاق واسع في إنتاج البروتينات المؤتلفة17. يمكن استخدام خطوط الخلايا الأخرى التي يسهل نقلها مع البلازميدات ، مثل خلايا Cos-7 وخلايا Hela. تم استخدام PEI للنقل لأن PEI أكثر اقتصادا وأبسط مقارنة ب lipofection التقليدية.
يعد التطهير المسبق والتناوب في هلام تقارب علامة الختم والغسيل خطوات مهمة بشكل خاص في هذه الطريقة. يمكن أن يزيل التطهير المسبق البروتينات التي ترتبط بشكل غير محدد بالهلام. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وقت الدوران مع هلام تقارب علامة epitope مهم لأن الوقت المفرط قد يؤدي إلى اكتشاف بروتين غير محدد ، وقد يعيق الوقت غير الكافي اكتشاف البروتينات المستهدفة.
وتجدر الإشارة إلى النقاط التالية. خلايا HEK-293 تنفصل بسهولة ؛ لذلك ، يجب استخدام الأطباق المطلية بالكولاجين عند تحضير العينات. حل PEI سام للخلايا. لذلك ، يجب استبدال الوسط بعد النقل دون مغادرة الخلايا لفترة طويلة. إذا لم يتم ملاحظة مثبطات مضخة البروتون ، فقد تكون كمية البلازميدات المنقولة غير كافية و / أو قد تكون كمية البروتين التي يتم إحضارها إلى IP منخفضة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كان عدد الغسلات مفرطا ، فقد يتم تفويت التفاعلات. لمعالجة هذه ، يمكن النظر في ما يلي: زيادة كمية البلازميد التي يتم إدخالها في خلايا HEK-293 ، وزيادة كمية البروتين المستخدمة في IP ، وتقليل عدد عمليات الغسل. علاوة على ذلك ، إذا تم ترك الكثير من المواد الطافية في الغسيل النهائي ، فسوف تفيض من آبار هلام دوديسيل كبريتات بولي أكريلاميد الصوديوم. إذا لوحظت أشرطة غير محددة ، فقد تكون كمية البلازميد / البروتين المستخدمة في IP عالية جدا ، أو قد يكون عدد أو شدة الغسلات غير كافية. يمكن معالجة هذه عن طريق تقليل كمية البلازميد / البروتين المستخدم في IP ، أو زيادة عدد الغسلات ، أو زيادة قوة الغسيل عن طريق زيادة تركيز الملح في المخزن المؤقت للغسيل.
قد تؤدي المنظفات شائعة الاستخدام مثل بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل إيثر إلى تعطيل PPIs ذات الأهميةالوظيفية 18. قد تزيد المنظفات الأكثر اعتدالا من استعادة المجمعات المهمة وظيفيا ، في حين أنها يمكن أن تسفر عن مستوى غير مقبول من التفاعلات غير المحددة بسبب الذوبان غير الكامل. يحتوي محلول تحلل البروتين المستخدم في الدراسة الحالية على 1٪ بولي أوكسي إيثيلين (10) أوكتيل فينيل إيثر. يقوم هذا المخزن المؤقت بتحليل البروتينات السيتوبلازمية بكميات عالية من البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل مفرط بواسطة البلازميدات المنقولة. عندما يتم إجراء الترسيب المناعي على العينات المحضرة عن طريق فصل النوى والسيتوبلازم ، تتضاءل الخلفية مقارنة بالعينات المحضرة بواسطة تحلل الخلية الكاملة ، ويمكن تحديد نطاقات مستهدفة واضحة17. إذا تم إجراء الترسيب المناعي مع البروتينات في النواة ، يمكن استخراج البروتينات النووية باستخدام مجموعة استخراج نووية تجارية أو عن طريق تدمير وإزالة السيتوبلازم مع مخزن مؤقت منخفض الملح يحتوي على منظف ثم استخراج البروتينات النووية ذات المخزن المؤقت عالي الملح19. يجب تعديل وقت التطوير في النشاف المناعي ليس فقط لتجنب الخلفية ولكن أيضا للكشف عن نطاقات معينة.
هذه الطريقة لديها العديد من القيود. أولا ، استخدمنا مؤشر أسعار المنتجين الذي من المتوقع بشدة اكتشافه. ثانيا ، نظرا لأن التعبير عن كل جين يعتمد على مزيج من البلازميدات ، فقد يتم الحصول على بروتين غير كاف ، وبالتالي قد لا يتم اكتشاف التفاعل.
باختصار ، باستخدام هذه الطريقة ، يمكن تأكيد PPIs اقتصاديا وبسهولة مقارنة بقياس الطيف الكتلي. يمكن أيضا تأكيد PPI بين مختلف البروتينات المنصهرة لعلامة epitope باستخدام الأجسام المضادة للتقارب ضد كل علامة بدلا من هلام تقارب علامة epitope. يمكن إجراء طرق ترسيب مناعي مماثلة في أنواع الخلايا الأخرى عن طريق إدخال بلازميد يعبر عن أي بروتين مدمج في علامة DYKDDDDK. علاوة على ذلك ، فإن استخدام الأجسام المضادة الداخلية بدلا من هلام تقارب علامة epitope يجعل من الممكن تأكيد PPIs الداخلية في أنواع الخلايا المختلفة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
نعلن أنه ليس لدى أي من المؤلفين أي تضارب في المصالح يتعلق بهذه الدراسة.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (JSPS) KAKENHI رقم المنحة 19K18008 (GN) ، JSPS KAKENHI رقم المنحة 22K16415 (GN) ، رقم منحة JSPS KAKENHI 22K08672 (H.O.) ، منحة أبحاث جمعية السكري اليابانية للباحثين الشباب (GN) ، ومنحة أبحاث مؤسسة MSD Life Science Foundation للمحققين الشباب (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
