Summary
Protein-proteininteraktioner är viktiga för att klarlägga funktionen hos målproteiner, och co-immunoprecipitation (co-IP) kan enkelt bekräfta protonpumpshämmare. Vi transfekterade tillfälligt en plasmid som kodar för ett epitopmärkt protein till HEK-293-celler och utvecklade en immunoprecipitationsmetod för att enkelt bekräfta bindningen av två målproteiner.
Abstract
Protein-proteininteraktioner (PPI) spelar en central roll i biologiska fenomen, såsom cellulär organisation, intracellulär signaltransduktion och transkriptionell reglering. Att förstå protonpumpshämmare är därför en viktig utgångspunkt för vidare undersökning av målproteinets funktion. I denna studie föreslår vi en enkel metod för att bestämma bindningen av två målproteiner genom att introducera däggdjurs uttrycksvektorer i HEK-293-celler med hjälp av polyetyleniminmetoden, lysera cellerna i hemmagjord proteinlysbuffert och dra ner målproteinerna på en epitoptaggaffinitetsgel. Dessutom kan PPI mellan de olika epitoptaggsmälta proteinerna bekräftas genom att använda affinitetsantikroppar mot varje tagg istället för epitoptaggens affinitetsgel. Detta protokoll kan också användas för att verifiera olika protonpumpshämmare, inklusive kärnextrakt, från andra cellinjer. Därför kan den användas som en grundläggande metod i en mängd olika PPI-experiment. Proteiner bryts ned genom förlängda tidsförlopp och upprepade frys-upptiningscykler. Därför bör celllys, immunoprecipitering och immunoblotning utföras så sömlöst som möjligt.
Introduction
Proteiner spelar en viktig roll i alla cellulära funktioner, inklusive informationsbehandling, metabolism, transport, beslutsfattande och strukturell organisation. Proteiner medierar sina funktioner genom att interagera fysiskt med andra molekyler. Protein-proteininteraktioner (PPI) är viktiga för att förmedla cellulära funktioner, såsom att förmedla signalöverföring, känna av omgivningen, omvandla energi till fysisk rörelse, reglera aktiviteten hos metaboliska och signalerande enzymer och upprätthålla cellulär organisation1. Således kan protonpumpshämmare användas för att belysa okända funktioner2. Metoder för att detektera protonpumpshämmare kan delas in i tre typer: in vitro, in vivo och in silico. Co-immunoprecipitation (co-IP), affinitetskromatografi, tandemaffinitetsrening, proteinarrayer, fagdisplay, proteinfragmentkomplementering, röntgenkristallografi och kärnmagnetisk resonansspektroskopi har använts för in vitro PPI-detektion3. Bland dessa metoder används co-IP i stor utsträckning på grund av dess enkelhet.
Fusionstaggen FLAG består av åtta aminosyror (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), inklusive ett enterokinasklyvningsställe, och är speciellt utformat för immunoaffinitetskromatografi4. DYKDDDDK-märkta proteiner känns igen och fångas upp med hjälp av en anti-DYKDDDDK-antikropp. Därför dras de effektivt ner med hjälp av DYKDDDDK-bindande agarospärlor5 för att bekräfta deras bindning till specifika proteiner på ett enkelt sätt. Immunoprecipitering kan utföras i en mängd olika celler, och ett brett spektrum av protonpumpshämmare kan bekräftas med hjälp av antikroppar mot det protein som är av intresse. Immunoprecipitation och peptideluering med anti-DYKDDDDK agarospärlor har tidigare rapporterats5.
Här tillhandahåller vi en enkel immunoprecipitationsmetod där en plasmid som kodar för ett DYKDDDDK-märkt protein tillfälligt introduceras i HEK-293-celler för att bekräfta associationen mellan två proteiner av intresse. Vissa DYKDDDDK-antikroppar kan binda till både N-terminalen och C-terminalen av fusionsproteinerna, meninte andra. Därför, för att undvika förvirring, bör den antikropp som känner igen taggen som är sammansmält till både N- och C-terminalen väljas. När man sätter in en epitoptagg kan det vara möjligt att undvika konformationsförändringar i proteinet genom att sätta in 3 till 12 baspar mellan epitoptaggen och målproteinet. Den infogade sekvensen bör dock vara ett baspar i multiplar av 3 för att undvika frameshift.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1 visar en översikt över protokollet.
1. Beredning av lösningar och buffertar
- Proteinlysbuffert: Förbered proteinlysbufferten enligt en tidigare publicerad rapport7 (tabell 1).
- Proteinlysbuffert + proteashämmare (PI): Tillsätt proteashämmare (se Materialtabell) till den ovan förberedda bufferten (steg 1.1). Förvaras vid -20 °C.
- Provbuffert: Blanda 900 μL 4x Laemmli provbuffert (se Materialtabell) och 100 μL 2-merkaptoetanol. Förvaras vid -20 °C.
- Fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) med polyoxietylen (20) sorbitanmonolaurat (PBS-P): Blanda 1,998 l PBS och 2 ml polyoxietylen (20) sorbitanmonolaurat (se materialtabell). Förvaras i rumstemperatur.
- 1x Tris/Glycin/SDS-buffert: Blanda 450 ml DDW och 50 ml 10x Tris/Glycin/SDS. Förbered i rumstemperatur på användningsdagen.
2. Transfektion av plasmider
- Odla HEK-293-celler i en 10 cm kollagenbelagd skål till subkonfluens (80%-95%) med hjälp av Dulbeccos modifierade örnmedium innehållande 10 % fetalt bovint serum och 1 % penicillin-streptomycin (10 000 enheter/ml penicillin G och 10 000 μg/ml streptomycin) (se Materialförteckning).
- Förbered 1-10 μg plasmid7 som ska transfekteras per maträtt och gör en transfektionsblandning. Tillsätt 150 mM NaCl till en slutlig volym på 250 μL per maträtt. Virvla och snurra ner blandningen.
- Tillsätt 60 μL 1 mg/ml polyetylenimin (PEI, se materialtabell) per maträtt, följt av 150 mM NaCl till en slutlig volym på 250 μL PEI-lösning.
- Tillsätt PEI-lösningen till transfektionsblandningen för att göra en blandad lösning. Virvla omedelbart (med högsta hastighet i 3-5 s, utför samma sak därefter) och snurra ner.
- Inkubera i rumstemperatur i 15-30 min. Under denna tid, byt medium för HEK-293-celler.
- Strö 500 μL/skål med blandad lösning över hela skålen med HEK-293-celler och inkubera över natten (13-14 timmar).
- Utför mediumbyte nästa dag.
3. Celllys och provberedning
OBS: För att undvika proteinnedbrytning bör efterföljande steg utföras utan konservering eller frys-upptining av provet så mycket som möjligt.
- Cirka 48 timmar efter transfektion, tvätta cellerna tre gånger med iskall PBS, tillsätt 500 μL/skål proteinlysbuffert + PI och samla in cellerna med cellskrapa och en pipett i ett rör med låg proteinadsorption på is.
- Virvla var 5:e minut och inkubera proverna på is i 10 minuter.
- Centrifugera vid 16 400 x g i 10 minuter vid 4 °C. Samla upp supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 ml rör med låg proteinadsorption. Proverna kan förvaras vid -80 °C.
- Bestäm proteinkoncentrationen i proverna med ett kit för mätning av proteinkoncentration enligt tillverkarens protokoll (se materialtabell).
- Separera 200-1000 μg av samma mängd protein i varje prov, tillsätt sedan proteinlysbuffert + PI för att justera den totala volymen till 500-1000 μL.
OBS: Följande steg utförs på is.
4. Beredning av flytgödsel
OBS: Förbered en 1:1 slurry av protein G-gel och epitoptaggaffinitetsgel dagen före eller på dagen för immunprecipition.
- Beredning av en protein G-gel
- Använd en spets med änden avskuren, blanda väl och separera sedan protein G-gelen (se Materialtabell) så att 20 μL pärlor per prov bereds.
- Centrifugera vid 12 000 x g i 20 s vid 4 °C och lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna planar ut. Kassera supernatanten med hjälp av en pipett.
- Tillsätt 1 ml proteinlysbuffert + PI till protein-G-gelen som beretts i steg 4.1.2 och blanda genom att knacka och invertera. Centrifugera vid 12 000 x g i 20 s vid 4 °C, lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna planar ut och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 4.1.3 tre gånger.
- Tillsätt en lika stor volym proteinlysbuffert till protein G-gelen för att göra en 1:1 protein G-geluppslamning. Protein G-gelslurry kan förvaras vid 4 °C i cirka 1 dag.
- Beredning av en epitoptaggaffinitetsgel
- Använd en spets med änden avskuren, skaka väl och separera sedan epitoptaggens affinitetsgel (se Materialtabell) så att 10-15 μL pärlor per prov bereds.
- Centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C och vänta i 1 minut på is så att pärlorna planar ut. Kassera supernatanten med hjälp av en pipett.
- Tillsätt 1 ml proteinlysbuffert + PI till epitoptaggaffinitetsgelen som beretts i steg 4.2.2 och blanda genom att knacka och invertera. Centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C, lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna planar ut och kassera supernatanten med en pipett.
- Upprepa steg 4.2.3 två gånger.
- Tillsätt 500 μl 0,1 M glycin (pH 3,5) till epitoptaggaffinitetsgelen som beretts i steg 4.2.4 och blanda genom att knacka och invertera. Detta steg utförs för att avlägsna fria epitoptaggantikroppar. Inom 20 minuter efter tillsats av glycin, centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C, lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna kan plana ut och kassera supernatanten.
- Tillsätt 500 μL proteinlysbuffert + PI till epitoptaggaffinitetsgelen som beretts i steg 4.2.5 och blanda genom att knacka och invertera. Centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C, lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna planar ut och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 4.2.6 tre gånger.
- Tillsätt en lika stor volym proteinlysbuffert till epitoptaggaffinitetsgelen för att förbereda en 1:1 epitoptaggaffinitetsgelslurry. Epitope Tag affinity gel slurry kan förvaras vid 4 °C i cirka 1 dag.
5. Preclearing med protein G-gelen och fånga in proteinkomplex med epitoptaggaffinitetsgelen
- Blanda 1:1 protein G-slurry (beredd i steg 4) med en pipett försedd med en avskuren spets och tillsätt 40 μL åt gången till provet.
- Rotera provet i 1 timme på en rotator (se materialtabell) i cirka 30 s per cykel i en kylkammare (4 °C).
- Centrifugera vid 12 000 x g i 20 s vid 4 °C och lägg pärlorna på is i 1 minut så att pärlorna planar ut.
- Samla in supernatanten och överför den till ett nytt 1,5 ml rör med låg proteinadsorption.
- Separera sample för input från sample i steg 5.4 och överför den till ett nytt 1.5 ml rör.
- Tillsätt 20–30 μL 1:1 epitoptagggelslurry till provet.
- Rotera på en rotator i cirka 30 s per cykel i en kylkammare (4 °C) i 2 timmar.
- Tillsätt provbufferten till den tillförsel som förbereddes i steg 5.5 för att späda ut den till 4 gånger och värm vid 98 °C i 10 minuter. Ingången kan lagras vid -80 °C.
OBS: På grund av risken för proteinnedbrytning på grund av frysning och upptining bör efterföljande steg utföras utan att bevara proteinet så mycket som möjligt.
6. Tvättning och eluering av de utfällda proteinerna
- Ställ in temperaturen på värmeblocket till 98 °C.
- Centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C och vänta i 1 minut på is så att pärlorna planar ut. Kassera supernatanten med hjälp av en pipett.
- Tillsätt 1 ml proteinlysbuffert + PI och blanda genom att knacka och invertera. Rotera på en rotator i cirka 30 s per cykel i en kylkammare (4 °C) i 5 min. Centrifugera vid 5 000 x g i 30 s vid 4 °C, vänta i 1 minut på isen så att pärlorna kan plana ut och kassera supernatanten.
- Upprepa steg 6.3 5-10 gånger.
- Tillsätt 10 μl provbuffert till provet som beretts i steg 6.4. Koka upp vid 98 °C i 10 min.
- Centrifugera vid 5 000 x g vid 4 °C i 30 s.
- Placera en pelare i ett nytt rör med låg proteinadsorption och överför gelen till kolonnen med hjälp av en pipett med en skuren spets. En kolonn används för att undvika kontaminering av gelen.
- Centrifugera vid 9 730 x g i 1 minut vid 4 °C. Samla in genomströmningen. Provet kan förvaras vid -80 °C.
OBS: Om provnedbrytning är ett problem, bör följande immunobloting utföras utan frysning.
7. Immunoblotning
OBS: Immunoblot-procedurerna är baserade på tidigare rapporter 7,8.
- Ladda hela prover på en natriumdodecylsulfat polyakrylamidgel (SDS-PAGE, se Materialtabell).
OBS: Använd vid behov geler med stora brunnar så att hela sample kan överföras. Geler med 50 μL brunnar användes här. - Sätt gelerna i elektroforeskammaren och tillsätt 1x Tris/Glycine/SDS-buffert (se Materialtabell) upp till lämplig volym runt gelerna.
- Elektroforesgeler vid 100 V och 400 mA.
- Överför till membran av polyvinylidenfluorid (PVDF, se materialtabell).
- Blockera PVDF-membranfläckarna med 5 % skummjölk i PBS-P i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta membranet tre gånger med PBS-P på en shaker på högsta hastighet i 5 min. Utför sedan samma procedur när du tvättar.
- Inkubera över natten i en skakapparat med primär antikropp (se materialtabell) vid 4 °C.
- Tvätta membranet tre gånger med PBS-P nästa dag.
- Inkubera i 1 timme med den sekundära antikroppen i en skakapparat vid rumstemperatur.
OBS: Om målproteinets molekylvikt ligger nära den tunga IgG-kedjan, som har en molekylvikt på cirka 50 kDa, kan en lätt kedjespecifik sekundär antikropp användas för att undvika överlappning av målbandet med den tunga IgG-kedjan. I denna studie användes lättkedjespecifika antikroppar7 eller Veriblot som IP-detektionsreagens (se Materialtabell). - Identifiera band av proteiner med peroxidasluminescerande substrat. Membranet kan sparas i PBS efter att ha tvättats två gånger med PBS-P.
- Skala av i 10 minuter med en stripplösning (se materialtabell).
- Tvätta tre gånger och blockera med 5 % skummjölk i PBS-P. Protokollet därefter är detsamma som i steg 7.6 och framåt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Termogena adipocyter, även kända som bruna och beige adipocyter, har potentiella effekter mot fetma och glukosintolerans. PR (PRD1-BF1-RIZ1 homolog) domäninnehållande 16 (PRDM16) är en transkriptionskofaktor som spelar en viktig roll för att bestämma termogen adipocytidentitet 9,10.
EHMT1 (eukromatiskt histon-lysin N-metyltransferas 1), även känt som GLP, katalyserar främst mono- och dimetyleringen av lysin 9 av histon H3 (H3K9) med hjälp av kofaktorn S-adenosylmetionin 11. En tidigare rapport indikerade att EHMT1 är ett essentiellt metyltransferas i PRDM16-komplexet som styr termogena fettcellers öde genom histonmetylering12,13. Dessutom har vi tidigare rapporterat att uttrycksnivåerna av PRDM16 och EHMT1 är signifikant korrelerade med de för termogena gener i human perirenal brun fettvävnad (BAT), vilket tyder på att både PRDM16 och EHMT1 spelar viktiga roller i human BAT-utveckling8.
För att demonstrera effektiviteten av detta protokoll som en metod för att bekräfta protonpumpshämmare transfekterade vi DYKDDDDK-PRDM16 och HA-EHMT1 till HEK-293-celler och immunutfällde DYKDDDDK-PRDM16 med hjälp av ovanstående protokoll. DYKDDDDK-märkta PRDM16 och HA-märkta EHMT1 sattes in i kloningsställena för däggdjursuttrycksvektorn pcDNA3.1 (se Materialförteckning). Immunoblot bekräftade sambandet mellan DYKDDDDK-PRDM16 och HA-EHMT1 i grupper som transfekterades med DYKDDDDK-PRDM16 och HA-EHMT1 (Figur 2).
Figur 1: Schematisk representation av co-immunoprecipitation. Schemat för protokollet visas här. Den högra sidan visar arbetsflödet för protokollet; Den vänstra sidan visar en grafisk representation av reaktionerna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: PRDM16 associeras med EHMT1. HEK-293-celler transfekterades med vektor (negativ kontroll), DYKDDDDK-PRDM16, eller DYKDDDDK-PRDM16 och HA-EHMT1. Co-immunoprecipitering utfördes därefter med hjälp av en DYKDDDDK tag affinity gel, följt av immunoboting. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Proteinlysbuffert 250 ml (0,22 μm filtrering, förvaras vid 4 °C) | ||
| Ml | Slutlig koncentration | |
| 1 M Tris pH 8,0 | 12.5 | 50 m² |
| 5 M NaCl | 7.5 | 150 mM |
| 0,5 M etylendiamintetraättiksyra | 0.5 | 1 mM |
| Glycerol | 25 | 10% |
| Polyoxietylen(10) Oktylfenyleter | 2.5 | 1% |
| DDW | 202 | |
| Total | 250 | |
Tabell 1: Sammansättning av proteinlysbuffert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll är nästan som tidigare rapporterade protokoll 5,7,14,15. Den viktiga poängen med detta protokoll är att vi aldrig stoppar experimentet från celllyssteget till immunprecipitationssteget. Proteinnedbrytning hindrar PPI-detektion. Förlängda tidsförlopp och upprepade frys-upptiningscykler bryter ner proteiner. Elektrofores i SDS-PAGE bör också utföras samma dag som immunprecipition, inte bara för att minimera proteinnedbrytning utan också för att maximera PPI-detektion.
I termogena adipocyter rapporterades interaktionen mellan EHMT1 och PRDM16 i en tidigare studie13. EHMT1 - PRDM16-komplexet reglerar öde och termogenes13 i bruna adipocytceller. EHMT1 får PRDM16 att stabiliseras genom att avbryta interaktionen mellan PRDM16 - Amyloid proteinbindande protein (APPBP) 216. Denna PRDM16-stabilisering regleras av cullin(CUL) 2-APPBP2 och EHMT116.
I denna studie användes HEK-293-celler eftersom HEK-293-celler används i stor utsträckning vid produktion av rekombinanta proteiner17. Andra cellinjer som är lätta att transfektera med plasmider kan användas, till exempel Cos-7-celler och Hela-celler. PEI användes för transfektion eftersom PEI är mer ekonomiskt och enklare jämfört med konventionell lipofection.
Preclearing, rotation i en epitoptaggaffinitetsgel och tvättning är särskilt viktiga steg i denna metod. Preclearing kan ta bort de proteiner som binder ospecifikt till gelen. Dessutom är tiden för rotation med epitoptaggaffinitetsgelen viktig eftersom alltför lång tid kan resultera i ospecifik proteindetektion, och otillräcklig tid kan hindra detektion av målproteinerna.
Följande punkter bör noteras. HEK-293-celler lossnar lätt; Därför bör kollagenbelagda rätter användas vid beredning av proverna. PEI-lösning är cytotoxisk; Därför bör mediet bytas ut efter transfektion utan att lämna cellerna under en längre period. Om protonpumpshämmare inte observeras kan mängden transfekterade plasmider vara otillräcklig och/eller mängden protein som förs in i IP kan vara låg. Dessutom, om antalet tvättar är överdrivet, kan interaktionerna missas. För att ta itu med dessa kan följande övervägas: öka mängden plasmid som introduceras i HEK-293-celler, öka mängden protein som används för IP och minska antalet tvättar. Dessutom, om för mycket supernatant finns kvar i den slutliga tvätten, kommer det att svämma över från brunnarna av natriumdodecylsulfat-polyakrylamidgel. Om ospecifika band observeras kan mängden plasmid/protein som används för IP vara för hög, eller så kan antalet eller intensiteten av tvättarna vara otillräckliga. Dessa kan åtgärdas genom att minska mängden plasmid/protein som används för IP, öka antalet tvättar eller öka tvätteffekten genom att öka saltkoncentrationen i tvättbufferten.
Vanligt förekommande rengöringsmedel som polyoxietylen (10) oktylfenyleter kan störa funktionellt signifikanta protonpumpshämmare18. Mildare rengöringsmedel kan öka återvinningen av funktionellt viktiga komplex, samtidigt som de kan ge en oacceptabel nivå av ospecifika interaktioner på grund av ofullständig solubilisering. Proteinlysbufferten som användes i den aktuella studien innehåller 1 % polyoxietylen (10) oktylfenyleter. Denna buffert omvandlar cytoplasmatiska proteiner med stora mängder proteiner som överuttrycks av de transfekterade plasmiderna. När immunoprecipitering utförs på prover som preparerats genom att separera kärnor och cytoplasma, försvagas bakgrunden jämfört med prover som preparerats genom helcellslys, och tydliga målband kan identifieras17. Om immunoprecipitering utförs med proteiner i kärnan kan kärnproteiner extraheras med hjälp av en kommersiell kärnextraktionssats eller genom att förstöra och avlägsna cytoplasma med låg saltbuffert som innehåller rengöringsmedel och därefter extrahera kärnproteiner med hög saltbuffert19. Utvecklingstiden i immunoblot bör justeras inte bara för att undvika bakgrundsbildning utan också för att detektera vissa band.
Denna metod hade flera begränsningar. Först använde vi en PPI som förväntas upptäcka. För det andra, eftersom uttrycket av varje gen beror på kombinationen av plasmider, kan otillräckligt protein erhållas, och interaktionen kan därför inte upptäckas.
Sammanfattningsvis kan man med hjälp av denna metod bekräfta protonpumpshämmare ekonomiskt och enkelt jämfört med masspektrometri. PPI:n mellan de olika epitoptaggens sammansmälta proteiner kan också bekräftas genom att använda affinitetsantikroppar mot varje tagg istället för epitoptaggens affinitetsgel. Liknande immunprecipiteringsmetoder kan utföras i andra celltyper genom att introducera en plasmid som uttrycker vilket protein som helst som är smält till DYKDDDDK-taggen. Att använda endogena antikroppar istället för en epitoptaggaffinitetsgel gör det dessutom möjligt att bekräfta endogena protonpumpshämmare i olika celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi försäkrar att ingen av författarna har några intressekonflikter relaterade till denna studie.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI GRANT NUMBER 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI GRANT NUMBER 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) och MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
- Braun, P., Gingras, A. History of protein-protein interactions: from egg-white to complex networks. Proteomics. 12 (10), 1478-1498 (2012).
- Yanagida, M.
- Rao, V. S., Srinivas, K., Sujini, G. N., Kumar, G. N. S. Protein-protein interaction detection: methods and analysis. International Journal of Proteomics. 2014, 147648 (2014).
- Hopp, T. P., et al. A short polypeptide marker sequence useful for recombinant protein identification and purification. Nature Biotechnology. 6 (10), 1204-1210 (1988).
- Gerace, E., Moazed, D. Affinity pull-down of proteins using anti-FLAG M2 agarose beads. Methods in Enzymology. 559, 99-110 (2015).
- Einhauer, A., Jungbauer, A. The FLAG peptide, a versatile fusion tag for the purification of recombinant proteins. Journal of biochemical and biophysical methods. 49 (1-3), 455-465 (2001).
- Egusa, G., et al. Selective activation of PPARα maintains thermogenic capacity of beige adipocytes. iScience. 26 (7), 107143 (2023).
- Nagano, G., et al. Activation of classical brown adipocytes in the adult human perirenal depot is highly correlated with PRDM16-EHMT1 complex expression. PLoS One. 10 (3), e0122584 (2015).
- Seale, P., et al. Transcriptional control of brown fat determination by PRDM16. Cell Metabolism. 6 (1), 38-54 (2007).
- Kajimura, S., et al. Regulation of the brown and white fat gene programs through a PRDM16/CtBP transcriptional complex. Genes and Development. 22 (10), 1397-1409 (2008).
- Shinkai, Y., Tachibana, M. H3K9 methyltransferase G9a and the related molecule GLP. Genes and Development. 25 (8), 781-788 (2011).
- Able, A. A., Richard, A. J., Stephens, J. M. TNFα effects on adipocytes are influenced by the presence of lysine methyltransferases, G9a (EHMT2) and GLP (EHMT1). Biology. 12 (5), 674 (2023).
- Ohno, H., Shinoda, K., Ohyama, K., Sharp, L. Z., Kajimura, S. EHMT1 controls brown adipose cell fate and thermogenesis through the PRDM16 complex. Nature. 504 (7478), 163-167 (2013).
- Bian, W., et al. Protocol for establishing a protein-protein interaction network using tandem affinity purification followed by mass spectrometry in mammalian cells. STAR Protocols. 3 (3), 101569 (2022).
- Cristea, I. M., Chait, B. T.
- Wang, Q., et al. Post-translational control of beige fat biogenesis by PRDM16 stabilization. Nature. 609 (7925), 151-158 (2022).
- Holden, P., Horton, W. Crude subcellular fractionation of cultured mammalian cell lines. BMC Research Notes. 2, 243 (2009).
- Yang, L., Zhang, H., Bruce, J. E. Optimizing the detergent concentration conditions for immunoprecipitation (IP) coupled with LC-MS/MS identification of interacting proteins. Analyst. 134 (4), 755-762 (2009).
- Herrmann, C., Avgousti, D. C., Weitzman, M. D. Differential salt fractionation of nuclei to analyze chromatin-associated proteins from cultured mammalian cells. BIO-PROTOCOL. 7 (6), e2175 (2017).
