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Biology

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एंटी-एपिटोप टैग एफिनिटी जेल के साथ इम्यूनोप्रिपिटेशन

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/66085
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Molecular and Internal Medicine, Graduate School of Biomedical & Health Sciences, Hiroshima University

Summary

लक्ष्य प्रोटीन के कार्य को स्पष्ट करने के लिए प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन महत्वपूर्ण हैं, और सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी) आसानी से पीपीआई की पुष्टि कर सकते हैं। हमने क्षणिक रूप से एक प्लास्मिड एन्कोडिंग को HEK-293 कोशिकाओं में एक एपिटोप-टैग प्रोटीन को ट्रांसफ़ेक्ट किया और दो लक्ष्य प्रोटीनों के बंधन की आसानी से पुष्टि करने के लिए एक इम्यूनोप्रिपिटेशन विधि विकसित की।

Abstract

प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) जैविक घटनाओं में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, जैसे कि सेलुलर संगठन, इंट्रासेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन और ट्रांसक्रिप्शनल विनियमन। इसलिए, पीपीआई को समझना लक्ष्य प्रोटीन के कार्य की आगे की जांच के लिए एक महत्वपूर्ण प्रारंभिक बिंदु है। इस अध्ययन में, हम पॉलीइथाइलेनिमाइन विधि का उपयोग करके HEK-293 कोशिकाओं में स्तनधारी अभिव्यक्ति वैक्टर पेश करके दो लक्ष्य प्रोटीन के बंधन को निर्धारित करने के लिए एक सरल विधि का प्रस्ताव करते हैं, घर के बने प्रोटीन लाइसिस बफर में कोशिकाओं को लाइसिंग करते हैं, और एक एपिटोप टैग आत्मीयता जेल पर लक्ष्य प्रोटीन को नीचे खींचते हैं। इसके अलावा, विभिन्न एपिटोप टैग फ्यूज्ड प्रोटीन के बीच पीपीआई को एपिटोप टैग एफिनिटी जेल के बजाय प्रत्येक टैग के खिलाफ एफिनिटी एंटीबॉडी का उपयोग करके पुष्टि की जा सकती है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग अन्य सेल लाइनों से परमाणु अर्क सहित विभिन्न पीपीआई को सत्यापित करने के लिए भी किया जा सकता है। इसलिए, इसका उपयोग विभिन्न प्रकार के पीपीआई प्रयोगों में एक बुनियादी विधि के रूप में किया जा सकता है। प्रोटीन विस्तारित समय पाठ्यक्रम और बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्रों द्वारा नीचा दिखाते हैं। इसलिए, सेल lysis, immunoprecipitation, और immunoblotting के रूप में संभव के रूप में मूल प्रदर्शन किया जाना चाहिए.

Introduction

प्रोटीन सभी सेलुलर कार्यों में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं, जिसमें सूचना प्रसंस्करण, चयापचय, परिवहन, निर्णय लेने और संरचनात्मक संगठन शामिल हैं। प्रोटीन अन्य अणुओं के साथ शारीरिक रूप से बातचीत करके अपने कार्यों में मध्यस्थता करते हैं। प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन (पीपीआई) सेलुलर कार्यों की मध्यस्थता के लिए महत्वपूर्ण हैं, जैसे सिग्नल ट्रांसडक्शन की मध्यस्थता, पर्यावरण को महसूस करना, ऊर्जा को भौतिक आंदोलन में परिवर्तित करना, चयापचय और सिग्नलिंग एंजाइमों की गतिविधि को विनियमित करना और सेलुलर संगठन को बनाए रखना1. इस प्रकार, पीपीआई का उपयोग अज्ञात कार्यों को स्पष्ट करने के लिए किया जा सकताहै 2. पीपीआई का पता लगाने के तरीकों को तीन प्रकारों में वर्गीकृत किया जा सकता है: इन विट्रो में, विवो में और सिलिको में। सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन (सह-आईपी), आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी, अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि, प्रोटीन सरणियों, फेज प्रदर्शन, प्रोटीन टुकड़ा पूरकता, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, और परमाणु चुंबकीय अनुनाद स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग इन विट्रो पीपीआई डिटेक्शन3 के लिए किया गया है। इन विधियों में, सह-आईपी का व्यापक रूप से इसकी सादगी के कारण उपयोग किया जाता है।

फ्यूजन टैग FLAG में आठ अमीनो एसिड (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK) होते हैं, जिसमें एंटरोकाइनेज क्लीवेज साइट भी शामिल है, और इसे विशेष रूप से इम्यूनोफिनिटी क्रोमैटोग्राफी4 के लिए डिज़ाइन किया गया था। DYKDDDK-टैग किए गए प्रोटीन को एंटी-DYKDDDDK एंटीबॉडी का उपयोग करके पहचाना और कैप्चर किया जाता है। इसलिए, उन्हें एक सरल तरीके से विशिष्ट प्रोटीन के लिए उनके बंधन की पुष्टि करने के लिए DYKDDK बाइंडिंग अगारोज मोती5 का उपयोग करके कुशलता से नीचे खींच लिया जाता है। इम्यूनोप्रिपिटेशन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में किया जा सकता है, और ब्याज की प्रोटीन के खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग करके पीपीआई की एक विस्तृत श्रृंखला की पुष्टि की जा सकती है। एंटी-DYKDDK agarose मोतियों के साथ इम्यूनोप्रिपिटेशन और पेप्टाइड क्षालनपहले 5 रिपोर्ट किया गया है।

यहां, हम एक सरल इम्यूनोप्रिपिटेशन विधि प्रदान करते हैं जिसमें एक प्लास्मिड एन्कोडिंग एक DYKDDK-टैग प्रोटीन को ब्याज के दो प्रोटीनों के सहयोग की पुष्टि करने के लिए HEK-293 कोशिकाओं में क्षणिक रूप से पेश किया जाता है। कुछ DYKDDDK एंटीबॉडी फ्यूजन प्रोटीन के एन-टर्मिनस और सी-टर्मिनस दोनों से बंध सकते हैं लेकिन अन्य नहीं6. इसलिए, भ्रम से बचने के लिए, एंटीबॉडी जो एन- और सी-टर्मिनस दोनों से जुड़े टैग को पहचानता है, को चुना जाना चाहिए। एपिटोप टैग डालते समय, एपिटोप टैग और लक्ष्य प्रोटीन के बीच 3 से 12 बेस जोड़े डालकर प्रोटीन में रचनात्मक परिवर्तनों से बचना संभव हो सकता है। हालांकि, डाला अनुक्रम frameshift से बचने के लिए 3 के गुणकों में एक आधार जोड़ी होना चाहिए.

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Protocol

चित्रा 1 प्रोटोकॉल का एक सिंहावलोकन प्रस्तुत करता है.

1. समाधान और बफ़र्स की तैयारी

  1. प्रोटीन लाइसिस बफर: पहले प्रकाशित रिपोर्ट7 (तालिका 1)के बाद प्रोटीन लाइसिस बफर तैयार करें।
  2. प्रोटीन लाइसिस बफर + प्रोटीज अवरोधक (पीआई): उपरोक्त तैयार बफर (चरण 1.1) में प्रोटीज अवरोधक ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  3. नमूना बफर: 4x लेमली नमूना बफर के 900 माइक्रोन ( सामग्री की तालिकादेखें) और 2-मर्काप्टोथेनॉल के 100 माइक्रोन मिलाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  4. पॉलीऑक्सीएथिलीन (20) सॉर्बिटन मोनोलॉरेट (पीबीएस-पी) के साथ फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस): पीबीएस के 1.998 एल और पॉलीऑक्सीएथिलीन के 2 एमएल (20) सॉर्बिटन मोनोलॉरेट ( सामग्री की तालिकादेखें) मिलाएं। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  5. 1x ट्रिस/ग्लाइसिन/एसडीएस बफर: डीडीडब्ल्यू के 450 एमएल और 10x ट्रिस/ग्लाइसिन/एसडीएस के 50 एमएल मिलाएं। उपयोग के दिन कमरे के तापमान पर तैयार करें।

2. प्लास्मिड अभिकर्मक

  1. कल्चर HEK-293 कोशिकाओं को 10 सेमी कोलेजन-लेपित डिश में सबकॉन्फ्लुएंस (80% -95%) का उपयोग करके Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम का उपयोग करके जिसमें 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (10,000 इकाइयां/एमएल पेनिसिलिन जी और 10,000 μg/mL स्ट्रेप्टोमाइसिन) ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  2. प्लाज्मिड7 के 1-10 μg पकवान प्रति ट्रांसफ़ेक्ट किया जा करने के लिए तैयार करें और एक अभिकर्मक मिश्रण बनाते हैं. पकवान प्रति 250 माइक्रोन की एक अंतिम मात्रा के लिए 150 मिमी NaCl जोड़ें. भंवर और मिश्रण को नीचे स्पिन करें।
  3. प्रति डिश 1 मिलीग्राम/एमएल पॉलीइथाइलेनिमाइन (पीईआई, सामग्री की तालिकादेखें) के 60 माइक्रोन जोड़ें, इसके बाद पीईआई समाधान के 250 माइक्रोन की अंतिम मात्रा में 150 एमएम एनसीएल जोड़ें।
  4. एक मिश्रित समाधान बनाने के लिए अभिकर्मक मिश्रण करने के लिए पीईआई समाधान जोड़ें. तुरंत भंवर (3-5 एस के लिए शीर्ष गति पर, उसके बाद भी ऐसा ही करें) और नीचे स्पिन करें।
  5. 15-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं. इस समय के दौरान, HEK-293 कोशिकाओं के माध्यम को बदलें।
  6. HEK-293 कोशिकाओं के पकवान पर मिश्रित समाधान के 500 माइक्रोन/डिश छिड़कें और रात भर (13-14 एच) इनक्यूबेट करें।
  7. अगले दिन मध्यम विनिमय करें।

3. सेल lysis और नमूना तैयारी

नोट: प्रोटीन गिरावट से बचने के लिए, बाद के चरणों को जितना संभव हो उतना नमूना के संरक्षण या फ्रीज-पिघलना के बिना किया जाना चाहिए।

  1. अभिकर्मक के लगभग 48 घंटे बाद, कोशिकाओं को बर्फ-ठंडे पीबीएस के साथ तीन बार धोएं, प्रोटीन लाइसिस बफर + पीआई के 500 माइक्रोन/डिश जोड़ें, और सेल खुरचनी और बर्फ पर कम प्रोटीन सोखना के साथ एक ट्यूब में एक विंदुक द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा करें।
  2. भंवर हर 5 मिनट और 10 मिनट के लिए बर्फ पर नमूने सेते हैं.
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,400 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और यह कम प्रोटीन सोखना के साथ एक ताजा 1.5 एमएल ट्यूब में हस्तांतरण. नमूने -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रोटीन एकाग्रता माप किट के साथ नमूनों की प्रोटीन एकाग्रता निर्धारित करें ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  5. प्रत्येक नमूने में प्रोटीन की समान मात्रा के 200-1000 माइक्रोग्राम को अलग करें, फिर कुल मात्रा को 500-1000 माइक्रोन में समायोजित करने के लिए प्रोटीन लाइसिस बफर + पीआई जोड़ें।
    नोट: बर्फ पर निम्नलिखित कदम उठाए जाते हैं।

4. घोल तैयार करना

नोट: प्रोटीन जी जेल और एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल का 1: 1 घोल तैयार करें जो एक दिन पहले या इम्यूनोप्रिपिटेशन के दिन हो।

  1. एक प्रोटीन जी जेल की तैयारी
    1. अंत कट ऑफ के साथ एक टिप का उपयोग करके, अच्छी तरह मिलाएं और फिर प्रोटीन जी जेल ( सामग्री की तालिकादेखें) को अलग करें ताकि प्रति नमूना मोतियों के 20 माइक्रोन तैयार किए जाएं।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोती रखें। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    3. चरण 4.1.2 में तैयार प्रोटीन जी जेल में प्रोटीन लाइसिस बफर + पीआई के 1 एमएल जोड़ें और टैप और इनवर्टिंग द्वारा मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोतियों को रखें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. चरण 4.1.3 को तीन बार दोहराएं।
    5. 1: 1 प्रोटीन जी जेल घोल बनाने के लिए प्रोटीन जी जेल में प्रोटीन लाइसिस बफर की बराबर मात्रा जोड़ें। प्रोटीन जी जेल घोल लगभग 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  2. एक एपिटोप टैग आत्मीयता जेल की तैयारी
    1. अंत कट ऑफ के साथ एक टिप का उपयोग करना, अच्छी तरह से आंदोलन करें और फिर एपिटोप टैग आत्मीयता जेल ( सामग्री की तालिकादेखें) को अलग करें जैसे कि नमूना प्रति मोतियों के 10-15 माइक्रोन तैयार किया जाता है।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
    3. चरण 4.2.2 में तैयार एपिटोप टैग आत्मीयता जेल में प्रोटीन लाइसिस बफर + पीआई के 1 एमएल जोड़ें और टैप और इनवर्टिंग द्वारा मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोतियों को रखें, और एक विंदुक के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    4. दोहराएँ कदम 4.2.3 दो बार.
    5. चरण 4.2.4 में तैयार एपिटोप टैग आत्मीयता जेल में 0.1 एम ग्लाइसिन (पीएच 3.5) के 500 माइक्रोन जोड़ें और टैप और इनवर्टिंग द्वारा मिलाएं। यह कदम मुक्त एपिटोप टैग एंटीबॉडी को हटाने के लिए किया जाता है। ग्लाइसिन के अलावा 20 मिनट के भीतर, 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोतियों को रखें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    6. चरण 4.2.5 में तैयार एपिटोप टैग आत्मीयता जेल में प्रोटीन लाइसिस बफर + पीआई के 500 माइक्रोन जोड़ें और टैप और इनवर्टिंग द्वारा मिलाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोतियों को रखें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
    7. चरण 4.2.6 को तीन बार दोहराएं।
    8. 1: 1 एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल तैयार करने के लिए एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल में प्रोटीन लाइसिस बफर की एक समान मात्रा जोड़ें। एपिटोप टैग आत्मीयता जेल घोल लगभग 1 दिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

5. प्रोटीन जी जेल के साथ प्रीक्लियरिंग और एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल के साथ प्रोटीन कॉम्प्लेक्स को कैप्चर करना

  1. मिक्स 1: 1 प्रोटीन जी घोल (चरण 4 में तैयार) एक कट टिप के साथ फिट एक विंदुक के साथ और नमूना करने के लिए एक समय में 40 माइक्रोन जोड़ें.
  2. एक प्रशीतित कक्ष (4 डिग्री सेल्सियस) में लगभग 30 एस प्रति चक्र में एक रोटेटर ( सामग्री की तालिकादेखें) पर 1 घंटे के लिए नमूना घुमाएं।
  3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 एस के लिए 12,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए 1 मिन के लिए बर्फ पर मोती रखें।
  4. सतह पर तैरनेवाला लीजिए और यह कम प्रोटीन सोखना के साथ एक नया 1.5 एमएल ट्यूब में हस्तांतरण.
  5. चरण 5.4 में नमूने से इनपुट के लिए नमूना अलग करें और इसे एक नई 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
  6. नमूने में 1:1 एपिटोप टैग जेल घोल के 20-30 माइक्रोन जोड़ें।
  7. 2 घंटे के लिए एक प्रशीतित कक्ष (4 डिग्री सेल्सियस) में लगभग 30 एस प्रति चक्र के लिए एक रोटेटर पर घुमाएँ।
  8. इसे 4x तक पतला करने के लिए चरण 5.5 में तैयार इनपुट में नमूना बफर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर गरम करें। इनपुट -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: ठंड और विगलन के कारण प्रोटीन गिरावट की संभावना के कारण, बाद के चरणों को जितना संभव हो उतना प्रोटीन को संरक्षित किए बिना किया जाना चाहिए।

6. अवक्षेपित प्रोटीन को धोना और एल्यूट करना

  1. हीट ब्लॉक का तापमान 98 डिग्री सेल्सियस पर सेट करें।
  2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और मोतियों को बंद करने की अनुमति देने के लिए बर्फ पर 1 मिनट तक प्रतीक्षा करें। एक विंदुक का उपयोग सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. प्रोटीन lysis बफर + पीआई के 1 एमएल जोड़ें और दोहन और पलटा द्वारा मिश्रण. 5 मिनट के लिए एक प्रशीतित कक्ष (4 डिग्री सेल्सियस) में लगभग 30 एस प्रति चक्र के लिए एक रोटेटर पर घुमाएँ। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र, बर्फ पर 1 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें ताकि मोती को बंद करने की अनुमति मिल सके, और सतह पर तैरनेवाला त्याग दिया जा सके।
  4. दोहराएँ कदम 6.3 5-10 बार.
  5. चरण 6.4 में तैयार नमूने में नमूना बफर के 10 माइक्रोन जोड़ें। 10 मिनट के लिए 98 डिग्री सेल्सियस पर उबाल लें।
  6. 30 एस के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र।
  7. कम प्रोटीन सोखना के साथ एक नई ट्यूब में एक स्तंभ प्लेस और एक कट टिप के साथ एक विंदुक का उपयोग कर स्तंभ के लिए जेल हस्तांतरण. जेल के संदूषण से बचने के लिए एक कॉलम का उपयोग किया जाता है।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट के लिए 9,730 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र। प्रवाह के माध्यम से लीजिए. नमूना -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
    नोट: यदि नमूना गिरावट एक चिंता का विषय है, तो निम्नलिखित इम्यूनोब्लॉटिंग ठंड के बिना किया जाना चाहिए।

7. इम्यूनोब्लोटिंग

नोट: इम्यूनोब्लॉटिंग प्रक्रियाएं पिछलीरिपोर्ट7,8पर आधारित हैं।

  1. सोडियम डोडेसिल-सल्फेट पॉलीक्रिलामाइड जेल (एसडीएस-पेज, सामग्री की तालिकादेखें) पर पूरे नमूने लोड करें।
    नोट: यदि आवश्यक हो, तो बड़े-अच्छी तरह से जैल का उपयोग करें ताकि पूरे नमूने को स्थानांतरित किया जा सके। 50 माइक्रोन कुओं के साथ जैल यहां इस्तेमाल किया गया था।
  2. वैद्युतकणसंचलन कक्ष में जैल सेट करें और जैल के चारों ओर उचित मात्रा तक 1x ट्रिस/ग्लाइसिन/एसडीएस बफर ( सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें।
  3. 100 वी और 400 एमए पर वैद्युतकीय जैल।
  4. पॉलीविनाइलिडीन फ्लोराइड (पीवीडीएफ, सामग्री की तालिकादेखें) झिल्ली पर स्थानांतरण।
  5. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए पीबीएस-पी में 5% स्किम दूध के साथ पीवीडीएफ झिल्ली के धब्बों को ब्लॉक करें।
  6. 5 मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक प्रकार के बरतन पर पीबीएस-पी के साथ झिल्ली तीन बार धो लें. धोने के बाद भी यही प्रक्रिया करें।
  7. 4 डिग्री सेल्सियस पर प्राथमिक एंटीबॉडी ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ एक प्रकार के बरतन पर रात भर सेते हैं.
  8. अगले दिन पीबीएस-पी के साथ झिल्ली तीन बार धो लें।
  9. कमरे के तापमान पर एक प्रकार के बरतन पर माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ 1 घंटे के लिए सेते हैं.
    नोट: यदि लक्ष्य प्रोटीन का आणविक भार आईजीजी भारी श्रृंखला के करीब है, जिसमें लगभग 50 केडीए का आणविक भार है, तो आईजीजी भारी श्रृंखला के साथ लक्ष्य बैंड के ओवरलैप से बचने के लिए एक हल्की श्रृंखला-विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है। इस अध्ययन ने आईपी डिटेक्शन अभिकर्मक के रूप में प्रकाश-श्रृंखला-विशिष्ट एंटीबॉडी7 या वेरिब्लोट का उपयोग किया ( सामग्री की तालिकादेखें)।
  10. पेरोक्सीडेज ल्यूमिनसेंट सब्सट्रेट के साथ प्रोटीन के बैंड की पहचान करें। झिल्ली पीबीएस में बचाया जा सकता है पीबीएस के साथ यह दो बार धोने के बाद.
  11. एक अलग करना समाधान के साथ 10 मिनट के लिए पट्टी ( सामग्री की तालिकादेखें).
  12. पीबीएस-पी में 5% मलाई रहित दूध के साथ तीन बार धो लें और ब्लॉक करें। इसके बाद प्रोटोकॉल चरण 7.6 के बाद के समान है।

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Representative Results

थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स, जिसे ब्राउन और बेज एडिपोसाइट्स के रूप में भी जाना जाता है, में संभावित मोटापा विरोधी और एंटी-ग्लूकोज असहिष्णुता प्रभाव होता है। पीआर (PRD1-BF1-RIZ1 homologous) डोमेन युक्त 16 (PRDM16) थर्मोजेनिक adipocyte पहचान 9,10 निर्धारित करने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है कि एक प्रतिलेखन कोफ़ेक्टर है.

EHMT1 (यूक्रोमैटिक हिस्टोन-लाइसिन एन-मिथाइलट्रांसफेरेज़ 1), जिसे जीएलपी के रूप में भी जाना जाता है, मुख्य रूप से कोफ़ेक्टर एस-एडेनोसिल मेथियोनीन 11 का उपयोग करके हिस्टोन एच 3 (एच 3 के 9) के लाइसिन 9 के मोनो- और डाइमिथाइलेशन को उत्प्रेरित करता है। एक पिछली रिपोर्ट ने संकेत दिया कि ईएचएमटी 1 पीआरडीएम 16 कॉम्प्लेक्स में एक आवश्यक मिथाइलट्रांसफेरेज़ है जो हिस्टोन मिथाइलेशन 12,13के माध्यम से थर्मोजेनिक वसा सेल भाग्य को नियंत्रित करता है। इसके अलावा, हमने पहले बताया है कि पीआरडीएम16 और ईएचएमटी1 के अभिव्यक्ति स्तर मानव पेरिरेनल ब्राउन वसा ऊतक (बीएटी) में थर्मोजेनिक जीन के साथ काफी सहसंबद्ध हैं, यह सुझाव देते हुए कि पीआरडीएम16 और ईएचएमटी1 दोनों मानवबैट विकास 8में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।

पीपीआई की पुष्टि के लिए एक विधि के रूप में इस प्रोटोकॉल की दक्षता का प्रदर्शन करने के लिए, हमने उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके DYKDDK-PRDM16 और HA-EHMT1 को HEK-293 कोशिकाओं में ट्रांसफ़ेक्ट किया और DYKDDDDK-PRDM16 को इम्यूनोप्रेसिपिटेट किया। DYKDDK-टैग किए गए PRDM16 और HA-टैग किए गए EHMT1 को स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर pcDNA3.1 ( सामग्री की तालिकादेखें) की क्लोनिंग साइटों में डाला गया था। इम्यूनोब्लोटिंग ने DYKDDK-PRDM16 और HA-EHMT16 और HA-EHMT1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किए गए समूहों में DYKDDK-PRDM16 और HA-EHMT1 के बीच संबंध की पुष्टि की।

Figure 1
चित्रा 1: सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध यहाँ दिखाया गया है. दाईं ओर प्रोटोकॉल का वर्कफ़्लो दिखाता है; बाईं ओर प्रतिक्रियाओं का चित्रमय प्रतिनिधित्व दिखाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: PRDM16 EHMT1 के साथ संबद्ध है। HEK-293 कोशिकाओं को वेक्टर (नकारात्मक नियंत्रण), DYKDDK-PRDM16, या DYKDDK-PRDM16 और HA-EHMT1 के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। सह-इम्यूनोप्रिपिटेशन बाद में एक DYKDDDK टैग एफ़िनिटी जेल का उपयोग करके किया गया था, इसके बाद इम्यूनोब्लोटिंग किया गया था। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

प्रोटीन lysis बफर 250 एमएल (0.22 माइक्रोन निस्पंदन, 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर)
मिलिलिटर अंतिम एकाग्रता
1 एम ट्रिस पीएच 8.0 12.5 50 मिमी
5 एम एनसीएल 7.5 150 मिमी
0.5 एम एथिलीनडायमिनेटेट्राएसेटिक एसिड 0.5 1 मिमी
ग्लिसरॉल 25 10%
पॉलीऑक्सीएथिलीन (10) ऑक्टाइलफेनिल ईथर 2.5 1%
डीडीडब्ल्यू 202
कुल 250

तालिका 1: प्रोटीन लाइसिस बफर की संरचना।

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Discussion

यह प्रोटोकॉल लगभग पहले से रिपोर्ट किए गए प्रोटोकॉल 5,7,14,15 की तरह है। इस प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण बिंदु यह है कि हम सेल लसीका कदम से इम्यूनोप्रिपिटेशन कदम तक प्रयोग को कभी नहीं रोकते हैं। प्रोटीन का क्षरण पीपीआई का पता लगाने में बाधा डालता है। विस्तारित समय पाठ्यक्रम और बार-बार फ्रीज-पिघलना चक्र प्रोटीन को नीचा दिखाते हैं। एसडीएस-पेज में वैद्युतकणसंचलन भी इम्यूनोप्रिपिटेशन के उसी दिन किया जाना चाहिए ताकि न केवल प्रोटीन गिरावट को कम किया जा सके बल्कि पीपीआई का पता लगाने को अधिकतम किया जा सके।

थर्मोजेनिक एडिपोसाइट्स में, ईएचएमटी 1 और पीआरडीएम 16 के बीच बातचीत पिछले अध्ययन13 में बताई गई थी। EHMT1 - PRDM16 परिसर भूरे रंग के adipocyte सेल भाग्य और thermogenesis13 को नियंत्रित करता है. EHMT1 PRDM16 की बातचीत को बाधित करके PRDM16 को स्थिर बनाता है - अमाइलॉइड प्रोटीन-बाइंडिंग प्रोटीन (APPBP) 216। यह PRDM16 स्थिरीकरण कलिन (CUL) 2-APPBP2 और EHMT116 द्वारा नियंत्रित किया जाता है।

इस अध्ययन में, HEK-293 कोशिकाओं का उपयोग किया गया क्योंकि HEK-293 कोशिकाओं का व्यापक रूप से पुनः संयोजक प्रोटीन17 के उत्पादन में उपयोग किया जाता है। अन्य सेल लाइनें जो प्लास्मिड के साथ ट्रांसफ़ेक्ट करना आसान हैं, का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि कॉस -7 कोशिकाएं और हेला कोशिकाएं। पीईआई अभिकर्मक के लिए इस्तेमाल किया गया था क्योंकि पीईआई पारंपरिक लिपोफेक्शन की तुलना में अधिक किफायती और सरल है।

प्रीक्लियरिंग, एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल में रोटेशन, और धुलाई इस विधि में विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम हैं। प्रीक्लियरिंग उन प्रोटीनों को हटा सकता है जो गैर-विशिष्ट रूप से जेल से बांधते हैं। इसके अलावा, एपिटोप टैग एफ़िनिटी जेल के साथ रोटेशन का समय महत्वपूर्ण है क्योंकि अत्यधिक समय के परिणामस्वरूप निरर्थक प्रोटीन का पता लगाया जा सकता है, और अपर्याप्त समय लक्ष्य प्रोटीन का पता लगाने में बाधा डाल सकता है।

निम्नलिखित बिंदुओं पर ध्यान दिया जाना चाहिए। HEK-293 कोशिकाएं आसानी से अलग हो जाती हैं; इसलिए, नमूने तैयार करते समय कोलेजन-लेपित व्यंजनों का उपयोग किया जाना चाहिए। पीईआई समाधान साइटोटोक्सिक है; इसलिए, माध्यम एक लंबे समय तक अवधि के लिए कोशिकाओं को छोड़ने के बिना अभिकर्मक के बाद प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए. यदि पीपीआई नहीं देखा जाता है, तो ट्रांसफ़ेक्ट प्लास्मिड की मात्रा अपर्याप्त हो सकती है और/या आईपी में लाए गए प्रोटीन की मात्रा कम हो सकती है। इसके अलावा, यदि वॉश की संख्या अत्यधिक है, तो बातचीत को याद किया जा सकता है। इन्हें संबोधित करने के लिए, निम्नलिखित पर विचार किया जा सकता है: HEK-293 कोशिकाओं में पेश किए गए प्लास्मिड की मात्रा में वृद्धि, आईपी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन की मात्रा में वृद्धि और वॉश की संख्या को कम करना। इसके अलावा, यदि अंतिम धोने में बहुत अधिक सतह पर तैरनेवाला छोड़ दिया जाता है, तो यह सोडियम डोडेसिल सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल के कुओं से बह निकलेगा। यदि निरर्थक बैंड देखे जाते हैं, तो आईपी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड/प्रोटीन की मात्रा बहुत अधिक हो सकती है, या वॉश की संख्या या तीव्रता अपर्याप्त हो सकती है। इन्हें आईपी के लिए उपयोग किए जाने वाले प्लास्मिड/प्रोटीन की मात्रा को कम करके, वॉश की संख्या में वृद्धि करके, या वाशिंग बफर में नमक की एकाग्रता को बढ़ाकर धोने की शक्ति बढ़ाकर संबोधित किया जा सकता है।

आमतौर पर इस्तेमाल किया डिटर्जेंट जैसे पॉलीऑक्सीएथिलीन (10) ऑक्टाइलफेनिल ईथर कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण पीपीआई18 को बाधित कर सकता है। हल्के डिटर्जेंट कार्यात्मक रूप से महत्वपूर्ण परिसरों की वसूली को बढ़ा सकते हैं, जबकि वे अपूर्ण घुलनशीलता के कारण निरर्थक इंटरैक्शन का अस्वीकार्य स्तर प्राप्त कर सकते हैं। वर्तमान अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले प्रोटीन लाइसिस बफर में 1% पॉलीऑक्सीएथिलीन (10) ऑक्टाइलफेनिल ईथर होता है। यह बफर साइटोप्लाज्मिक प्रोटीन को ट्रांसफ़ेक्ट प्लास्मिड द्वारा अतिरंजित प्रोटीन की उच्च मात्रा के साथ लाइज़ करता है। जब नाभिक और साइटोप्लाज्म को अलग करके तैयार किए गए नमूनों पर इम्यूनोप्रिपिटेशन किया जाता है, तो पूरे सेल लसीका द्वारा तैयार नमूनों की तुलना में पृष्ठभूमि कम हो जाती है, और स्पष्ट लक्ष्य बैंड17की पहचान की जा सकती है। यदि नाभिक में प्रोटीन के साथ इम्यूनोप्रिपिटेशन किया जाता है, तो परमाणु प्रोटीन को एक वाणिज्यिक परमाणु निष्कर्षण किट का उपयोग करके या डिटर्जेंट युक्त कम नमक बफर के साथ साइटोप्लाज्म को नष्ट करने और हटाने और बाद में उच्च नमकबफर 19 के साथ परमाणु प्रोटीन निकालने से निकाला जा सकता है। इम्यूनोब्लॉटिंग में विकास के समय को न केवल पृष्ठभूमि से बचने के लिए बल्कि कुछ बैंडों का पता लगाने के लिए भी समायोजित किया जाना चाहिए।

इस पद्धति की कई सीमाएँ थीं। सबसे पहले, हमने एक पीपीआई का उपयोग किया जिसका पता लगाने की अत्यधिक उम्मीद है। दूसरा, क्योंकि प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति प्लास्मिड के संयोजन पर निर्भर करती है, अपर्याप्त प्रोटीन प्राप्त किया जा सकता है, और इसलिए, बातचीत का पता नहीं लगाया जा सकता है।

संक्षेप में, इस पद्धति का उपयोग करके, पीपीआई को मास स्पेक्ट्रोमेट्री की तुलना में आर्थिक रूप से और आसानी से पुष्टि की जा सकती है। विभिन्न एपिटोप टैग फ्यूज्ड प्रोटीन के बीच पीपीआई की पुष्टि एपिटोप टैग एफिनिटी जेल के बजाय प्रत्येक टैग के खिलाफ एफिनिटी एंटीबॉडी का उपयोग करके भी की जा सकती है। इसी तरह के इम्यूनोप्रिपिटेशन विधियों को अन्य सेल प्रकारों में DYKDDDDK टैग से जुड़े किसी भी प्रोटीन को व्यक्त करने वाले प्लास्मिड को पेश करके किया जा सकता है। इसके अलावा, एक एपिटोप टैग आत्मीयता जेल के बजाय अंतर्जात एंटीबॉडी का उपयोग करना विभिन्न सेल प्रकारों में अंतर्जात पीपीआई की पुष्टि करना संभव बनाता है।

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Disclosures

हम घोषणा करते हैं कि लेखकों में से किसी के पास इस अध्ययन से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस काम को जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (JSPS) KAKENHI ग्रांट नंबर 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI ग्रांट नंबर 22K08672 (H.O.), जापान डायबिटीज सोसाइटी रिसर्च ग्रांट फॉर यंग इन्वेस्टिगेटर्स (G.N.), और MSD लाइफ साइंस फाउंडेशन रिसर्च ग्रांट फॉर यंग इन्वेस्टिगेटर्स (G.N.) द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA (pH8.0) Nippon gene 311-90075
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL Biorad 4561034
10x Tris/Glycine/SDS Biorad 1610772
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel Sigma A2220
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep GE Healthcare NA931-1ML
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey GE Healthcare NA934-1ML
Cell Scraper M Sumitomo Bakelite MS-93170
Collagen I Coat Dish 100 mm IWAKI 4020-010
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 4693132001
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement Invitrogen 10565042
D-PBS (-) FUJIFILM Wako 045-29795
Glycerol FUJIFILM Wako 072-00626
Glycine FUJIFILM Wako 077-00735
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 Cell Signaling C29F4
Laemmli Sample buffer Bio-Rad Laboratories 161-0747
Micro Bio-Spin Chromatography Columns Biorad 7326204
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels Biorad 1658004JA
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse Sigma F3165
NaCl FUJIFILM Wako 191-01665
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 This paper N/A
pcDNA3.1-HA-EHMT1 This paper N/A
pcDNA3.1-vector This paper N/A
PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride PSI 24765
Penicillin-streptomycin solution FUJIFILM Wako 168-23191
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo scientific 23227
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether FUJIFILM Wako 168-11805
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako 167-11515
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs Cytiva 17061801
Protein LoBind Tubes eppendorf 30108442
ROTATOR RT-5 TAITEC RT-5
skim milk Morinaga 0652842 
Stripping Solution FUJIFILM Wako 193-16375
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack Biorad 1704156B03
Trans-Blot Turbo System Biorad N/A
Trizma base Sigma T1503-1KG
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) HyClone SH30910.03
Veriblot Abcam ab131366
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 Cell Signaling 4970S

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References

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प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एंटी-एपिटोप टैग एफिनिटी जेल के साथ इम्यूनोप्रिपिटेशन
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Shinjo, H., Nagano, G., Ishii, S., Himeno, N., Yamamoto, Y., Sagawa, J., Baba, R., Egusa, G., Hattori, N., Ohno, H. Immunoprecipitation with an Anti-Epitope Tag Affinity Gel to Study Protein-Protein Interactions. J. Vis. Exp. (203), e66085, doi:10.3791/66085 (2024).

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