Summary
蛋白质-蛋白质相互作用对于阐明靶蛋白的功能非常重要，免疫共沉淀 （co-IP） 可以很容易地确认 PPI。我们将编码表位标记蛋白的质粒瞬时转染到 HEK-293 细胞中，并开发了一种免疫沉淀方法，以轻松确认两种靶蛋白的结合。
Abstract
蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 在细胞组织、细胞内信号转导和转录调控等生物现象中起着关键作用。因此，了解PPIs是进一步研究靶蛋白功能的重要起点。在这项研究中，我们提出了一种简单的方法来确定两种靶蛋白的结合，方法是使用聚乙烯亚胺方法将哺乳动物表达载体引入 HEK-293 细胞中，在自制的蛋白质裂解缓冲液中裂解细胞，并将目标蛋白拉下表位标签亲和凝胶上。此外，可以使用针对每个标签的亲和抗体而不是表位标签亲和凝胶来确认各种表位标签融合蛋白之间的PPI。该协议还可用于验证来自其他细胞系的各种PPI，包括核提取物。因此，它可以作为各种PPI实验中的基本方法。蛋白质通过延长的时间进程和反复的冻融循环来降解。因此，细胞裂解、免疫沉淀和免疫印迹应尽可能无缝地进行。
Introduction
蛋白质在所有细胞功能中起着重要作用，包括信息处理、新陈代谢、运输、决策和结构组织。蛋白质通过与其他分子的物理相互作用来介导其功能。蛋白质-蛋白质相互作用 （PPI） 对于介导细胞功能很重要，例如介导信号转导、感知环境、将能量转化为物理运动、调节代谢和信号酶的活动以及维持细胞组织1。因此，PPI 可用于阐明未知功能2。PPIs的检测方法可分为 体外、 体内和 计算机三种类型。免疫共沉淀 （co-IP）、亲和色谱、串联亲和纯化、蛋白质阵列、噬菌体展示、蛋白质片段互补、X 射线晶体学和核磁共振波谱已用于 体外 PPI 检测3。在这些方法中，co-IP因其简单性而被广泛使用。
融合标签 FLAG 由八个氨基酸 （AspTyrLysAspAspAspAspLys： DYKDDDDK） 组成，包括一个肠激酶切割位点，专为免疫亲和色谱4 而设计。使用抗 DYKDDDDK 抗体识别和捕获带 DYKDDDDK 标签的蛋白质。因此，使用 DYKDDDDK 结合琼脂糖珠5 有效地拉低它们，以简单的方式确认它们与特定蛋白质的结合。免疫沉淀可以在多种细胞中进行，并且可以使用针对目标蛋白的抗体来确认各种 PPI。免疫沉淀和用抗 DYKDDDDK 琼脂糖微球洗脱肽已有先前的报道5.
在这里，我们提供了一种简单的免疫沉淀方法，其中将编码 DYKDDDDK 标记的蛋白质的质粒瞬时引入 HEK-293 细胞中，以确认两种目标蛋白质的关联。某些 DYKDDDDK 抗体可以与融合蛋白的 N 端和 C 端结合，但不能与其他6 结合。因此，为避免混淆，应选择能够识别融合到 N 端和 C 端的标签的抗体。插入表位标签时，可以通过在表位标签和靶蛋白之间插入 3 至 12 个碱基对来避免蛋白质的构象变化。但是，插入的序列应该是 3 的倍数的碱基对，以避免帧偏移。
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Protocol
图 1 显示了该协议的概述。
1. 溶液和缓冲液的制备
- 蛋白裂解缓冲液：按照先前发表的报告7 （表1）制备蛋白裂解缓冲液。
- 蛋白裂解缓冲液+蛋白酶抑制剂（PI）：将蛋白酶抑制剂（见 材料表）加入上述制备的缓冲液（步骤1.1）中。储存在-20°C。
- 样品缓冲液：混合 900 μL 4x Laemmli 样品缓冲液（参见 材料表）和 100 μL 2-巯基乙醇。储存在-20°C。
- 磷酸盐缓冲盐水 （PBS） 与聚氧乙烯 （20） 脱水山梨糖醇单月桂酸酯 （PBS-P）：混合 1.998 L PBS 和 2 mL 聚氧乙烯 （20） 脱水山梨糖醇单月桂酸酯（参见 材料表）。在室温下储存。
- 1x Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液：混合 450 mL DDW 和 50 mL 10x Tris/甘氨酸/SDS。使用当天在室温下准备。
2. 质粒转染
- 使用含有 10% 胎牛血清和 1% 青霉素 - 链霉素（10,000 单位/mL 青霉素 G 和 10,000 μg/mL 链霉素）的 Dulbecco 改良鹰培养基在 10 cm 胶原包被培养皿中培养 HEK-293 细胞至亚汇合 （80%-95%）（参见 材料表）。
- 每个培养皿制备 1-10 μg 要转染的质粒7 并制备转染混合物。加入 150 mM NaCl 至每个培养皿的最终体积为 250 μL。涡旋并旋转混合物。
- 每个培养皿加入 60 μL 1 mg/mL 聚乙烯亚胺 （PEI，参见 材料表），然后加入 150 mM NaCl 至最终体积为 250 μL PEI 溶液。
- 将 PEI 溶液加入转染混合物中，制成混合溶液。立即涡旋（以最高速度 3-5 秒，此后执行相同的操作）并下降。
- 在室温下孵育 15-30 分钟。在此期间，更换HEK-293细胞的培养基。
- 在 HEK-293 细胞培养皿中撒上 500 μL/培养皿的混合溶液，并孵育过夜 （13-14 小时）。
- 第二天进行培养基交换。
3. 细胞裂解和样品制备
注意：为避免蛋白质降解，应尽可能在不保存或冻融样品的情况下执行后续步骤。
- 转染后约 48 小时，用冰冷的 PBS 洗涤细胞三次，加入 500 μL/培养皿的蛋白质裂解缓冲液 + PI，并通过细胞刮刀和移液管将细胞收集在冰上低蛋白吸附的试管中。
- 每 5 分钟涡旋一次，并将样品在冰上孵育 10 分钟。
- 在4°C下以16,400× g 离心10分钟。 收集上清液并将其转移到低蛋白吸附的新鲜 1.5 mL 管中。样品可以储存在-80°C。
- 根据制造商的协议，使用蛋白质浓度测量套件确定样品的蛋白质浓度（参见 材料表）。
- 在每个样品中分离 200-1000 μg 相同量的蛋白质，然后加入蛋白质裂解缓冲液 + PI 以调节总体积至 500-1000 μL。
注意：以下步骤是在冰上执行的。
4.浆料的制备
注：在免疫沉淀前一天或当天制备 1：1 的蛋白 G 凝胶和表位标签亲和凝胶浆液。
- 蛋白质G凝胶的制备
- 使用末端切断的吸头，充分混合，然后分离蛋白质 G 凝胶（参见 材料表），使每个样品制备 20 μL 珠子。
- 在4°C下以12,000× g 离心20秒，并将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平。用移液管弃去上清液。
- 将 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.1.2 制备的蛋白 G 凝胶中，并通过敲击和倒置进行混合。在4°C下以12,000× g 离心20秒，将珠子放在冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
- 重复步骤 4.1.3 三次。
- 向蛋白 G 凝胶中加入等体积的蛋白裂解缓冲液，制成 1：1 的蛋白 G 凝胶浆液。蛋白G凝胶浆液可以在4°C下储存约1天。
- 表位标签亲和凝胶的制备
- 使用末端切断的吸头充分搅拌，然后分离表位标签亲和凝胶（参见 材料表），使每个样品制备 10-15 μL 珠子。
- 在4°C下以5,000× g 离心30秒，并在冰上等待1分钟以使珠子趋于平坦。用移液管弃去上清液。
- 将 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.2.2 中制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置进行混合。在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并用移液管弃去上清液。
- 重复步骤 4.2.3 两次。
- 将 500 μL 0.1 M 甘氨酸 （pH 3.5） 加入到步骤 4.2.4 中制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置混合。执行此步骤以去除游离表位标签抗体。在加入甘氨酸后20分钟内，在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
- 将 500 μL 蛋白裂解缓冲液 + PI 加入步骤 4.2.5 制备的表位标签亲和凝胶中，并通过敲击和倒置混合。在4°C下以5,000× g 离心30秒，将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
- 重复步骤 4.2.6 三次。
- 向表位标签亲和凝胶中加入等体积的蛋白质裂解缓冲液，以制备 1：1 表位标签亲和凝胶浆液。表位标签亲和凝胶浆液可在4°C下储存约1天。
5. 用蛋白 G 凝胶预透明化并使用表位标签亲和凝胶捕获蛋白质复合物
- 将 1：1 蛋白 G 浆液（在步骤 4 中制备）与装有切割吸头的移液管混合，一次向样品中加入 40 μL。
- 在冷藏室（4°C）中，将样品在旋转器（参见 材料表）上旋转1小时，每个周期约30秒。
- 在4°C下以12,000× g 离心20秒，并将珠子置于冰上1分钟以使珠子趋平。
- 收集上清液并将其转移到低蛋白吸附的新 1.5 mL 管中。
- 在步骤 5.4 中将用于输入的样品与样品分离，并将其转移到新的 1.5 mL 管中。
- 向样品中加入 20-30 μL 1：1 表位标签凝胶浆液。
- 在冷藏室（4°C）中每个周期在旋转器上旋转约30秒2小时。
- 将样品缓冲液添加到步骤5.5中制备的输入中，将其稀释至4x，并在98°C下加热10分钟。输入可以存储在 -80 °C 下。
注意：由于冻融可能导致蛋白质降解，因此应在不尽可能保留蛋白质的情况下执行后续步骤。
6. 洗涤和洗脱沉淀的蛋白质
- 将加热块的温度设置为 98 °C。
- 在4°C下以5,000× g 离心30秒，并在冰上等待1分钟以使珠子趋于平坦。用移液管弃去上清液。
- 加入 1 mL 蛋白裂解缓冲液 + PI，通过敲击和倒置进行混合。在冷藏室（4°C）中，每个周期在旋转器上旋转约30秒5分钟。在4°C下以5,000× g 离心30秒，在冰上等待1分钟以使珠子趋平，并弃去上清液。
- 重复步骤 6.3 5-10 次。
- 向步骤 6.4 中制备的样品中加入 10 μL 样品缓冲液。在98°C下煮沸10分钟。
- 在4°C下以5,000× g 离心30秒。
- 将色谱柱置于蛋白质吸附率低的新管中，并使用带有切割尖端的移液管将凝胶转移到色谱柱中。使用色谱柱来避免凝胶污染。
- 在4°C下以9,730× g 离心1分钟。 收集流出物。样品可以储存在-80°C。
注意：如果担心样品降解，则应在不冷冻的情况下进行以下免疫印迹。
7. 免疫印迹
注：免疫印迹程序基于以前的报告 7,8。
- 将整个样品加载到十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE，参见 材料表）上。
注意：如有必要，请使用大孔凝胶，以便可以转移整个样品。此处使用具有 50 μL 孔的凝胶。 - 将凝胶置于电泳室中，并加入1x Tris /甘氨酸/ SDS缓冲液（参见 材料表）至凝胶周围的适当体积。
- 100 V 和 400 mA 的电泳凝胶。
- 转移到聚偏二氟乙烯（PVDF，见 材料表）膜上。
- 在室温下用5%脱脂牛奶在PBS-P中封闭PVDF膜印迹1小时。
- 在振荡器上用PBS-P以最高速度洗涤膜三次，持续5分钟。此后洗涤时执行相同的步骤。
- 在4°C下与一抗（参见 材料表）一起在振荡器上孵育过夜。
- 第二天用PBS-P洗涤膜三次。
- 在室温下将二抗与二抗在振荡器上孵育 1 小时。
注：如果靶蛋白的分子量接近 IgG 重链，其分子量约为 50 kDa，则可以使用轻链特异性二抗来避免靶带与 IgG 重链重叠。本研究使用轻链特异性抗体7 或 Veriblot 作为 IP 检测试剂（参见 材料表）。 - 鉴定具有过氧化物酶发光底物的蛋白质条带。膜用PBS-P洗涤两次后，可保存在PBS中。
- 用剥离溶液剥离 10 分钟（参见 材料表）。
- 洗涤三次，并用 5% 脱脂牛奶在 PBS-P 中块状。此后的协议与步骤 7.6 开始的协议相同。
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Representative Results
生热脂肪细胞，也称为棕色和米色脂肪细胞，具有潜在的抗肥胖和抗葡萄糖不耐受作用。PR （PRD1-BF1-RIZ1 homologous） 结构域 16 （PRDM16） 是一种转录辅因子，在确定产热脂肪细胞身份中起重要作用 9,10。
EHMT1（常染色体组蛋白-赖氨酸 N-甲基转移酶 1），也称为 GLP，主要使用辅因子 S-腺苷甲硫氨酸11 催化组蛋白 H3 （H3K9） 的赖氨酸 9 的单甲基化和二甲基化。先前的一份报告表明，EHMT1 是 PRDM16 复合物中的一种必需甲基转移酶，通过组蛋白甲基化控制产热脂肪细胞的命运12,13。此外，我们之前已经报道过，PRDM16和EHMT1的表达水平与人肾周棕色脂肪组织（BAT）中产热基因的表达水平显著相关，表明PRDM16和EHMT1在人BAT发育中均起重要作用8。
为了证明该协议作为确认 PPI 的方法的有效性，我们将 DYKDDDDK-PRDM16 和 HA-EHMT1 转染到 HEK-293 细胞中，并使用上述方案免疫沉淀 DYKDDDDK-PRDM16。将 DYKDDDDK 标记的 PRDM16 和 HA 标记的 EHMT1 插入哺乳动物表达载体 pcDNA3.1 的克隆位点（参见 材料表）。免疫印迹证实了 DYKDDDDK-PRDM16 和 HA-EHMT1 转染组中 DYKDDDDK-PRDM16 和 HA-EHMT1 之间的关联（图 2）。
图 1：免疫共沉淀的示意图。 此处显示了该协议的示意图。右侧显示协议的工作流程;左侧显示了反应的图形表示。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：PRDM16 与 EHMT1 结合。 HEK-293 细胞用载体（阴性对照）、DYKDDDDK-PRDM16 或 DYKDDDDK-PRDM16 和 HA-EHMT1 转染。随后使用 DYKDDDDK 标签亲和凝胶进行免疫共沉淀，然后进行免疫印迹。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 蛋白质裂解缓冲液250mL（0.22μm过滤，储存在4°C） | ||
| 毫升 | 最终浓度 | |
| 1 M Tris pH 8.0 | 12.5 | 50毫米 |
| 5 M 氯化钠 | 7.5 | 150毫米 |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸 | 0.5 | 1毫米 |
| 甘油 | 25 | 10% |
| 聚氧乙烯（10）辛基苯醚 | 2.5 | 1% |
| DDW型 | 202 | |
| 总 | 250 | |
表1：蛋白质裂解缓冲液的组成。
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Discussion
该协议几乎与先前报告的协议5,7,14,15相似。该协议的重要一点是，我们从未停止从细胞裂解步骤到免疫沉淀步骤的实验。蛋白质降解会阻碍 PPI 检测。延长的时间进程和反复的冻融循环会降解蛋白质。SDS-PAGE中的电泳也应在免疫沉淀的同一天进行，这不仅可以最大限度地减少蛋白质降解，还可以最大限度地提高PPI检测率。
在产热脂肪细胞中，EHMT1 和 PRDM16 之间的相互作用在之前的研究13 中报道。EHMT1 - PRDM16 复合物调节棕色脂肪细胞的命运和产热13。EHMT1 通过中断 PRDM16 - 淀粉样蛋白结合蛋白 （APPBP） 216 的相互作用使 PRDM16 稳定。这种 PRDM16 稳定性受 cullin（CUL） 2-APPBP2 和 EHMT116 的调节。
在这项研究中，使用 HEK-293 细胞是因为 HEK-293 细胞广泛用于重组蛋白的生产17。可以使用其他易于用质粒转染的细胞系，例如 Cos-7 细胞和 Hela 细胞。PEI用于转染，因为与传统的脂质转染相比，PEI更经济、更简单。
预清除、在表位标签亲和凝胶中的旋转和洗涤是该方法中尤为重要的步骤。预透明可以去除与凝胶非特异性结合的蛋白质。此外，使用表位标签亲和凝胶旋转的时间也很重要，因为时间过长可能会导致非特异性蛋白质检测，而时间不足可能会阻碍靶蛋白的检测。
应注意以下几点。HEK-293细胞容易脱落;因此，在制备样品时，应使用胶原蛋白包被的培养皿。PEI溶液具有细胞毒性;因此，转染后应更换培养基，而不能长时间离开细胞。如果未观察到 PPI，则转染质粒的量可能不足和/或带入 IP 的蛋白质量可能较低。此外，如果洗涤次数过多，可能会错过交互。为了解决这些问题，可以考虑以下几点：增加引入 HEK-293 细胞的质粒量，增加用于 IP 的蛋白质量，并减少洗涤次数。此外，如果在最终洗涤中留下过多的上清液，它将从十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶的孔中溢出。如果观察到非特异性条带，则用于 IP 的质粒/蛋白质量可能过高，或者洗涤的次数或强度可能不足。这些问题可以通过减少用于免疫沉淀的质粒/蛋白质量、增加洗涤次数或通过增加洗涤缓冲液中的盐浓度来提高洗涤力来解决。
常用的洗涤剂，如聚氧乙烯 （10） 辛基苯醚可能会破坏功能显着的 PPIs18。较温和的洗涤剂可以提高功能上重要的复合物的回收率，但由于溶解不完全，它们可能会产生不可接受的非特异性相互作用。本研究中使用的蛋白质裂解缓冲液含有 1% 聚氧乙烯 （10） 辛基苯醚。该缓冲液用转染质粒过表达的大量蛋白质裂解细胞质蛋白。当对通过分离细胞核和细胞质制备的样品进行免疫沉淀时，与通过全细胞裂解制备的样品相比，背景会降低，并且可以识别出明确的靶带17。如果对细胞核中的蛋白质进行免疫沉淀，则可以使用商业核提取试剂盒提取核蛋白，或者使用含有去污剂的低盐缓冲液破坏和去除细胞质，然后使用高盐缓冲液19 提取核蛋白。免疫印迹的显影时间不仅应进行调整，以避免背景，还应检测某些条带。
这种方法有几个局限性。首先，我们使用了备受期待的 PPI。其次，由于每个基因的表达都依赖于质粒的组合，因此可能获得的蛋白质不足，因此可能无法检测到相互作用。
总之，与质谱法相比，使用这种方法可以经济且容易地确认PPI。各种表位标签融合蛋白之间的 PPI 也可以通过使用针对每个标签的亲和抗体而不是表位标签亲和凝胶来确认。通过引入表达与DYKDDDDK标签融合的任何蛋白质的质粒，可以在其他细胞类型中进行类似的免疫沉淀方法。此外，使用内源性抗体代替表位标签亲和凝胶可以确认各种细胞类型中的内源性 PPI。
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Disclosures
我们声明，所有作者均未与本研究有任何利益冲突。
Acknowledgments
这项工作得到了日本科学促进会 （JSPS） KAKENHI 资助号 19K18008 （G.N.）、JSPS KAKENHI 资助号 22K16415 （G.N.）、JSPS KAKENHI 资助号 22K08672 （H.O.）、日本糖尿病学会青年研究资助 （G.N.） 和默沙东生命科学基金会青年研究资助 （G.N.） 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
| 10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
| 10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
| ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
| Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
| Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
| Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
| Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
| D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
| Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
| Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
| HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
| Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
| Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
| NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
| pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
| pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
| PEI MAX - Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
| Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
| Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
| Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
| ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
| skim milk | Morinaga | 0652842 | |
| Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
| Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
| Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
| Veriblot | Abcam | ab131366 | |
| β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |
References
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