Generatie en stroomafwaartse analyse van single-cell en single-nuclei transcriptomen in hersenorganoïden
Summary
Hier introduceren we een uitgebreid protocol voor het genereren en stroomafwaarts analyseren van menselijke hersenorganoïden met behulp van single-cell en single-nucleus RNA-sequencing.
Abstract
In het afgelopen decennium is single-cell transcriptomics aanzienlijk geëvolueerd en een standaard laboratoriummethode geworden voor gelijktijdige analyse van genexpressieprofielen van individuele cellen, waardoor cellulaire diversiteit kan worden vastgelegd. Om de beperkingen van moeilijk te isoleren celtypen te overwinnen, kan een alternatieve benadering gericht op het herstellen van enkele kernen in plaats van intacte cellen worden gebruikt voor sequencing, waardoor transcriptoomprofilering van individuele cellen universeel toepasbaar wordt. Deze technieken zijn een hoeksteen geworden in de studie van hersenorganoïden, waardoor ze modellen zijn geworden van het zich ontwikkelende menselijke brein. Door gebruik te maken van het potentieel van single-cell en single-nucleus transcriptomics in hersenorganoïdenonderzoek, presenteert dit protocol een stap-voor-stap handleiding met belangrijke procedures zoals organoïde dissociatie, isolatie van single-cells of kernen, bibliotheekvoorbereiding en sequencing. Door deze alternatieve benaderingen te implementeren, kunnen onderzoekers datasets van hoge kwaliteit verkrijgen, waardoor de identificatie van neuronale en niet-neuronale celtypen, genexpressieprofielen en celafstammingstrajecten mogelijk wordt. Dit vergemakkelijkt uitgebreid onderzoek naar cellulaire processen en moleculaire mechanismen die de ontwikkeling van de hersenen vormgeven.
Introduction
In de afgelopen jaren zijn organoïdetechnologieën naar voren gekomen als een veelbelovend hulpmiddel om orgaanachtige weefsels te kweken 1,2,3. Vooral voor organen die niet goed toegankelijk zijn, zoals het menselijk brein, bieden organoïden de mogelijkheid om inzicht te krijgen in de ontwikkeling en manifestatie van ziekten4. Als zodanig zijn hersenorganoïden op grote schaal gebruikt als een experimenteel model om verschillende menselijke hersenaandoeningen te onderzoeken, waaronder ontwikkelings-, psychiatrische of zelfs neurodegeneratieve ziekten 4,5,6.
Met de komst van single-cell transcriptoomprofileringstechnologieën kunnen primaire menselijke weefsels en complexe in vitro-modellen worden bestudeerd met een ongekend niveau van granulariteit, wat mechanistische inzichten biedt in veranderingen in genexpressie op het niveau van celsubpopulaties in gezondheid en ziekte en informatie geeft over nieuwe vermeende therapeutische doelen 7,8,9. Het organoïdeveld heeft vooruitgang geboekt door gebruik te maken van single-cell transcriptoomprofilering om de cellulaire samenstelling, reproduceerbaarheid en de getrouwheid van hersenorganoïdetechnologieën te beoordelen 10,11,12. Single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) maakte celclassificatie en de identificatie van genetische ontregeling in zieke organoïden mogelijk13,14. Belangrijk is dat het de complexiteit van organoïde weefsels is die de implementatie van technieken noodzakelijk maakt die de profilering van individuele cellen mogelijk maken. Karakterisering van organoïden met behulp van methoden zoals bulktranscriptoomprofilering (bulk-RNA-sequencing) leidt tot gemaskeerde cellulaire heterogeniteit en genexpressieprofielen die gemiddeld worden over alle soorten cellen in het complexe weefsel, waardoor uiteindelijk ons begrip van lopende processen tijdens de ontwikkeling van organoïden in gezondheid en ziekte wordt beperkt 15,16,17. Naarmate scRNA-seq-methoden zich verder ontwikkelen, worden er steeds meer atlassen gemaakt, geïllustreerd door bronnen zoals de Allen Brain Atlas of de Single cell atlas of human brain organoids van Uzquiano et al.18.
Het bereiken van succesvolle scRNA-seq uit hersenorganoïden is afhankelijk van effectieve isolatie en het vastleggen van intacte cellen. Aangezien de dissociatie van hersenorganoïden om individuele cellen te verkrijgen gebaseerd is op enzymatische spijsvertering, kan het genexpressiepatronen beïnvloeden door stress en celbeschadiging te induceren19,20. Daarom is de dissociatie van het weefsel in individuele cellen de meest cruciale stap. Een alternatieve benadering is single-nucleus RNA-sequencing (snRNA-seq), die de enzymvrije extractie van kernen uit zowel vers als bevroren weefsel vergemakkelijkt21,22. De isolatie van kernen uit een weefsel brengt echter andere uitdagingen met zich mee, zoals de verrijking van interessante celtypen en het lage RNA-gehalte van kernen in vergelijking met cellen.
Transcriptoomstudies van hersenorganoïden worden vaak uitgevoerd met behulp van scRNA-seq 10,18,23. De isolatie van afzonderlijke kernen zou echter een orthogonale en aanvullende methode kunnen bieden om het transcriptomische profiel van organoïden te onderzoeken. Hier introduceren we een toolbox voor scRNA- en snRNA-seq voor hersenorganoïden en bespreken we de kritieke punten voor het verkrijgen van sequentiegegevens van de beste kwaliteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transcriptomische analyse van afzonderlijke cellen en afzonderlijke kernen is naar voren gekomen als een cruciaal hulpmiddel voor het begrijpen van genregulerende mechanismen in complexe weefsels. Beide methoden maken transcriptoomstudies van hersenorganoïden mogelijk. Om een algeheel succesvol experiment te garanderen, is de kwaliteit van het uitgangsmateriaal van groot belang. Daarom is het noodzakelijk om de organoïden regelmatig te knippen om de vorming van een necrotische kern te voorkomen26</sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We danken Valeria Fernandez-Vallone voor de originele instructies voor de Miltenyi Neural Dissociation kit. We danken ook het Genomics Technology Platform van het Max Delbrueck Centrum voor het verstrekken van het recept voor de NP40 lysisbuffer en waardevol advies bij het opzetten van dit protocol. We danken ook Margareta Herzog en Alexandra Tschernycheff voor de organisatorische ondersteuning van het lab.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
- Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nat Commun. 6, 8715 (2015).
- Guan, Y., et al. Human hepatic organoids for the analysis of human genetic diseases. JCI Insight. 2 (17), e94954 (2017).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Dang, J., et al. Zika virus depletes neural progenitors in human cerebral organoids through activation of the innate immune receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19 (2), 258-265 (2016).
- Inak, G., et al. Defective metabolic programming impairs early neuronal morphogenesis in neural cultures and an organoid model of Leigh syndrome. Nat Commun. 12 (1), 1929 (2021).
- Karlsson, M., et al. A single-cell type transcriptomics map of human tissues. Sci Adv. 7 (31), eabh2169 (2021).
- Piwecka, M., Rajewsky, N., Rybak-Wolf, A. Single-cell and spatial transcriptomics: deciphering brain complexity in health and disease. Nat Rev Neurol. 19 (6), 346-362 (2023).
- Lim, B., Lin, Y., Navin, N. Advancing cancer research and medicine with single-cell genomics. Cancer Cell. 37 (4), 456-470 (2020).
- Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (51), 15672-15677 (2015).
- Fiorenzano, A., et al. Single-cell transcriptomics captures features of human midbrain development and dopamine neuron diversity in brain organoids. Nat Commun. 13 (1), 3312 (2022).
- Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
- Notaras, M., et al. Schizophrenia is defined by cell-specific neuropathology and multiple neurodevelopmental mechanisms in patient-derived cerebral organoids. Mol Psychiatry. 27 (3), 1416-1434 (2022).
- Rybak-Wolf, A., et al. Modelling viral encephalitis caused by herpes simplex virus 1 infection in cerebral organoids. Nat Microbiol. 8 (7), 1252-1266 (2023).
- Bock, C., et al. The organoid cell atlas. Nat Biotechnol. 39 (1), 13-17 (2021).
- Brazovskaja, A., Treutlein, B., Camp, J. G. High-throughput single-cell transcriptomics on organoids. Cur Opinion Biotechnol. 55, 167-171 (2019).
- Velasco, S., et al. Individual brain organoids reproducibly form cell diversity of the human cerebral cortex. Nature. 570, 523-527 (2019).
- Uzquiano, A., et al. Proper acquisition of cell class identity in organoids allows definition of fate specification programs of the human cerebral cortex. Cell. 185 (20), 3770-3788.e27 (2022).
- Mattei, D., et al. Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations. Int J Mol Sci. 21 (21), 7944 (2020).
- Van Den Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nat Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
- Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nat Med. 26 (5), 792-802 (2020).
- Santos, M. D., et al. Extraction and sequencing of single nuclei from murine skeletal muscles. STAR Protoc. 2 (3), 100694 (2021).
- Fleck, J. S., et al. Inferring and perturbing cell fate regulomes in human cerebral organoids. Nature. 621 (7978), 365-372 (2021).
- Martins-Costa, C., et al. Morphogenesis and development of human telencephalic organoids in the absence and presence of exogenous extracellular matrix. EMBO J. 42 (22), e113213 (2023).
- Hao, Y., et al. Integrated analysis of multimodal single-cell data. Cell. 184 (13), 3573-3587.e29 (2021).
- Choe, M. S., et al. A simple method to improve the quality and yield of human pluripotent stem cell-derived cerebral organoids. Heliyon. 7 (6), e07350 (2021).
- Giandomenico, S. L., et al. Cerebral organoids at the air-liquid interface generate diverse nerve tracts with functional output. Nat Neurosci. 22 (4), 669-679 (2019).
- Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biol. 21 (1), 130 (2020).
- Wen, F., Tang, X., Xu, L., Qu, H. Comparison of single-nucleus and single-cell transcriptomes in hepatocellular carcinoma tissue. Mol Med Rep. 26 (5), 339 (2022).
- Alles, J., et al. Cell fixation and preservation for droplet-based single-cell transcriptomics. BMC Biol. 15 (1), 44 (2017).
