Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais
Summary
Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.
Abstract
Na última década, a transcriptômica de célula única evoluiu significativamente e se tornou um método laboratorial padrão para análise simultânea de perfis de expressão gênica de células individuais, permitindo a captura da diversidade celular. A fim de superar as limitações impostas por tipos de células difíceis de isolar, uma abordagem alternativa com o objetivo de recuperar núcleos únicos em vez de células intactas pode ser utilizada para sequenciamento, tornando o perfil do transcriptoma de células individuais universalmente aplicável. Essas técnicas se tornaram uma pedra angular no estudo dos organoides cerebrais, estabelecendo-os como modelos do cérebro humano em desenvolvimento. Aproveitando o potencial da transcriptômica de célula única e núcleo único na pesquisa de organoides cerebrais, este protocolo apresenta um guia passo a passo que abrange procedimentos-chave, como dissociação de organoides, isolamento de célula única ou núcleo, preparação de biblioteca e sequenciamento. Ao implementar essas abordagens alternativas, os pesquisadores podem obter conjuntos de dados de alta qualidade, permitindo a identificação de tipos de células neuronais e não neuronais, perfis de expressão gênica e trajetórias de linhagem celular. Isso facilita investigações abrangentes sobre processos celulares e mecanismos moleculares que moldam o desenvolvimento do cérebro.
Introduction
Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos 1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença4. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas 4,5,6.
Com o advento das tecnologias de perfil de transcriptoma de célula única, tecidos humanos primários e modelos in vitro complexos podem ser estudados com um nível de granularidade sem precedentes, fornecendo insights mecanicistas sobre as mudanças na expressão gênica no nível de subpopulações celulares na saúde e na doença e informando sobre novos alvos terapêuticos putativos 7,8,9. O campo organoide progrediu utilizando o perfil do transcriptoma de célula única para avaliar a composição celular, a reprodutibilidade e a fidelidade das tecnologias organoides cerebrais 10,11,12. O sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq) permitiu a classificação celular e a identificação de desregulação genética em organoides doentes13,14. É importante ressaltar que é a complexidade dos tecidos organoides que exige a implementação de técnicas que permitam o perfil de células individuais. A caracterização de organoides usando métodos como perfil de transcriptoma em massa (sequenciamento de RNA em massa) leva à heterogeneidade celular mascarada e perfis de expressão gênica que são calculados em média em todos os tipos de células dentro do tecido complexo, limitando nossa compreensão dos processos em andamento durante o desenvolvimento de organoides na saúde e na doença 15,16,17. À medida que os métodos scRNA-seq continuam avançando, um número crescente de atlas está sendo criado, exemplificado por recursos como o Allen Brain Atlas ou o Atlas de célula única de organoides cerebrais humanos de Uzquiano et al.18.
A realização bem-sucedida do scRNA-seq a partir de organoides cerebrais depende do isolamento efetivo e da captura de células intactas. Como a dissociação de organoides cerebrais para obter células individuais é baseada na digestão enzimática, ela pode influenciar os padrões de expressão gênica, induzindo estresse e dano celular19,20. Portanto, a dissociação do tecido em células individuais é a etapa mais crucial. Uma abordagem alternativa é o sequenciamento de RNA de núcleo único (snRNA-seq), que facilita a extração livre de enzimas de núcleos de tecidos frescos e congelados21,22. No entanto, o isolamento de núcleos de um tecido apresenta outros desafios, como o enriquecimento dos tipos celulares de interesse e o baixo conteúdo de RNA dos núcleos em comparação com as células.
Estudos de transcriptoma de organoides cerebrais são comumente conduzidos usando scRNA-seq 10,18,23. No entanto, o isolamento de núcleos únicos pode fornecer um método ortogonal e suplementar para investigar o perfil transcriptômico de organoides. Aqui, apresentamos uma caixa de ferramentas para scRNA- e snRNA-seq para organoides cerebrais e discutimos os pontos críticos para obter os dados de sequenciamento de melhor qualidade.
Protocol
Representative Results
Discussion
A análise transcriptômica de células únicas e núcleos únicos emergiu como uma ferramenta fundamental para a compreensão dos mecanismos reguladores de genes em tecidos complexos. Ambos os métodos permitem estudos de transcriptoma de organoides cerebrais. Para garantir um experimento geral bem-sucedido, a qualidade do material de partida é de alta relevância. Portanto, é necessário cortar os organoides regularmente para evitar a formação de um núcleo necrótico26. Também é possível…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Valeria Fernandez-Vallone pelas instruções originais para o kit de dissociação neural Miltenyi. Também agradecemos à Plataforma de Tecnologia Genômica do Max Delbrueck Centrum por fornecer a receita para o tampão de lise NP40 e conselhos valiosos para configurar este protocolo. Também agradecemos a Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff pelo apoio organizacional do laboratório.
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
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