Summary

Generierung und Downstream-Analyse von Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomen in Hirnorganoiden

Published: March 29, 2024
doi:

Summary

Hier stellen wir ein umfassendes Protokoll für die Generierung und nachgelagerte Analyse von menschlichen Gehirnorganoiden mittels Einzelzell- und Einzelkern-RNA-Sequenzierung vor.

Abstract

In den letzten zehn Jahren hat sich die Einzelzell-Transkriptomik erheblich weiterentwickelt und ist zu einer Standardlabormethode für die gleichzeitige Analyse von Genexpressionsprofilen einzelner Zellen geworden, die die Erfassung der zellulären Vielfalt ermöglicht. Um die Einschränkungen durch schwer zu isolierende Zelltypen zu überwinden, kann für die Sequenzierung ein alternativer Ansatz verwendet werden, der darauf abzielt, einzelne Zellkerne anstelle von intakten Zellen zu gewinnen, wodurch das Transkriptom-Profiling einzelner Zellen universell anwendbar wird. Diese Techniken sind zu einem Eckpfeiler in der Erforschung von Gehirnorganoiden geworden und haben sie als Modelle des sich entwickelnden menschlichen Gehirns etabliert. Dieses Protokoll nutzt das Potenzial der Einzelzell- und Einzelkern-Transkriptomik in der Hirn-Organoidforschung und stellt eine Schritt-für-Schritt-Anleitung dar, die wichtige Verfahren wie Organoid-Dissoziation, Einzelzell- oder Zellkernisolierung, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung umfasst. Durch die Implementierung dieser alternativen Ansätze können Forscher qualitativ hochwertige Datensätze erhalten, die die Identifizierung neuronaler und nicht-neuronaler Zelltypen, Genexpressionsprofile und Zelllinienverläufe ermöglichen. Dies ermöglicht umfassende Untersuchungen zellulärer Prozesse und molekularer Mechanismen, die die Entwicklung des Gehirns prägen.

Introduction

In den letzten Jahren haben sich Organoidtechnologien als vielversprechendes Werkzeug für die Kultivierung organähnlicher Gewebe erwiesen 1,2,3. Gerade für Organe, die nicht leicht zugänglich sind, wie z.B. das menschliche Gehirn, bieten Organoide die Möglichkeit, Einblicke in die Entstehung und Krankheitsmanifestation zu gewinnen4. Daher wurden Gehirnorganoide häufig als experimentelles Modell zur Untersuchung verschiedener Erkrankungen des menschlichen Gehirns verwendet, einschließlich Entwicklungs-, psychiatrischer oder sogar neurodegenerativer Erkrankungen 4,5,6.

Mit dem Aufkommen von Einzelzell-Transkriptom-Profiling-Technologien konnten primäre menschliche Gewebe und komplexe In-vitro-Modelle mit einer noch nie dagewesenen Granularität untersucht werden, was mechanistische Einblicke in Genexpressionsänderungen auf der Ebene von Zellsubpopulationen bei Gesundheit und Krankheit lieferte und über neue mögliche therapeutische Ziele informierte 7,8,9. Das Organoid-Feld hat sich weiterentwickelt, indem Einzelzell-Transkriptom-Profiling verwendet wurde, um die zelluläre Zusammensetzung, Reproduzierbarkeit und die Genauigkeit von Organoid-Technologien im Gehirn zu beurteilen 10,11,12. Die Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) ermöglichte die Zellklassifikation und die Identifizierung genetischer Dysregulation in erkrankten Organoiden13,14. Wichtig ist, dass die Komplexität von organoiden Geweben die Implementierung von Techniken erfordert, die die Profilerstellung einzelner Zellen ermöglichen. Die Charakterisierung von Organoiden mit Methoden wie dem Bulk Transcriptome Profiling (Bulk RNA Sequencing) führt zu maskierten zellulären Heterogenitäts- und Genexpressionsprofilen, die über alle Zelltypen innerhalb des komplexen Gewebes gemittelt werden, was letztendlich unser Verständnis der ablaufenden Prozesse während der Organoidentwicklung in Gesundheit und Krankheit einschränkt 15,16,17 . Mit der Weiterentwicklung der scRNA-seq-Methoden wird eine zunehmende Anzahl von Atlanten erstellt, wie z. B. der Allen Brain Atlas oder der Single cell atlas of human brain organoids von Uzquiano et al.18.

Die erfolgreiche Durchführung von scRNA-seq aus Gehirnorganoiden hängt von der effektiven Isolierung und dem Einfangen intakter Zellen ab. Da die Dissoziation von Gehirnorganoiden zur Gewinnung einzelner Zellen auf enzymatischer Verdauung basiert, kann sie die Genexpressionsmuster beeinflussen, indem sie Stress und Zellschäden induziert19,20. Daher ist die Dissoziation des Gewebes in einzelne Zellen der wichtigste Schritt. Ein alternativer Ansatz ist die Einzelkern-RNA-Sequenzierung (snRNA-seq), die die enzymfreie Extraktion von Zellkernen sowohl aus frischem als auch aus gefrorenem Gewebe ermöglicht21,22. Die Isolierung von Zellkernen aus einem Gewebe bringt jedoch weitere Herausforderungen mit sich, wie z. B. die Anreicherung von Zelltypen von Interesse und den geringen RNA-Gehalt von Zellkernen im Vergleich zu Zellen.

Transkriptomstudien an Gehirnorganoiden werden häufig mit scRNA-seq 10,18,23 durchgeführt. Die Isolierung einzelner Kerne könnte jedoch eine orthogonale und ergänzende Methode zur Untersuchung des transkriptomischen Profils von Organoiden darstellen. Hier stellen wir eine Toolbox für scRNA- und snRNA-seq für Hirnorganoide vor und diskutieren die kritischen Punkte, um die besten Sequenzierungsdaten zu erhalten.

Protocol

Das beschriebene Protokoll wird in einem Labor der Biosicherheitsstufe 1 des Max-Delbrück-Centrums für Molekulare Medizin (Zulassungsnummer: 138/08) in Übereinstimmung mit den Anforderungen und in Übereinstimmung mit den EU- und nationalen Vorschriften zur Ethik in der Forschung durchgeführt. 1. Gewinnung von Vorderhirn-Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) HINWEIS: Dieses Protokoll wurde an mehreren verschiedenen iPS-Linie…

Representative Results

Um die Zelltypzusammensetzung von Hirnorganoiden mit scRNA-seq und snRNA-seq zu untersuchen, wurden Hirnorganoide nach 30-tägiger Kultur geerntet, da Organoide in diesem Stadium bereits neuroepitheliale Schleifen aufweisen, die aus Vorläufern bestehen, die von intermediären Vorläuferzellen und Neuronen im Frühstadium umgeben sind 4,18. Die Überwachung der Qualität der Organoide während des gesamten Wachstums und der Kultivierung ist unerlässlich, um zuve…

Discussion

Die transkriptomische Analyse einzelner Zellen und einzelner Zellkerne hat sich zu einem zentralen Werkzeug für das Verständnis der genregulatorischen Mechanismen in komplexen Geweben entwickelt. Beide Methoden ermöglichen Transkriptom-Untersuchungen von Hirnorganoiden. Um einen insgesamt erfolgreichen Versuch zu gewährleisten, ist die Qualität des Ausgangsmaterials von hoher Relevanz. Daher ist es notwendig, die Organoide regelmäßig zu schneiden, um die Bildung eines nekrotischen Kernszu verhind…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Valeria Fernandez-Vallone für die Originalanleitung für das Miltenyi Neural Dissociation Kit. Wir danken auch der Genomics Technology Platform des Max Delbrück Centrums für die Bereitstellung des Rezepts für den NP40-Lysepuffer und die wertvolle Beratung bei der Einrichtung dieses Protokolls. Wir danken auch Margareta Herzog und Alexandra Tschernycheff für die organisatorische Unterstützung des Labors.

Materials

1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) Sigma  43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes  VWR 525-0130 microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline  analysis pipline
15 ml Falcon Falcon Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME) Life Technologies 21985023
50 ml Falcon Falcon Centrifuge tube
A83-01 Bio Technologies 379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) Life Technologies 15240062
B-27 Plus Supplement Life Technologies 17504044
B-27 Supplement without vitamin A Life Technologies 12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) Sigma Aldrich A8806-5G 
cAMP Biogems 6099240
cAMP Biogems 6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED VWR DHC-N01
Cell strainer 40 µm Neolab 352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon Sigma CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit 10X Genomics 1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns 10X Genomics 1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 10X Genomics 1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill Roche 11873580001
DAPI MERCK Chemicals 0000001722
DMEM/F12 Life Technologies 11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete Sigma Aldrich 10536355
Essential E8 Flex Medium Life Technologies A2858501
EVE Cell Counting Slides VWR EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) PAN Biotech P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating) Life Technologies A1413302 
gentleMACS Miltenyi Biotec dissociation maschine
GlutaMAX supplements Life Technologies 35050038
Heparin sodium cell culture tested Sigma H3149-10KU
human recombinant BDNF StemCell Technologies 78005.3
human recombinant GDNF StemCell Technologies 78058.3
Insulin Solution Human Sigma Aldrich I2643-25MG
Knockout serum replacement Life Technologies 10828028
LDN193189 Hydrochloride 98% Sigma Aldrich 130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x) Sigma Aldrich M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free Thermo Scientific AM9530G
mTeSR Plus StemCell Technologies 100-0276 stem cell medium
mTeSR1 StemCell Technologies 85850 stem cell medium
N2 Supplement  StemCell Technologies 17502048
Neural Tissue Dissociation Kit Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG 130-092-628
Neurobasal Plus Life Technologies A3582901
NextSeq500 system Illumina Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution Life Technologies 28324
PBS Dulbecco’s Invitrogen 14190169
PenStrep (Penicillin – Streptomycin) Life Technologies 15140122
Percoll Th. Geyer 10668276
Pluronic (R) F-127 Sigma Aldrich P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor Life Technologies  EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB Biomol Cay10005583-10
SB 431542  Biogems 3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL Invitrogen AM9760G
StemFlex Medium Thermo Scientific A3349401 stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom Sarstedt 83.3925.500
TISSUi006-A TissUse GmbH https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue T8154-20ml Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Life Technologies 12604013 Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 Life Technologies 15567027
XAV939 Enzo Life sciences BML-WN100-0005

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Wandres, M., Aigner, D., Kastelic, N., Boltengagen, A., Rybak-Wolf, A., Rajewsky, N. Generation and Downstream Analysis of Single-Cell and Single-Nuclei Transcriptomes in Brain Organoids. J. Vis. Exp. (205), e66225, doi:10.3791/66225 (2024).

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