脳オルガノイドにおけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトームの生成とダウンストリーム解析
Summary
ここでは、単一細胞および単一核RNAシーケンシングを使用したヒト脳オルガノイドの生成およびダウンストリーム解析のための包括的なプロトコールを紹介します。
Abstract
過去10年間で、シングルセルトランスクリプトミクスは大幅に進化し、個々の細胞の遺伝子発現プロファイルを同時に解析するための標準的な実験室法となり、細胞の多様性を捉えることが可能になりました。単離が困難な細胞タイプによる制限を克服するために、無傷の細胞ではなく単一の核を回収することを目的とした別のアプローチをシーケンシングに利用することができ、個々の細胞のトランスクリプトームプロファイリングを普遍的に適用できます。これらの技術は、脳オルガノイドの研究の基礎となり、発達中のヒト脳のモデルとして確立されています。脳オルガノイド研究におけるシングルセルおよびシングル核トランスクリプトミクスの可能性を活用するこのプロトコルは、オルガノイドの解離、シングルセルまたは核の単離、ライブラリ調製、シーケンシングなどの主要な手順を網羅したステップバイステップのガイドを提供します。これらの代替アプローチを実装することで、研究者は高品質のデータセットを取得でき、ニューロン細胞と非ニューロン細胞のタイプ、遺伝子発現プロファイル、および細胞系統の軌跡を同定できます。これにより、脳の発達を形作る細胞プロセスと分子メカニズムの包括的な研究が容易になります。
Introduction
ここ数年で、オルガノイド技術は臓器様組織を培養するための有望なツールとして浮上してきました1,2,3。特に、人間の脳など、簡単にアクセスできない臓器の場合、オルガノイドは発生や疾患の発現に関する洞察を得る機会を提供します4。このように、脳オルガノイドは、発達疾患、精神疾患、さらには神経変性疾患など、さまざまなヒトの脳障害を調査するための実験モデルとして広く使用されてきました4,5,6。
シングルセルトランスクリプトームプロファイリング技術の出現により、初代ヒト組織や複雑なin vitroモデルを前例のない粒度で研究できるようになり、健康や疾患における細胞亜集団レベルでの遺伝子発現変化に関するメカニズム的な洞察が得られ、新たな推定治療標的に関する情報を得ることができるようになった7,8,9.オルガノイド分野は、脳オルガノイド技術10,11,12の細胞組成、再現性、および忠実度を評価するために、シングルセルトランスクリプトームプロファイリングを利用することによって進歩してきた。シングルセルRNAシーケンシング(scRNA-seq)により、疾患オルガノイドの細胞分類と遺伝的調節不全の同定が可能になりました13,14。重要なことは、オルガノイド組織の複雑さが、個々の細胞のプロファイリングを可能にする技術の実装を必要とすることです。バルクトランスクリプトームプロファイリング(バルクRNAシーケンシング)などの方法を用いたオルガノイドの特性評価は、複雑な組織内のすべてのタイプの細胞で平均化されるマスクされた細胞の不均一性および遺伝子発現プロファイルをもたらし、最終的に健康および疾患におけるオルガノイド開発中の進行中のプロセスの理解を制限する15,16,17.scRNA-seq法が進歩し続けるにつれて、Allen Brain AtlasやUzquianoらによるヒト脳オルガノイドのシングルセルアトラスなどのリソースに代表されるように、ますます多くのアトラスが作成されています18。
脳オルガノイドからのscRNA-seqを成功させるには、無傷の細胞の効果的な単離と捕捉が必要です。個々の細胞を得るための脳オルガノイドの解離は酵素消化に基づいているため、ストレスや細胞損傷を誘発することにより遺伝子発現パターンに影響を与えることができる19,20。したがって、組織を個々の細胞に解離させることが最も重要なステップです。別のアプローチは、単一核RNAシーケンシング(snRNA-seq)であり、これは新鮮組織と凍結組織の両方から核を酵素なしで抽出することを容易にする21,22。しかし、組織からの核の単離には、目的の細胞の種類の濃縮や、細胞と比較して核のRNA含有量が低いなど、他の課題があります。
脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究は、一般的にscRNA-seq 10,18,23を用いて行われます。しかし、単一核の単離は、オルガノイドのトランスクリプトームプロファイルを調査するための直交的かつ補足的な方法を提供する可能性があります。ここでは、脳オルガノイド用のscRNA-seqおよびsnRNA-seqのツールボックスを紹介し、最高品質のシーケンシングデータを取得するための重要なポイントについて説明します。
Protocol
Representative Results
Discussion
単一細胞および単一核のトランスクリプトーム解析は、複雑な組織内の遺伝子調節メカニズムを理解するための極めて重要なツールとして浮上しています。どちらの方法も、脳オルガノイドのトランスクリプトーム研究を可能にします。実験を全体的に成功させるためには、出発物質の品質が重要性が高いことが大切です。したがって、壊死性コアの形成を防ぐために、オルガノイドを定期?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Miltenyi Neural Dissociationキットの元の指示を提供してくれたValeria Fernandez-Valloneに感謝します。また、NP40溶解バッファーのレシピと、このプロトコルの設定に関する貴重なアドバイスを提供してくださったMax Delbrueck CentrumのGenomics Technology Platformにも感謝します。また、研究室の組織的なサポートを提供してくださったMargareta Herzog氏とAlexandra Tschernycheff氏にも感謝します。
Materials
| 1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
| 1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
| 10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
| 15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| 2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
| 50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
| A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
| Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
| B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
| B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
| Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| cAMP | Biogems | 6099240 | |
| C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
| Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
| Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
| Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
| Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
| Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
| Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
| DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
| Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
| Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
| EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
| Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
| Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
| gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
| GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
| Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
| human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
| human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
| Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
| MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
| MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
| mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
| N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
| Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
| Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
| NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
| NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
| PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
| PenStrep (Penicillin – Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
| Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
| Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
| RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
| Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
| SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
| Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
| StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
| TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
| TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
| Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
| TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
| UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
| XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
References
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