Summary
本方案描述了一种优化的3D神经视网膜诱导系统,该系统以高可重复性和效率减少视网膜类器官的粘附和融合。
Abstract
视网膜病变是全球失明的主要原因之一。研究其发病机制对于视网膜病变的早期诊断和及时治疗至关重要。不幸的是,道德障碍阻碍了从人类那里收集证据。最近,大量研究表明,人类多能干细胞(PSCs)可以使用不同的诱导方案分化为视网膜类器官(RO),这在视网膜病变中具有巨大的潜力,可用于疾病建模、药物筛选和基于干细胞的治疗。本研究描述了一种优化的诱导方案,以产生神经视网膜 (NR),显着降低囊泡和融合的可能性,提高生产成功率,直到第 60 天。基于PSCs解离后自重组的能力,结合某些互补因子,这种新方法可以特异性地驱动NR分化。此外,该方法简单、具有成本效益、具有显着的可重复性和效率,为视网膜疾病的个性化模型提供了令人鼓舞的前景,并为细胞治疗、药物筛选和基因治疗测试等应用提供了丰富的细胞库。
Introduction
眼睛是人类感觉器官的主要信息来源,视网膜是哺乳动物眼睛的主要视觉感觉组织1。视网膜病变是导致眼部疾病的全球主要原因之一,导致失明2.全世界约有 285 万人因视网膜病变而遭受不同程度的视力损害3.因此,研究其发病机制对于早期诊断和及时治疗至关重要。大多数关于人类视网膜病变的研究主要集中在动物模型上4,5,6。然而,人类视网膜是一个复杂的多层组织,由各种细胞类型组成。传统的二维 (2D) 细胞培养和动物模型系统通常无法忠实地概括人类天然视网膜的正常时空发育和药物代谢 7,8。
最近,3D 培养技术已经发展到可以从多能干细胞 (PSC) 生成组织样器官9,10。在3D悬浮培养系统中,由人PSC产生的视网膜类器官(ROs)不仅包含七种视网膜细胞类型,而且还表现出与体内人视网膜相似的独特分层结构11,12,13。人 PSC 衍生的 RO 已获得普及和广泛使用,是目前研究人视网膜发育和疾病的最佳体外模型14,15。在过去的几十年中,许多研究人员已经证明,人类PSC,包括胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC),可以使用各种诱导方案分化为RO。这些进展在视网膜病变的疾病建模、药物筛选和干细胞疗法方面具有巨大的潜力16,17,18。
然而,从人类多能干细胞 (PSC) 生成神经视网膜 (NR) 是一个复杂、繁琐且耗时的过程。此外,组织类器官的批次间差异可能导致结果的重现性降低19,20。许多内在和外在因素可以影响视网膜类器官(ROs)的产量,例如起始细胞的数量或种类以及转录因子和小分子化合物的使用21,22,23。自从Sasai实验室11产生第一个人类RO以来,多年来已经提出了多种修改,以提高诱导过程的易用性和有效性13,21,24,25。不幸的是,迄今为止,尚未建立在所有实验室中生成RO的金标准协议。事实上,由于不同的诱导方法,以及视网膜标志物的表达及其结构的稳健性存在很大差异,RO存在一定程度的差异22,26。这些问题可能会使样本采集和研究结果的解释严重复杂化。因此,需要一种更巩固和更强大的分化方案,以最大限度地提高效率,同时将RO产生的异质性降至最低。
本研究描述了一种基于 Kuwahara 等人 12 和 Döpper 等人 27 组合的优化诱导方案,并附有详细说明。新方法显著降低了类器官囊泡化和融合的概率,提高了产生NR的成功率。这一发展为视网膜疾病的疾病建模、药物筛选和细胞治疗应用带来了巨大的希望。
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Protocol
本研究是根据《赫尔辛基宣言》原则进行的,并经中国人民解放军总医院机构伦理委员会批准。WA09(H9)电调线是从WiCell研究所获得的。
1.培养基和试剂制备
- 人胚胎干细胞培养基和传代溶液
- 维持培养基 (MM):无菌制备 500 mL 完全 MM(基础培养基 + 5x 补充剂;参见 材料表)。在室温(RT)下解冻5x补充剂或在2-8°C下过夜。 预热至室温,使用前充分搅拌,直到补充剂没有浑浊。
- 1% 细胞外基质 (ECM):使用预冷的移液管吸头和无菌试管在冰上每管分配 200 μL ECM(参见 材料表)。将试管储存在-20°C冰箱中。在冰上融化ECM,并用预冷的DMEM / F12以1:100稀释。
- 0.5 mM pH = 8.0 EDTA:要制备 500 mL 0.5 mM EDTA,将 500 μL 0.5 M EDTA 和 0.9 g NaCl 加入 500 mL 1x Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 中(参见 材料表)。充分混合并储存在2-8°C。
- 视网膜分化培养基
- 无生长因子化学成分培养基 (gfCDM):通过结合 45% Iscove 改良的 Dulbecco 培养基 GlutaMAX (IMDM-GlutaMAX)、45% Ham 的 F12-GlutaMAX (F12-Glutamax)、10% 敲除血清替代物 (KSR)、1% 胆固醇脂质浓缩物和 450 μM 硫代甘油来制备 gfCDM(参见 材料表)。
- 小分子化合物
- Y-27632 2HCl:将 50 mg Y-27632 粉末加入 3.122 mL 二甲基亚砜 (DMSO) 中。在-80°C下以50mM的浓度分配并储存Y-27632(参见 材料表)2年,远离光线。将原液稀释 2,500 倍 (20 μM) 以供使用,相当于每 mL gfCDM 含 0.4 μL Y-27632。
- IWR1-endo:加入2.4424mL DMSO溶解10mg IWR1-endo(参见 材料表),得到10mM储备溶液。分配等分试样并将其储存在-80°C长达2年。每 mL gfCDM 加入 0.3 μL 10 mM IWR1-endo,以获得 3 μM 浓度用于诱导。
- SB431542:要制备 50 mM SB431542,将 10 mg SB431542(参见 材料表)加入 0.5203 mL DMSO 并充分混合。在-80°C溶剂中储存最多2年。为了制备工作浓度为10μM的SB431542,将2μL的50mM储备溶液加入10mL gfCDM中。
- LDN-193189 2HCl:将 5 mg LDN-193189 2HCl(参见 材料表)溶于 10.4297 mL DMSO 中,得到 1 mM 储备溶液。储存在-20°C或-80°C(根据制造商的建议)。向每 10 mL gfCDM 中加入 0.1 μL 原液,得到 100 nM 的 LDN-193189 用于诱导。
- 重组人骨形态发生蛋白4(BMP4):在4 mM HCl中以50-200 μg/mL的比例复溶(参见 材料表)。复溶后在2°C至8°C下储存1个月或-20°C储存1年。使用 1.5 nM BMP4 进行 NR 诱导。
- 长期NR培养基
- 视黄酸 (RA):量取 6 mg RA 粉末(见 材料表)并加入 3.9941 mL DMSO。在-80°C下以5mM的等分试样储存,并在3个月内使用。为了达到 0.5 μM 的工作浓度,将 10 μL 预混液加入 100 mL 神经视网膜分化培养基 (NRDM) 中。使用前添加。
注意: 在准备和储存过程中避免避光。 - 牛磺酸:将称量200mg的牛磺酸粉末(见 材料表)加入7.9904mL DMSO中,得到200mM储备溶液。分配并储存在2-8°C。 通过每 100 mL NRDM 加入 50 μL 储备溶液,可达到 0.1 mM 牛磺酸的工作浓度。
- NRDM:用 DMEM/F12-GlutaMAX 培养基、1% N2 添加剂、10% 胎牛血清、0.5 mM RA 和 0.1 mM 牛磺酸组成 NRDM(参见 材料表)。在2-8°C下储存长达2周或在-20°C下储存6个月,以确保组分的活性。
- 视黄酸 (RA):量取 6 mg RA 粉末(见 材料表)并加入 3.9941 mL DMSO。在-80°C下以5mM的等分试样储存,并在3个月内使用。为了达到 0.5 μM 的工作浓度,将 10 μL 预混液加入 100 mL 神经视网膜分化培养基 (NRDM) 中。使用前添加。
- 封闭缓冲液:用DPBS以1:9稀释,得到10%的工作溶液(参见 材料表)。在-20°C下储存长达5年。
注意: 在 II 类生物安全柜中执行所有其他程序以确保无菌,称重除外。如果在制备过程中需要添加称重试剂,请使用 0.22 μm 过滤器进行过滤。
2. H9-胚胎干细胞的培养
- H9-ESCs的解冻
- 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 1% ECM。在37°C的5%CO2 气氛中的培养箱中孵育1小时。
注意:避免沿井壁添加ECM,因为它可能会粘在表面。 - 从液氮罐中取出H9-ESC低温管原液,并在37°C水中快速振荡30秒。
注意:不要让小瓶完全解冻。 - 取出小瓶并使用 75% 的消毒酒精喷雾仔细消毒。将冻存管中解冻的 H9-ESC 加入含有 9 mL MM 和 10 μM Y-27632 的 15 mL 管中。
- 在室温下以190× g 离心管5分钟。 用1mL移液管小心地除去大部分上清液,留下约50μL上清液以避免细胞损失。
- 向细胞沉淀物中加入含有 10 μM Y27632 的 1 mL MM,并用 1 mL 移液管上下移液 5-10 次轻轻重悬细胞沉淀物。
- 孵育1小时后去除ECM涂层。向每个孔中加入 2 mL 含有 10 μM Y-27632 的预热 MM。
- 每孔分配 0.5 mL 细胞悬液。轻轻横向摇晃板以确保细胞均匀分布。
- 将板在37°C下在5%CO2 下孵育至少24小时而不接触它。
- 每天更换培养基。当克隆密度达到70%及以上时,需要传代。
- 向 6 孔板的每个孔中加入 1 mL 1% ECM。在37°C的5%CO2 气氛中的培养箱中孵育1小时。
- H9-ESCs的传代
- 如上所述制备ECM包被板(步骤2.1.1),每孔加入2mL MM。
- 从6孔板中取出用过的培养基。用 1 mL DPBS 洗涤每个孔两次。
- 通过缓慢加入 1 mL EDTA,并与 1 mL EDTA 在室温下孵育 4-7 分钟,洗涤每个孔两次。
注意:在孵育过程中,在显微镜下检查6孔板3分钟。如果大多数细胞接近从培养皿中分离,请立即进行下一步。避免长时间孵育,以减少对细胞的负面影响。 - 弃去 EDTA 并加入 1 mL MM 以中止消化。
- 轻轻敲击孔板,直到大部分细胞分离。
- 用 5 mL 移液管小心地将细胞悬液转移到 15 mL 离心管中。轻轻地将H9-ESC菌落上下重悬3-5次,以将它们与巴斯德皮特混合。将 20-100 μL 细胞悬液转移到新的 ECM 包被的 6 孔培养皿中并来回摇动。
- 当在显微镜下观察到细胞密度足够时,将板在37°C下在5%CO2 下孵育至少24小时而不接触它。
- 每天更换介质。在克隆密度达到 70% 及以上时,需要传代。
3. 人类NR的产生
注意:一旦菌落达到大约 70% 的汇合度,就可以使用 图 1 中概述的程序步骤将它们定向分化为视网膜类器官 (RO)。
- 第 0 天 - 胚状体 (EB) 形成
- 用 2 mL DPBS 洗涤细胞后,向孔中加入 0.5 mL 含有 20 μM Y27632 的 CDS(参见 材料表)。在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育3分钟。
注意:在显微镜下检查。尽可能减少孵育时间,避免对细胞产生有害影响。 - 通过加入含有 20 μM Y27632 的 3 mL MM 中止消化。以190× g 离心5分钟并弃去上清液。
- 将细胞沉淀重悬于含有 20 μM Y27632 的 1 mL gfCDM 中,并计数细胞。将 1.2 × 106 个细胞(每孔 1.2 ×10 个 4 个细胞)的相应体积加入 10 mL gfCDM 中,该 gfCDM 预先掺入了 20 μM Y-27632、3 μM IWR1-endo、10 μM SB431542 和 100 nM LDN-193189(参见 材料表)。
- 向 96 个 V 底锥形孔的每个孔中加入 100 μL 细胞悬液。将板放入加湿的 5% CO2 培养箱中,直到第 6 天。
注意: 至少 24 小时内不要移动培养皿,以增强 EB 的粘附性。
- 用 2 mL DPBS 洗涤细胞后,向孔中加入 0.5 mL 含有 20 μM Y27632 的 CDS(参见 材料表)。在37°C下在加湿的5%CO2 培养箱中孵育3分钟。
- 第 6 天 - 视网膜诱导
- 在第 6 天,加入 10 mL 含有 55 ng/mL BMP4 的 gfCDM,以完全更换 EB 上的培养基。将板放回培养箱。
注意: 移液器朝向 96 V 型底锥形孔的壁以避免气泡。更换培养基时避免吸收任何类器官。 - 在第 9 天、第 12 天和第 15 天进行半中度更换。用新鲜的gfCDM替换一半的培养基,以逐渐稀释BMP4。
- 在第 6 天,加入 10 mL 含有 55 ng/mL BMP4 的 gfCDM,以完全更换 EB 上的培养基。将板放回培养箱。
- 第 18 天 - 长期 NR 培养
- 在第 18 天,使用 5 mL Pasteur 移液器小心地将形成的 EB 转移到 15 mL 离心管中,并再次用 NRDM 轻轻冲洗。将 EB 转移到低吸附 6 孔或 24 孔板上(参见 材料表)。将板放回培养箱。
- 每 3 天用新鲜的 NRDM 更换培养基。
注意: 在更换介质期间关闭灯,因为 RA 对光敏感。去除严重分化的类器官,并在显微镜下分离贴壁类器官。
4. 人类NRs的分析
- RO的安装
- 选择不同世代的H9-ESCs诱导三批ROs。
注意:计算三种评估方法(Kuwahara 等人 12、Döpper 等人 27 和本研究中的改进方法)中每一种形成 NR 数量的三个板以评估诱导成功率。如果光学显微镜检查在第 30 天显示神经上皮样结构的形成,则认为诱导成功。
- 选择不同世代的H9-ESCs诱导三批ROs。
- RO的免疫荧光染色
- 将 3-5 个 RO 转移到 1.5 mL 试管中。移液掉多余的培养基,在室温下用 1 mL DPBS 洗涤 RO 一次,让 RO 下沉并小心地取出 DPBS。每 1.5 mL 试管加入 1 mL 4% 多聚甲醛(参见 材料表),并固定在 4 °C。
注意:第 6 天和第 18 天的 RO,固定 2 小时。在第 30 天修复 12 小时,在第 60 天修复 14 小时。 - 固定后,使用梯度酒精脱水。让 RO 在 50%、60% 和 70% 酒精中各静置 15 分钟,然后在 80%、90%、95%、100% 和 100% 酒精中各静置 10 分钟。然后,加入 100% 酒精和二甲苯的 1:1 混合物 10 分钟,然后加入二甲苯两次,每次 10 分钟。
- 将RO放入装有熔化副质体的金属模具中(见 材料表)40分钟,然后将模具淬火在冰上以固定RO。将嵌入盒放入模具中,并在-20°C下冷冻过夜。随后,小心地拆下嵌入盒。最后,将它们存放在 RT 中。
- 用石蜡切片机创建连续切片(5 μm 厚度)。将切片固定在粘附显微镜载玻片上,干燥并储存在室温下。
- 在抗原修复之前进行脱蜡和补液12,27。
- 将 10 mL 20x pH 6.0 柠檬酸盐抗原修复溶液(参见 材料表)加入 190 mL ddH2O(双蒸馏 H2O)中。在微波炉中以高模式加热 4 分钟直至沸腾。加入石蜡切片后,在低模式下加热切片20分钟以完成抗原修复。
- 让石蜡切片在通风处自然冷却,然后将它们放入潮湿的腔室中。
- 使用巴氏笔(见 材料表)勾勒出各部分的轮廓。在室温下用0.2%Triton X-100孵育30分钟以打破膜,然后用TPBS洗涤载玻片三次,每次5分钟。
- 在每个染色面积为10μL的潮湿室中,用在室温下用DPBS稀释的10%驴血清封闭1小时。
- 加入在 10% 驴血清中稀释的一抗。在4°C的湿度室中孵育过夜。用 TPBS 洗涤样品三次,每次 10 分钟以除去未结合的抗体。
注:一抗如下:抗PAX6(1:250),抗SOX2(1:200),抗KI67(1:200),抗CHX10(1:200),抗β微管蛋白III(1:250)和抗NESTIN(1:200)(见 材料表)。 - 在加湿室中与在DPBS中稀释的二抗一起在室温下孵育1小时。用TPBS重复洗涤步骤三次,每次10分钟。
注意:在黑暗中保存以防止荧光二抗淬灭。二抗为与驴抗小鼠 IgG 偶联的 Alexa Fluor 488 和与驴抗兔 IgG 偶联的 Alexa Fluor 568,稀释度为 1:400(参见 材料表)。 - 在黑暗中与含有DAPI(1:500;参见 材料表)的DPBS在室温下孵育10分钟。用 TPBS 洗涤 3 次,每次 10 分钟。
- 将适量的抗荧光密封剂(见 材料表)滴到载玻片上,并用盖玻片盖住。
- 使用流样组织细胞定量分析仪(参见 材料表)或类似方法进行可视化。
- 显微镜分析后,将载玻片储存在-20°C的黑暗中。
- 将 3-5 个 RO 转移到 1.5 mL 试管中。移液掉多余的培养基,在室温下用 1 mL DPBS 洗涤 RO 一次,让 RO 下沉并小心地取出 DPBS。每 1.5 mL 试管加入 1 mL 4% 多聚甲醛(参见 材料表),并固定在 4 °C。
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Representative Results
修改后的协议的图形概述如 图 1 所示。当细胞生长到70%-80%的密度时,使用H9-ESCs产生RO。H9-ESCs在96个V型底锥形孔中的单细胞悬浮液在第1天聚集,并在第6天形成边界良好的圆形EB。随着培养时间的增加,EB的体积逐渐增加。第30天,神经上皮样结构在长期NR分化过程中明显形成并增厚。
此外,将改进的方法与其他两种方法(Kuwahara 等人 12 和 Döpper 等人 27)进行比较,以评估其重复性和效率(补充图 1)。本研究还观察到,改良方法后第 1 天 EB 的形态略差于其他两种方法。然而,使用改良方法形成的神经上皮结构在第 18 天更加连续(图 2)。在第 30 天,使用改良方法获得的早期 NR 在形状和大小上相似,并显示出规则的圆形(图 3)。与其他两种方法相比,改良方法形成的NRs具有较低的水泡和粘附发生率。此外,基于H9-ESCs,使用改良方法生成NR的成功率分别从Kuwahara等人和Döpper等人方法的26.9%和69.24%增加到87.39%12,27(图3M)。
对NR的石蜡包埋切片进行免疫荧光染色,以评估与视网膜发育相关的标志物的表达(图4)。结果显示,使用改良方法,在源自H9-ESC的NR中,与视网膜相关的人类基因的表达。第一个出现的细胞亚型是视网膜神经节细胞,它主要积聚在NR的基底侧。 TUJ1染色用于鉴定视网膜神经节细胞的轴突(图4I-L)。此外,在内层(PAX6+)和外层(CHX10+)均检测到视网膜祖细胞的标志物(图4A-H)。增殖标志物KI67阳性的细胞分布在外层(图4A-D)。
图 1:原理图概述。 修改后的培养方案的示意图概述了在特定时间点添加的不同因子和神经视网膜发育的代表性图像。SFEBq:快速重聚集的胚状体状聚集体的无血清漂浮培养物;KSR:基因敲除血清替代疗法;gfCDM:无生长因子化学成分分明培养基;NRDM: 神经视网膜分化培养基;BMP4:骨形态发生蛋白 4.比例尺:200μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图2:早期从三种不同方案得出的视网膜类器官的代表性明场图像。 在第 1 天,只有修改后的方法没有来自 EB (A、E、I)。在第 6 天,EB 在所有三种方法 (B、F、J) 中形成。第18天形成早期神经视网膜,3种诱导方法(C、G、K)形态不同。第21天,改良方法生成的神经视网膜呈现连续的神经上皮结构(D,H,L)。比例尺:200 μm。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3:第 30、45、60 天悬浮培养中的成熟 3D 神经视网膜。 在第 30 天,神经视网膜在所有三种方法(A、E、I)中形成。箭头表示 Kuwahara 等人方法 (B) 中的囊性结构。白色虚线框表示类器官相互粘附和融合的区域(D,F,H)。与其他两种方法(C,G,J,K,L)相比,从修改后的方案生成的视网膜类器官在大小和形态上相似。比例尺:100μm(白色);200μm(黑色)。使用H9-ESCs的三种方法诱导成功率统计图表(M)。采用单因素方差分析检验显著性(误差线显示标准误差,n = 864,**P < 0.01,***P < 0.001)。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 4:修改后的方案中神经视网膜的表征。 第 6 天、第 18 天、第 30 天和第 60 天的神经视网膜免疫染色图像。绿色染色剂用于 KI67(增殖细胞)、PAX6(视网膜祖细胞)和 NESTIN(神经干细胞)。红色染色剂用于 CHX10(视网膜祖细胞)、SOX2(神经祖细胞)和 TUJ1(视网膜神经节细胞)。比例尺:100μm(A,B,E,F,I,J);200μm(C,D,G,H,K,L)。 请点击这里查看此图的较大版本.
补充图1:三种视网膜类器官诱导方案的流程图比较。 SFEBq:快速重聚集的胚状体状聚集体的无血清漂浮培养物;KSR:基因敲除血清替代疗法;gfCDM:无生长因子化学成分分明培养基;NRDM: 神经视网膜分化培养基;BMP4:骨形态发生蛋白4。 请点击此处下载此文件。
补充图2:Kuwaharaet al.方法诱导的胚状体(EB)形态。 在第 6 天添加 BMP4 后,在 EB 周围观察到死细胞团块的逐渐出现(A-D,黑色箭头)。在第 6 天 (E-L) 后观察到较大的形态差异,一些 EB 甚至完全失活 (H,L)。ESC:胚胎干细胞,PBMC:外周血单核细胞,IPSC:诱导多能干细胞。比例尺:200μm。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
人类RO可以在空间和时间上概括胎儿视网膜的发育,早期RO在同等发育阶段表现出与胎儿视网膜的高度相似性15。在组织形态和分子表达方面,人类RO密切反映了视网膜组织的实际生长状态,为疾病建模、药物筛选和再生医学领域提供了巨大而前所未有的机会。目前,已经建立了几种不同的方法在 体外从人PSCs中产生RO,并且正在进行持续的修改和优化,以进一步提高效率9。Sasai 实验室首次报道了从人类 ESC 生成 PSC 衍生的 RO11。首先将人胚胎干细胞制备成单细胞悬浮液,然后将等量的细胞接种在96个V型底锥形孔中,快速聚集形成环状EB。关键细胞信号通路的外部添加促进了 EB 中视囊泡的形成,随后在悬浮培养中成熟为层压 RO。NR 包含一种神经胶质细胞类型和六种不同的神经元细胞类型,代表视网膜发育的许多方面,例如细胞形态发生、神经元分化和顶基极性9。虽然只有10%的聚集体形成了双壁光杯结构,但这是生产更先进的ROs11的一个重要里程碑。
随后,Zhong等人引入了一种新的替代方案,其中hiPSCs首先在汇合处附近生长,然后化学或机械分解成漂浮的小聚集体13。然后,小聚集体在悬浮培养物中形成EB,EB与板底部分离,在神经方向上进一步分化。Zhong等人展示了一种完全层压的3D视网膜,具有相对发达的光感受器外段,对光刺激有反应。这种方法对细胞信号通路的外部调节较少,主要以自主方式进行9。第三次技术革命是 Lowegroup 25 引入嵌入方法。这涉及将 hESC 聚集体嵌入 ECM 中以形成单腔上皮结构。酶分散后,聚集体维持在悬浮培养物中以形成成熟的RO。尽管这三种方法都可以成功诱导具有相当结构和功能的RO,但大规模应用由于其高异质性和低成功率而具有耗时费力的缺点23。
除上述方法外,Kuwahara等人还提出了一种新的归纳方法,即关键因子梯度下降方法12。他们发现,从第 6 天开始,以降低的浓度添加 BMP4 可以产生 NR。该诱导系统使用较少的外部因素来形成具有更大均匀性和形态均匀性的RO。然而,有研究报道,形成的EB容易发生囊性病变,该方法的诱导成功率约为40%12,28。Döpper等人修改了该方案,通过在诱导的早期阶段将商业培养基与三种小分子抑制剂相结合来稳定EBs,从而提高了成功率27。相比之下,视网膜神经上皮细胞更容易相互粘附,因此在长期悬浮培养期间需要单独培养每个RO。Döpper等人的方法增加了实验操作的复杂性和成本,不适合大规模归纳27。优化的RO生产方案提高了感应效率。将当前修改的方法与Kuwahara等人和Döpper等人的方法进行了比较。
这项研究表明,Kuwahara 等人和 Döpper 等人的方法在第 1 天都形成了具有光滑边缘的 EB,而目前的改进方法需要相对较长的时间才能形成 EB,大约直到第 6 天。使用Kuwahara等人的方法获得的EB的体积大于使用Döpper等人的方法获得的EB的体积,并且使用Döpper等人的方法获得的EB在液体流动下表现出增加的流动性。值得注意的是,当使用 Kuwahara 等人的方法时,在第 6 天添加 BMP4 后,EB 周围逐渐出现死细胞团块(补充图 2)。到第 18 天,Kuwahara 等人方法的 EB 观察到显着的形态差异,并且一些 EB 完全失活(补充图 2)。在Döpper等人的方法中,大多数EB是圆形的,边界很好,并且在它们周围只表现出少量分散的死细胞。改进的方法形成了紧密且结构良好的EB,具有轻微的形态差异,并在其周围观察到一些死细胞。
此外,本研究还发现,Kuwahara等人在转移到6孔板后的早期阶段,一些EBs产生了囊泡,导致ROs无法形成。RO的粘附和融合发生在第40天左右,这显着降低了实验的效用。Döpper等人的方法比Kuwahara等人的方法更复杂,需要更多的操作步骤和更高的成本。Döpper等人的大多数RO也不可避免地相互发展粘附和融合。本研究中的改进方法 在体外 成功生成了表达人类视网膜相关标记物 CHX10、KI67、PAX6、SOX2、TUJ1 和 NESTIN 的 3D NR。改良方法的大多数ROs在大小和形态上是一致的,在视网膜分化后期形成的囊泡或粘连非常少。
与其他两种方法相比,新的培养系统具有更简单的操作步骤和更低的成本。改进方法的关键步骤是将三种小分子抑制剂加入培养基中,并确保板在前六天内不移动,以稳定EB的结构。早期阶段的板运动或任何细胞操作都可能影响 EB 的形成。与其他两种方法相比,改良方法在第1天没有改变培养基,并且在第15天也减少了小分子抑制剂的使用。总之,在一定程度上简化了改良方法的操作步骤,减少了培养基和试剂的使用,节省了实验成本。然而,改进的方法仍然不能解决当前类器官培养系统的常见问题。此外,ROs的诱导效率很大程度上取决于hPSCs的质量和分化能力。在这项研究中,仅完全计算了使用H9-ESC生成NR的效率。本研究采用新方法成功诱导不同hPSCs品系中的RO,并实现了相同的诱导效率,包括H9、H1和PBMC-iPSC。三种细胞系之间的诱导效率没有统计学差异。未来,更多的研究需要探索使用该方法对不同hPSCs的诱导效率。
综上所述,优化后的视网膜诱导方案简单且价格低廉,具有较高的可重复性和效率,为视网膜疾病的个性化模型提供了有前途的个性化模型,为细胞治疗、药物筛选和基因治疗检测提供了丰富的细胞来源。
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Disclosures
所有作者都声明他们没有利益冲突。
Acknowledgments
没有。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
Taurine | Sigma | T0625-10G | |
Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
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