Summary
본 프로토콜은 높은 반복성과 효율성으로 망막 오가노이드의 접착 및 융합을 감소시키는 최적화된 3D 신경 망막 유도 시스템을 설명합니다.
Abstract
망막병증은 전 세계적으로 실명의 주요 원인 중 하나입니다. 망막병증의 발병기전을 조사하는 것은 망막병증의 조기 진단과 적시 치료에 필수적입니다. 불행히도 윤리적 장벽은 인간으로부터 증거를 수집하는 것을 방해합니다. 최근 수많은 연구에서 인간 만능 줄기세포(PSC)가 다양한 유도 프로토콜을 사용하여 망막 오가노이드(RO)로 분화될 수 있음을 보여주었으며, 이는 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 줄기 세포 기반 치료를 위한 망막병증에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구는 소포 형성 및 융합 가능성을 크게 줄여 60일까지 생산 성공률을 높이는 신경 망막(NR)을 생성하기 위한 최적화된 유도 프로토콜을 설명합니다. 특정 보완 요인과 결합된 해리 후 PSC의 자체 재구성 능력을 기반으로 하는 이 새로운 방법은 NR 분화를 구체적으로 유도할 수 있습니다. 또한, 이 접근법은 복잡하지 않고, 비용 효율적이며, 주목할 만한 반복성과 효율성을 보여주고, 망막 질환의 개인화된 모델에 대한 고무적인 전망을 제시하며, 세포 치료, 약물 스크리닝 및 유전자 치료 테스트와 같은 응용 분야를 위한 풍부한 세포 저장소를 제공합니다.
Introduction
눈은 인간의 감각 기관 중 주요 정보 공급원 역할을 하며, 망막은 포유류 눈의 주요 시각 감각 조직이다1. 망막병증은 전 세계적으로 안과 질환의 주요 원인 중 하나로, 실명을 유발한다2. 전 세계적으로 약 285만 명의 사람들이 망막병증으로 인한 다양한 정도의 시력 장애를 겪고 있습니다3. 따라서 발병 기전을 조사하는 것은 조기 진단과 시기 적절한 치료에 매우 중요합니다. 인간 망막증에 대한 대부분의 연구는 주로 동물 모델에 초점을 맞추고 있다 4,5,6. 그러나 인간의 망막은 다양한 세포 유형으로 구성된 복잡하고 다층 조직입니다. 기존의 2차원(2D) 세포 배양 및 동물 모델 시스템은 일반적으로 인간 망막의 정상적인 시공간 발달 및 약물 대사를 충실하게 재현하지 못합니다 7,8.
최근에는 3D 배양 기술이 발전하여 만능 줄기 세포(PSC)에서 조직과 유사한 장기를 생성하게 되었습니다.9,10. 3D 현탁 배양 시스템에서 인간 PSC로부터 생성된 망막 오가노이드(RO)는 7가지 망막 세포 유형을 포함할 뿐만 아니라 생체 내 인간 망막과 유사한 뚜렷한 층화 구조를 나타냅니다 11,12,13. 인간 PSC 유래 RO는 대중화되고 널리 보급되었으며 현재 인간 망막의 발달 및 질병을 연구하기 위한 최고의 시험관 모델입니다14,15. 지난 수십 년 동안 수많은 연구자들이 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한 인간 PSC가 다양한 유도 프로토콜을 사용하여 RO로 분화할 수 있음을 입증했습니다. 이러한 발전은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 줄기 세포 기반 치료를 위한 망막병증에서 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다 16,17,18.
그러나 인간 만능 줄기세포(PSC)에서 신경 망막(NR)을 생성하는 것은 복잡하고 번거로우며 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 또한, 조직 오가노이드의 배치 간 변이는 결과의 재현성을 낮출 수 있습니다19,20. 수많은 내인적 및 외인적 인자가 망막 오가노이드(RO)의 수율에 영향을 미칠 수 있으며, 이를테면 시작 세포의 수 또는 종, 전사 인자 및 소분자 화합물의 사용 21,22,23. 최초의 인간 RO가 사사이 실험실(11)에 의해 생성된 이래로, 유도 과정(13,21,24,25)의 용이성과 효과를 향상시키기 위해 수년에 걸쳐 여러 가지 변형이 제안되었다. 안타깝게도 현재까지 모든 실험실에서 RO를 생성하기 위한 표준 프로토콜은 확립되지 않았습니다. 실제로, RO에는 상이한 유도 방법으로 인한 어느 정도의 불일치가 있을 뿐만 아니라 망막 마커의 발현 및 구조의 견고성에 큰 차이가 있습니다22,26. 이러한 문제는 표본 채취와 연구 결과의 해석을 심각하게 복잡하게 만들 수 있습니다. 따라서 RO 생성의 이질성을 최소화하면서 효율성을 극대화하기 위해 보다 통합되고 강력한 차별화 프로토콜이 필요합니다.
이 연구는 Kuwahara et al.12 및 Döpper et al.27 의 조합을 기반으로 하는 최적화된 유도 프로토콜을 자세한 지침과 함께 설명합니다. 새로운 방법은 오가노이드 소포화 및 융합 가능성을 크게 줄여 NR 생성 성공률을 높입니다. 이 개발은 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 망막 장애에 대한 세포 치료 응용 분야에 큰 가능성을 가지고 있습니다.
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Protocol
이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었으며 중국 PLA 종합 병원의 기관 윤리 위원회의 승인을 받았습니다. WA09(H9) ESC 라인은 WiCell 연구소에서 입수했습니다.
1. 배양 배지 및 시약 준비
- 인간 ESC 배양 배지 및 통로 용액
- 유지 배지(MM): 500mL의 완전한 MM(기초 배지 + 5x 보충, 재료 표 참조)을 무균 상태로 준비합니다. 보충제 5배를 실온(RT)에서 또는 2-8°C에서 하룻밤 동안 해동합니다. RT로 예열하십시오. 보충제가 탁해지지 않을 때까지 사용 전에 잘 저어줍니다.
- 1% 세포외 기질(ECM): 사전 냉각된 피펫 팁과 멸균 튜브를 사용하여 튜브당 200μL의 ECM( 재료 표 참조)을 얼음에 분주합니다. 튜브를 -20°C 냉동고에 보관하십시오. ECM을 얼음 위에서 녹이고 1:100에서 사전 냉각된 DMEM/F12로 희석합니다.
- 0.5mM pH = 8.0 EDTA: 500mL의 0.5mM EDTA를 제조하려면 500μL의 0.5M EDTA와 0.9g의 NaCl을 1x Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS) 500mL에 추가합니다( 재료 표 참조). 잘 섞어서 2-8 °C에서 보관합니다.
- 망막 분화 배지
- 성장 인자가 없는 화학적으로 정의된 배지(gfCDM): 45% Iscove의 변형된 Dulbecco의 배지-글루타맥스(IMDM-GlutaMAX), 45% 함의 F12-글루타맥스(F12-Glutamax), 10% 녹아웃 혈청 치환제(KSR), 1% 콜레스테롤 지질 농축물 및 450μM 티오글리세롤을 혼합하여 gfCDM을 준비합니다( 재료 표 참조).
- 저분자 화합물
- Y-27632 2HCl: 50mL의 디메틸설폭사이드(DMSO) 3.122mL에 Y-27632 분말 50mg을 추가합니다. Y-27632( 재료 표 참조)를 -80°C에서 50mM 농도에서 2년 동안 빛을 피하고 투약 및 보관합니다. 사용을 위해 스톡을 2,500배(20μM)로 희석하여 gfCDM mL당 Y-27632 0.4μL에 해당합니다.
- IWR1-endo: DMSO 2.4424mL를 첨가하여 IWR1-endo 10mg을 용해시켜 10mM 원액을 얻습니다( 재료 표 참조). 분취액을 분주하고 -80°C에서 최대 2년 동안 보관합니다. 유도를 위해 3μM 농도에 대해 gfCDM mL당 0.3μL의 10mM IWR1-endo를 추가합니다.
- SB431542: 50mM SB431542 준비하려면 DMSO 0.5203mL에 SB431542 10mg( 재료 표 참조)을 넣고 잘 섞습니다. -80°C의 용매에서 최대 2년 동안 보관합니다. 10μM의 작업 농도에서 SB431542을 제조하려면 50mM 원액 2μL를 gfCDM 10mL에 첨가합니다.
- LDN-193189 2HCl: LDN-193189 2HCl 5mg( 재료 표 참조)을 DMSO 10.4297mL에 용해시켜 1mM의 원액을 얻습니다. -20 °C 또는 -80 °C에서 보관하십시오(제조업체 권장). gfCDM 10mL마다 0.1μL의 스톡을 추가하여 유도를 위해 100nM의 LDN-193189를 생성합니다.
- 재조합 인간 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4) : 4 mM HCl에서 50-200 μg / mL로 재구성합니다 ( 재료 표 참조). 재구성 후 2 °C에서 8 °C에서 1 개월 동안 또는 -20 °C에서 1 년 동안 보관하십시오. 1.5nM BMP4를 사용하여 NR 유도를 수행합니다.
- 장기 NR 배양 배지
- 레티노산(RA): RA 분말 6mg을 측정하고( 재료 표 참조) DMSO 3.9941mL에 첨가합니다. -80 °C에서 5 mM의 부분 표본으로 보관하고 3개월 이내에 사용하십시오. 0.5μM의 작업 농도를 달성하려면 마스터 믹스 10μL를 100mL의 신경 망막 분화 배지(NRDM)에 첨가합니다. 사용 직전에 추가하십시오.
알림: 준비 및 보관 중에는 빛을 피하십시오. - 타우린: 200 mg의 타우린 분말( 재료 표 참조)을 7.9904 mL의 DMSO에 첨가하여 200 mM 원액을 얻습니다. 2-8 °C에서 분배 및 보관하십시오. NRDM 100mL당 50μL의 원액을 첨가하여 0.1mM 타우린의 작업 농도를 달성합니다.
- NRDM: DMEM/F12-GlutaMAX 배지, 1% N2 보충제, 10% 소 태아 혈청, 0.5mM RA 및 0.1mM 타우린으로 NRDM을 구성합니다( 재료 표 참조). 구성 요소의 활성을 보장하기 위해 2-8 °C에서 최대 2 주 또는 -20 °C에서 6 개월 동안 보관하십시오.
- 레티노산(RA): RA 분말 6mg을 측정하고( 재료 표 참조) DMSO 3.9941mL에 첨가합니다. -80 °C에서 5 mM의 부분 표본으로 보관하고 3개월 이내에 사용하십시오. 0.5μM의 작업 농도를 달성하려면 마스터 믹스 10μL를 100mL의 신경 망막 분화 배지(NRDM)에 첨가합니다. 사용 직전에 추가하십시오.
- 차단 완충액: DPBS로 1:9로 희석하여 사용할 10% 작동 용액을 얻습니다( 재료 표 참조). -20 °C에서 최대 5년간 보관하십시오.
알림: 무게를 제외한 무균 상태를 보장하기 위해 Class II Biosafety Cabinet에서 다른 모든 절차를 수행하십시오. 준비 과정에서 계량된 시약을 추가해야 하는 경우 여과를 위해 0.22μm 필터를 사용하십시오.
2. H9-ESC의 배양
- H9-ESC의 해동
- 1-웰 플레이트의 각 웰에 1% ECM 1mL를 추가합니다. 5%CO2 분위기의 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
알림: ECM은 표면에 달라붙을 수 있으므로 우물 벽을 따라 ECM을 추가하지 마십시오. - 액체 질소 탱크에서 H9-ESC 극저온 스톡을 꺼내 37°C 물에서 30초 동안 빠르게 흔듭니다.
알림: 바이알이 완전히 해동되지 않도록 하십시오. - 바이알을 제거하고 75% 소독 알코올 스프레이를 사용하여 조심스럽게 살균합니다. 극저온에서 해동된 H9-ESC를 10μM Y-27632를 사용하여 9mL MM이 들어 있는 15mL 튜브에 추가합니다.
- RT에서 190× g 에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다. 세포 손실을 방지하기 위해 약 50μL의 상층액을 남기고 1mL 피펫으로 대부분의 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
- 세포 침전물에 10μM의 Y27632가 포함된 MM 1mL를 추가하고 피펫팅을 위아래로 5-10회 수행하여 1mL 피펫으로 세포 침전물을 부드럽게 재현탁합니다.
- 배양 1시간 후 ECM 코팅을 제거합니다. 각 웰에 10μM Y-27632를 포함하는 예열된 MM 2mL를 추가합니다.
- 웰당 0.5mL의 세포 현탁액을 분주합니다. 세포가 고르게 분포되도록 플레이트를 옆으로 부드럽게 흔듭니다.
- 플레이트를 만지지 않고 37 ° C에서 5 % CO2 미만으로 최소 24 시간 동안 배양합니다.
- 매일 매체를 바꾸십시오. 클론 밀도가 70% 이상에 도달하면 패세이징이 필요합니다.
- 1-웰 플레이트의 각 웰에 1% ECM 1mL를 추가합니다. 5%CO2 분위기의 37°C의 인큐베이터에서 1시간 동안 배양합니다.
- H9-ESC의 패세이징
- 위에서 설명한 대로 ECM 코팅 플레이트를 준비하고(단계 2.1.1) 웰당 2mL의 MM을 추가합니다.
- 6웰 플레이트에서 사용한 배지를 제거합니다. DPBS 1mL로 각각 두 번 잘 씻습니다.
- 1mL의 EDTA를 천천히 첨가하고 RT에서 4-7분 동안 1mL의 EDTA로 배양하여 각각을 두 번 잘 씻습니다.
알림: 배양하는 동안 현미경으로 6웰 플레이트를 3분 동안 검사합니다. 대부분의 세포가 접시에서 거의 분리되는 경우 즉시 다음 단계로 진행하십시오. 세포에 대한 부정적인 영향을 줄이기 위해 장시간 배양을 피하십시오. - EDTA를 버리고 MM 1mL를 추가하여 분해를 중단합니다.
- 대부분의 셀이 분리될 때까지 웰 플레이트를 부드럽게 두드립니다.
- 세포 현탁액을 5mL 피펫이 있는 15mL 원심분리 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. H9-ESC 콜로니를 위아래로 부드럽게 3-5회 재현탁하여 파스퇴르 피테트와 혼합합니다. 20-100 μL의 세포 현탁액을 새로운 ECM 코팅 6웰 배양 접시에 옮기고 앞뒤로 흔듭니다.
- 현미경으로 세포 밀도가 충분한 것으로 관찰되면 플레이트를 만지지 않고 37 % CO2 % 미만에서 최소 24 시간 동안 배양합니다.
- 매일 미디어를 교체하십시오. 클론 밀도가 70% 이상이면 통과가 필요합니다.
3. 인간 NR 생성
참고: 콜로니가 약 70%의 합류를 달성하면 그림 1에 설명된 절차 단계를 사용하여 망막 오가노이드(RO)로 분화할 수 있습니다.
- 0일차 - 배아체(EB) 형성
- 2mL의 DPBS로 세포를 세척한 후 20μM Y27632를 포함하는 0.5mL의 CDS( 재료 표 참조)를 웰에 추가합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
알림: 현미경으로 확인하십시오. 세포에 대한 유해한 영향을 피하기 위해 가능한 한 배양 시간을 줄이십시오. - 20μM Y27632를 함유한 MM 3mL를 추가하여 분해를 중단합니다. 190× g 에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다.
- 20μM Y27632를 함유하는 gfCDM 1mL에 세포 펠릿을 재현탁시키고 세포를 계수합니다. 20 μM Y-27632, 3 μM IWR1-endo, 10 μM SB431542 및 100 nM LDN-193189와 사전 통합된 10 mL의 gfCDM에 1.2 × 106 세포(웰당 1.2 ×10 4 세포)에 대한 해당 부피를 추가합니다( 재료 표 참조).
- 100μL의 셀 현탁액을 96V 바닥 원뿔형 웰의 각 웰에 추가합니다. 플레이트를 가습된 5% CO2 인큐베이터에 6일까지 놓습니다.
알림: EB의 접착력을 높이기 위해 최소 24시간 동안 접시를 움직이지 마십시오.
- 2mL의 DPBS로 세포를 세척한 후 20μM Y27632를 포함하는 0.5mL의 CDS( 재료 표 참조)를 웰에 추가합니다. 가습된 5%CO2 인큐베이터에서 37°C에서 3분 동안 배양합니다.
- 6일째 - 망막 유도
- 6일째에 55ng/mL BMP4가 포함된 gfCDM 10mL를 추가하여 EB에서 배양 배지를 완전히 변경할 수 있습니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
알림: 기포를 피하기 위해 96 V-바닥 원뿔형 웰의 벽을 향해 피펫을 넣습니다. 매체를 변경할 때 오가노이드를 사용하지 마십시오. - 9일째, 12일째 및 15일에 중간 정도의 변화를 실시합니다. 배지의 절반을 새 gfCDM으로 교체하여 BMP4를 점차적으로 희석합니다.
- 6일째에 55ng/mL BMP4가 포함된 gfCDM 10mL를 추가하여 EB에서 배양 배지를 완전히 변경할 수 있습니다. 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
- 18일째 - 장기적인 NR 문화
- 18일째에 5mL 파스퇴르 피펫을 사용하여 형성된 EB를 15mL 원심분리 튜브로 조심스럽게 옮기고 NRDM으로 다시 부드럽게 헹굽니다. EB를 저흡착 6웰 또는 24웰 플레이트로 옮깁니다( 재료 표 참조). 플레이트를 인큐베이터로 되돌립니다.
- 배지를 3일마다 새 NRDM으로 교체하십시오.
알림: RA는 빛에 민감하므로 매체 변경 중에는 조명을 끄십시오. 심하게 분화된 오가노이드를 제거하고 부착된 오가노이드를 현미경으로 분리합니다.
4. 인간 NR 분석
- RO 장착
- 서로 다른 세대의 H9-ESC를 선택하여 3개의 RO 배치를 유도합니다.
참고: 유도 성공률을 평가하기 위해 세 가지 평가된 방법(Kuwahara et al.12, Döpper et al.27 및 본 연구에서 수정된 방법) 각각에 대한 형성 NR의 수를 세 개의 플레이트로 계산합니다. 유도는 광학 현미경 검사에서 30일째에 신경 상피와 같은 구조의 형성이 밝혀지면 성공적인 것으로 간주됩니다.
- 서로 다른 세대의 H9-ESC를 선택하여 3개의 RO 배치를 유도합니다.
- RO의 면역형광 염색
- 3-5 RO를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 과도한 배지를 피펫팅하고 RT에서 1mL의 DPBS로 RO를 한 번 세척합니다. RO가 가라앉도록 하고 DPBS를 조심스럽게 제거합니다. 1.5mL 튜브당 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조) 1mL를 추가하고 4°C에서 고정합니다.
알림: 6일차와 18일차의 RO, 2시간 수정. 12일째에 30시간, 14일째에 60시간 동안 수정합니다. - 고정 후 그라디언트 알코올을 사용하여 탈수하십시오. RO를 15%, 50% 및 60% 알코올에 각각 70분 동안 그대로 둔 다음 10, 80%, 90%, 95% 및 100% 알코올에 각각 100분 동안 그대로 둡니다. 그런 다음 100% 알코올과 자일렌을 1:1로 섞어 10분 동안 넣은 다음 자일렌을 각각 10분 동안 두 번 넣습니다.
- 녹은 파라플라스트( 재료 표 참조)로 채워진 금속 주형에 RO를 40분 동안 놓은 다음 얼음 위에서 주형을 담금질하여 RO를 고정합니다. 임베딩 상자를 금형에 넣고 -20°C에서 밤새 얼립니다. 그런 다음 임베딩 상자를 조심스럽게 분리합니다. 마지막으로 RT에 보관하십시오.
- 파라핀 슬라이서를 사용하여 연속 단면(5μm 두께)을 생성합니다. 접착 현미경 슬라이드에 슬라이스를 고정하고 건조시킨 후 RT에 보관합니다.
- 항원 복구 전에 탈랍 및 재수화를 수행하십시오12,27.
- 190mL의 ddH2O (이중 증류 H2O)에 20x pH 6.0 구연산염 항원 회수 용액 10mL(재료 표 참조)를 추가합니다. 끓을 때까지 4분 동안 고속으로 전자레인지에 가열합니다. 파라핀 절편을 추가한 후 절편을 로우 모드로 20분 동안 가열하여 항원 복구를 완료합니다.
- 파라핀 부분을 통풍이 잘되는 곳에서 자연적으로 식힌 다음 습한 챔버에 넣으십시오.
- pap 펜( 재료 표 참조)을 사용하여 섹션의 윤곽을 그립니다. 0.2% Triton X-100으로 상온에서 30분 동안 배양하여 멤브레인을 파괴한 다음 슬라이드를 TPBS로 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
- 염색 영역당 10μL의 습한 챔버에서 RT에서 1시간 동안 DPBS에 희석된 10% 당나귀 혈청으로 차단합니다.
- 10% 당나귀 혈청에 희석된 1차 항체를 추가합니다. 습도 챔버에서 4 °C에서 밤새 배양합니다. TPBS로 샘플을 각각 10분 동안 3회 세척하여 결합되지 않은 항체를 제거합니다.
참고: 1차 항체는 다음과 같다: anti-PAX6 (1:250), anti-SOX2 (1: 200), anti-KI67 (1: 200), anti-CHX10 (1: 200), anti-β tubulin III (1: 250) 및 anti-NESTIN (1: 200) ( 자료표 참조). - DPBS에 희석된 2차 항체와 함께 가습 챔버에서 RT에서 1시간 동안 배양합니다. TPBS로 각각 10분씩 세 번 세탁 단계를 반복합니다.
참고: 형광 2차 항체의 소멸을 방지하기 위해 어두운 곳에 보관하십시오. 2차 항체는 당나귀 항-마우스 IgG와 결합된 Alexa Fluor 488 및 1:400의 희석액으로 당나귀 항-토끼 IgG와 접합된 Alexa Fluor 568입니다( 재료 표 참조). - DAPI(1:500, 재료 표 참조)를 함유한 DPBS로 어두운 곳에서 RT에서 10분 동안 배양합니다. TPBS로 각각 10분씩 3회 세척합니다.
- 적당량의 형광 방지 실러( 재료 표 참조)를 슬라이드에 떨어뜨리고 커버 슬립으로 덮습니다.
- 흐름과 유사한 조직 세포 정량 분석기( 재료 표 참조) 또는 이와 유사한 것을 사용하여 시각화합니다.
- 현미경 분석 후 슬라이드를 -20 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
- 3-5 RO를 1.5 mL 튜브로 옮깁니다. 과도한 배지를 피펫팅하고 RT에서 1mL의 DPBS로 RO를 한 번 세척합니다. RO가 가라앉도록 하고 DPBS를 조심스럽게 제거합니다. 1.5mL 튜브당 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조) 1mL를 추가하고 4°C에서 고정합니다.
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Representative Results
수정된 프로토콜의 그래픽 개요는 그림 1에 나와 있습니다. H9-ESC는 세포가 70%-80%의 밀도로 성장했을 때 RO를 생성하는 데 사용되었습니다. 96개의 V-바닥 원뿔형 웰에서 H9-ESC의 단일 세포 현탁액은 1일차에 집계되고 6일째에 잘 둘러싸인 원형 EB를 형성했습니다. 배양 시간이 증가함에 따라 EB의 부피가 점차 증가했습니다. 30일째에, 신경상피와 같은 구조가 장기간의 NR 분화 동안 명확하게 형성되고 두꺼워졌습니다.
또한, 수정된 방법을 다른 두 가지 방법(Kuwahara et al.12 및 Döpper et al.27)과 비교하여 반복성 및 효율성을 평가했습니다(보충 그림 1). 이 연구는 또한 수정된 방법 후 1일차의 EB의 형태가 다른 두 방법보다 약간 더 나쁘다는 것을 관찰했습니다. 그러나 수정된 방법을 사용하여 형성된 신경 상피 구조는 18일째에 더 연속적이었습니다(그림 2). 30일째에 수정된 방법을 사용하여 얻은 초기 NR은 모양과 크기가 유사했으며 규칙적인 둥근 모양을 보였습니다(그림 3). 다른 두 가지 방법에 비해 수정된 방법에 의해 형성된 NR은 소포 및 접착 발생률이 낮았습니다. 또한, H9-ESC를 기반으로 수정된 방법을 사용하여 NR을 생성하는 성공률은 Kuwahara et al. 및 Döpper et al.의 방법12,27에 대해 각각 26.9% 및 69.24%에서 87.39%로 증가했습니다(그림 3M).
망막 발달과 관련된 마커의 발현을 평가하기 위해 NR의 파라핀 포매 절편에 대해 면역형광 염색을 수행했습니다(그림 4). 그 결과, 변형된 방법을 사용하여 H9-ESC에서 유래한 NR에서 망막과 관련된 인간 유전자의 발현을 보여주었습니다. 가장 먼저 나타나는 세포 아형은 망막 신경절 세포(retinal ganglion cell)로, 주로 NR의 기저면에 축적되었습니다. TUJ1 염색은 망막 신경절 세포의 축삭돌기를 식별하는 데 사용되었습니다(그림 4I-L). 또한, 망막 전구 세포의 마커는 내부(PAX6+)와 외부(CHX10+) 층 모두에서 검출되었습니다(그림 4A-H). 증식 마커 KI67에 양성인 세포는 외층에 분포되어 있었습니다(그림 4A-D).
그림 1: 회로도 개요. 수정된 배양 프로토콜의 개략적인 개요는 특정 시점에서 다양한 요인의 추가와 신경 망막 발달의 대표 이미지를 보여줍니다. SFEBq: 빠른 재응집이 있는 배아체 유사 응집체의 무혈청 부유 배양; KSR: 녹아웃 혈청 교체; gfCDM: 성장 인자가 없는 화학적으로 정의된 배지; NRDM: 신경 망막 분화 배지; BMP4 : 뼈 형태 유전 단백질 4. 스케일 바 : 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 초기 단계에서 세 가지 다른 프로토콜에서 파생된 망막 오가노이드의 대표적인 명시야 이미지. 1일차에는 수정된 메서드만 EB(A,E,I)에서 수행되지 않았습니다. 6일째 되는 날, EB는 세 가지 방법(B,F,J) 모두에서 형성되었습니다. 18일째 되는 날, 초기 신경 망막이 형성되었고, 세 가지 유도 방법(C,G,K) 중에서 서로 다른 형태가 발견되었습니다. 21일째 되는 날, 변형된 방법으로 생성된 신경망막은 연속적인 신경상피구조(D,H,L)를 보였다. 스케일 바: 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 30일, 45일, 60일째의 현탁액 배양에서 성숙한 3D 신경 망막. 30일째 되는 날, 세 가지 방법(A,E,I) 모두에서 신경 망막이 형성되었습니다. 화살표는 Kuwahara et al.의 방법(B)에서 낭포성 구조를 나타냅니다. 흰색 점선 상자는 오가노이드 간의 접착 및 융합 영역(D,F,H)을 나타냅니다. 변형된 프로토콜에서 생성된 망막 오가노이드는 다른 두 가지 방법(C,G,J,K,L)에 비해 크기와 형태가 유사합니다. 눈금 막대: 100 μm(흰색); 200μm(검은색). H9-ESC(M)를 사용한 세 가지 방법에 의한 유도 성공률의 통계 차트. 유의성을 검정하기 위해 일원 분산 분석이 사용되었습니다(오차 막대는 표준 오차, n = 864, **P < 0.01, ***P < 0.001을 나타냄). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 수정된 프로토콜에서 신경 망막의 특성화. 6일, 18일, 30일 및 60일에 신경 망막의 면역염색 이미지. 녹색 염색은 KI67(증식 세포), PAX6(망막 전구 세포) 및 NESTIN(신경 줄기 세포)에 대한 것입니다. 적색 염색은 CHX10(망막 전구 세포), SOX2(신경 전구 세포) 및 TUJ1(망막 신경절 세포)에 대한 것입니다. 눈금 막대: 100 μm (A,B,E,F,I,J); 200μm(C,D,G,H,K,L)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 1: 세 가지 망막 오가노이드 유도 프로토콜에 대한 흐름도 비교. SFEBq: 빠른 재응집이 있는 배아체 유사 응집체의 무혈청 부유 배양; KSR: 녹아웃 혈청 교체; gfCDM: 성장 인자가 없는 화학적으로 정의된 배지; NRDM: 신경 망막 분화 배지; BMP4: 뼈 형태 유전 단백질 4. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 2: Kuwaharaet al.의 방법에 의해 유도된 배아체(EB)의 형태. 죽은 세포 덩어리의 점진적인 출현은 6일째에 BMP4를 추가한 후 EB 주변에서 관찰되었습니다(A-D, 검은색 화살표). 6일째(E-L) 이후 큰 형태학적 차이가 관찰되었으며 일부 EB는 완전히 비활성화되었습니다(H,L). ESC: 배아줄기세포, PBMC: 말초혈액 단핵세포, IPSC: 유도만능줄기세포. 스케일 바: 200 μm. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
인간 RO는 태아 망막의 발달을 공간적, 시간적으로 재현할 수 있으며, 초기 RO는 동등한 발달 단계에서 태아 망막과 높은 수준의 유사성을 나타낸다15. 조직 형태 및 분자 발현 측면에서 인간 RO는 망막 조직의 실제 성장 상태를 밀접하게 반영하여 질병 모델링, 약물 스크리닝 및 재생 의학 분야에서 전례 없는 엄청난 기회를 제공합니다. 현재, in vitro에서 인간 PSC로부터 RO를 생성하기 위한 여러 가지 방법이 확립되어 있으며, 효율성을 더욱 향상시키기 위해 지속적인 수정 및 최적화가 진행되고 있다9. 사사이 실험실은 인간 ESC11로부터 PSC 유래 RO의 생성을 처음으로 보고했다. 인간 ESC를 먼저 단일 세포 현탁액으로 준비한 다음 동일한 수의 세포를 96개의 V-바닥 원뿔형 웰에 파종하고 빠르게 응집하여 원형과 유사한 EB를 형성했습니다. 주요 세포 신호 전달 경로의 외부 추가는 EB에서 시신경 소포의 형성을 촉진했으며, 이는 이후 현탁 배양에서 적층 RO로 성숙했습니다. NR은 1개의 신경교세포(glial cell) 유형과 6개의 서로 다른 신경세포(neuronal cell)를 포함하며, 세포 형태형성(cellpogenesis), 뉴런 분화(neuron differentiation), 정점-기저극성(apical-basal polarity)과 같은 망막 발달의 여러 측면을 나타낸다9. 응집체의 10%만이 이중벽 광학 컵 구조를 형성했지만, 이는 더 발전된 RO를 생산하는 진화의 중요한 이정표였습니다11.
그 후, Zhong et al.은 hiPSC가 먼저 합류점 근처에서 성장한 다음 화학적 또는 기계적 분해를 부유하는 작은 응집체로 분해하는 새로운 대안을 도입했습니다13. 그런 다음 작은 응집체는 현탁 배양에서 EB를 형성하여 플레이트 바닥에서 별도로 분리되어 신경 방향으로 더욱 분화되었습니다. Zhong et al.은 빛 자극에 반응하는 비교적 잘 발달된 광수용체 외부 세그먼트를 가진 완전히 적층된 3D 망막을 시연했습니다. 이 방법은 세포 신호전달 경로에 대한 외부 조절을 덜 필요로 하며, 주로 자기 주도적 방식으로 수행되었다9. 세 번째 기술 혁명은 Lowe group25의 임베딩 방법의 도입이었습니다. 여기에는 단일 내강 상피 구조를 형성하기 위해 ECM에 hESC 응집체를 포함시키는 것이 포함되었습니다. 효소 분산 후, 응집체를 현탁 배양에서 유지하여 성숙한 RO를 형성하였다. 세 가지 방법 모두 유사한 구조와 기능을 가진 RO를 성공적으로 유도할 수 있지만, 대규모 응용 분야는 높은 이질성과 낮은 성공률로 인해 시간과 노력이 많이 소요되는 단점이 있다23.
위의 방법 외에도 Kuwahara et al.은 새로운 유도 방법, 즉 핵심 요인 기울기 감소 방법12을 제안했습니다. 그들은 NR이 6일째부터 농도가 감소하는 BMP4를 첨가하여 생성될 수 있음을 발견했습니다. 이 유도 시스템은 크기와 형태의 균일성이 증가한 RO를 형성하기 위해 더 적은 외부 요인을 사용했습니다. 그러나 연구에 따르면 형성된 EB는 낭포성 병변이 발생하기 쉬우며 이 방법의 유도 성공률은 약 40%12,28였습니다. Döpper et al.은 EB를 안정화시키기 위해 유도의 초기 단계에서 상업용 배지와 3개의 저분자 억제제를 결합함으로써 성공률을 향상시키기 위해 이 프로토콜을 수정하였다(27). 대조적으로, 망막의 신경 상피의 세포는 서로 더 쉽게 부착되므로 장기 현탁 배양 중에 각 RO의 별도 배양이 필요합니다. Döpper et al.의 방법은 실험 작업의 복잡성과 비용을 증가시키며 대규모 유도에 적합하지 않다27. 최적화된 RO 생산 프로토콜은 유도 효율을 향상시켰습니다. 현재 수정된 방법을 Kuwahara et al. 및 Döpper et al.의 방법과 비교하였다.
이 연구는 Kuwahara et al.과 Döpper et al.의 방법 모두 1일차에 부드러운 가장자리를 가진 EB를 형성하는 반면, 현재 수정된 방법은 EB를 형성하는 데 대략 6일차까지 비교적 긴 시간이 필요하다는 것을 보여주었습니다. Kuwahara et al.의 방법을 사용하여 얻은 EB의 부피는 Döpper et al.의 방법을 사용하여 얻은 것보다 컸으며, Döpper et al.의 방법을 사용하여 얻은 EB는 액체 흐름 하에서 증가된 유동성을 보여주었습니다. 특히, Kuwahara et al.의 방법을 사용할 때 6일째에 BMP4를 첨가한 후 EB 주변에 죽은 세포 덩어리가 점차적으로 나타났습니다(보충 그림 2). 18일째가 되자, Kuwahara et al.의 방법의 EB에서 유의미한 형태학적 차이가 관찰되었으며, 일부 EB는 완전히 비활성화되었습니다(보충 그림 2). Döpper et al.의 방법에서 대부분의 EB는 둥글고 잘 둘러싸여 있었으며 주변에 흩어져 있는 죽은 세포가 소수에 불과했습니다. 수정된 방법은 약간의 형태학적 차이를 가진 단단하고 잘 구조화된 EB를 형성했으며 그 주변에서 몇 개의 죽은 세포가 관찰되었습니다.
또한, 이 연구는 Kuwahara et al.에 의해 6웰 플레이트로 전달된 후 초기 단계에서 일부 EB가 소포를 생성하여 RO를 형성하지 못한다는 것을 발견했습니다. RO의 접착 및 융합은 40일째 경에 발생하여 실험의 유용성을 크게 감소시켰습니다. Döpper et al.의 방법의 배양 시스템은 Kuwahara et al.의 방법보다 더 복잡하고 더 많은 운영 단계와 더 높은 비용이 필요합니다. Döpper et al.의 RO의 대다수는 필연적으로 서로 접착 및 융합을 일으켰습니다. 이 연구에서 수정된 방법은 인간 망막 관련 마커 CHX10, KI67, PAX6, SOX2, TUJ1 및 NESTIN을 발현하는 시험관 내 3D NR을 성공적으로 생성했습니다. 그리고 변형된 방법에 의한 대부분의 RO는 크기와 형태가 일치했으며, 망막 분화의 후기 단계에서 발생한 소포 또는 유착은 거의 없었습니다.
다른 두 가지 방법에 비해 새로운 배양 시스템은 운영 단계가 더 간단하고 비용이 저렴했습니다. 수정된 분석법의 중요한 단계는 3개의 저분자 억제제를 배지에 첨가하고 EB의 구조를 안정화하기 위해 처음 6일 동안 플레이트가 움직이지 않도록 하는 것입니다. 초기 단계의 플레이트 이동 또는 세포 조작은 EB 형성에 영향을 미칠 수 있습니다. 다른 두 가지 방법과 비교했을 때, 수정된 방법은 1일째에 배지를 바꾸지 않았고 15일째에 저분자 억제제의 사용도 줄였습니다. 요컨대, 수정된 방법의 작업 단계가 어느 정도 단순화되고 배지 및 시약의 사용이 줄어들어 실험 비용이 절감됩니다. 그러나 수정된 방법은 여전히 현재 오가노이드 배양 시스템의 일반적인 문제를 해결할 수 없습니다. 또한 RO 유도 효율은 hPSC의 품질과 차별화 능력에 크게 좌우됩니다. 본 연구에서는 H9-ESC를 이용한 NR 생성의 효율만을 완전히 계산하였다. 본 연구에서 새로운 방법으로 다양한 hPSC 라인에서 RO를 성공적으로 유도하고 H9, H1 및 PBMC-iPSC를 포함하여 동일한 유도 효율을 달성했습니다. 세 세포주 간의 유도 효율에는 통계적 차이가 없습니다. 앞으로 더 많은 연구에서 이 방법을 사용하여 다양한 hPSC의 유도 효율을 조사해야 합니다.
결론적으로, 최적화된 망막 유도 프로토콜은 간단하고 저렴하며, 반복성과 효율성이 높고, 망막 질환에 대한 유망한 맞춤형 모델을 제공하며, 세포 치료, 약물 스크리닝 및 유전자 치료 검사를 위한 풍부한 세포 공급원을 제공합니다.
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Disclosures
모든 저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
없음.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
References
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