基于CRISPR的模块化组装用于UAS-cDNA/ORF质粒文库的高通量构建
Summary
我们提出了一种基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）方案，这是一种使用公开可用的cDNA/ORF资源在 果蝇 中高通量构建UAS-cDNA/ORF质粒库的方法。CRISPRmass可用于编辑各种质粒文库。
Abstract
功能基因组学筛选为探测基因功能提供了一种强大的方法，并依赖于全基因组质粒库的构建。传统的质粒文库构建方法既费时又费力。因此，我们最近开发了一种简单高效的方法，即基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass），用于高通量构建全基因组上游激活序列互补DNA/开放阅读框（UAS-cDNA/ORF）质粒库。在这里，我们提出了一种CRISPRmass的方案，以构建基于GAL4 / UAS的UAS-cDNA / ORF质粒库为例。该方案包括大规模平行的两步试管反应，然后是细菌转化。第一步是使用 CRISPR/Cas9 和单向导 RNA （sgRNA） 切割与 cDNA 或 ORF 的 5′ 端相邻的共享上游载体序列，对现有的互补 DNA （cDNA） 或开放阅读框 （ORF） cDNA 或 ORF 文库质粒进行线性化，第二步是使用一步反应将 UAS 模块插入线性化的 cDNA 或 ORF 质粒中。CRISPRmass可以简单、快速、高效且经济高效地构建各种质粒文库。UAS-cDNA/ORF 质粒文库可用于培养细胞中的功能获得性筛选，以及在 果蝇中构建全基因组转基因 UAS-cDNA/ORF 文库。
Introduction
无偏倚的全基因组基因筛选是识别参与特定生物过程的基因并阐明其机制的有力方法。因此，它在生物学研究的各个领域都有广泛的应用。大约 60% 的果蝇基因在人类 1,2 中是保守的，而 ~75% 的人类疾病基因在果蝇3 中具有同源物。基因筛查主要分为功能丧失（LOF）和功能获得（GOF）两种类型。果蝇中的LOF遗传筛选在阐明控制生物学几乎每个方面的机制方面发挥了关键作用。然而，大多数果蝇基因没有明显的LOF表型4，因此，GOF筛选是研究这些基因功能的重要方法4,5。
二元 GAL4/UAS 系统通常用于 果蝇6 中的组织特异性基因表达。在该系统中，组织特异性表达酵母转录激活因子 GAL4，该激活因子与 GAL4 反应元件 （UAS） 结合，从而激活下游遗传成分（例如 cDNA 和 ORF）6 的转录。为了在 果蝇中进行全基因组GOF筛选，我们需要构建全基因组UAS-cDNA/ORF质粒文库，然后构建果 蝇转基因UAS-cDNA/ORF文库。
通过常规方法从公开的cDNA/ORF克隆中构建全基因组UAS-cDNA/ORF质粒库既费时又费力，因为每个基因都需要个体化设计，包括引物设计和合成、聚合酶链反应（PCR）和凝胶纯化、测序、限制性酶切等7,8.因此，构建这样的质粒文库是在果蝇中创建全基因组转基因UAS-cDNA/ORF文库的限速步骤。最近，我们通过开发一种新方法，即基于CRISPR的模块化组装（CRISPRmass）9，成功地解决了这个问题。CRISPRmass的核心是通过基因编辑技术和无缝克隆技术的结合，操纵质粒库的共享载体序列。
在这里，我们提出了CRISPRmass的协议，其中包括大规模并行的两步试管反应，然后是细菌转化。CRISPRmass是一种简单、快速、高效且具有成本效益的方法，原则上可用于各种质粒文库的高通量构建。
CRISPRmass策略
CRISPRmass的程序从 大肠杆菌 （大肠杆菌）转化之前的平行两步试管反应开始（图1）。第 1 步是通过 Cas9/sgRNA 切割 cDNA/ORF 质粒的相同载体骨架。理想的切割位点位于 cDNA/ORF 的 5′ 末端附近。裂解产物无需纯化。第 2 步是通过 Gibson 组装将载体特异性 UAS 模块插入到 Cas9/sgRNA 线性化的 cDNA/ORF 质粒中（以下简称单步反应），得到 UAS-cDNA/ORF 质粒。UAS 模块的 5′ 和 3′ 末端序列与线性化 cDNA/ORF 质粒的序列重叠，可实现一步反应。
一步反应产物直接进行 大肠杆菌 转化。从理论上讲，只有所需的 UAS-cDNA/ORF 菌落才能在含有对应于 UAS 模块抗生素耐药基因的选择性抗生素的 Luria-Bertani （LB） 平板上生长。UAS 模块由核心 UAS 模块、不同于 cDNA 或 ORF 质粒的抗生素抗性基因以及 5′ 和 3′ 末端序列组成。核心 UAS 模块包括 10 个 UAS 拷贝、一个 Hsp70 最小启动子、一个用于 phiC31 介导的基因组整合的 attB 序列和一个用于 果蝇7 的迷你白色转化标记。
Protocol
Representative Results
Discussion
CRISPRmass最关键的步骤是sgRNA的设计和sgRNA的评估。为 Cas9 选择高效的 sgRNA 是 CRISPRmass 成功的关键。如果在用单步反应组装产物转化大肠杆菌后，在大多数含抗生素的LB平板上观察到很少或没有菌落，则通过琼脂糖凝胶电泳检查质粒消化。如果质粒未得到良好消化，则检查Cas9活性、sgRNA降解和质粒质量;如果质粒消化良好，则检查单步反应组装试剂，并确保感受态细胞的转化效率至少为 1 x 108…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作由国家自然科学基金（32071135和31471010）、上海浦江计划（14PJ1405900）和上海市自然科学基金（19ZR1446400）资助。
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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