Assemblaggio modulare basato su CRISPR per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF
Summary
Presentiamo un protocollo per l’assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), un metodo per la costruzione ad alto rendimento di librerie plasmidiche UAS-cDNA/ORF in Drosophila utilizzando risorse cDNA/ORF disponibili pubblicamente. CRISPRmass può essere applicato alla modifica di varie librerie di plasmidi.
Abstract
Lo screening genomico funzionale offre un approccio potente per sondare la funzione genica e si basa sulla costruzione di librerie di plasmidi a livello di genoma. Gli approcci convenzionali per la costruzione di librerie di plasmidi richiedono molto tempo e laboriosità. Pertanto, abbiamo recentemente sviluppato un metodo semplice ed efficiente, l’assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass), per la costruzione ad alto rendimento di una libreria di plasmidi di DNA attivante sequenziale complementare a livello di genoma/open reading frame (UAS-cDNA/ORF). Qui, presentiamo un protocollo per CRISPRmass, prendendo come esempio la costruzione di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF basata su GAL4/UAS. Il protocollo include reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele seguite da trasformazione batterica. Il primo passo consiste nel linearizzare il DNA complementare (cDNA) esistente o i plasmidi della libreria ORF o del cDNA a telaio di lettura aperto (ORF) tagliando le sequenze vettoriali condivise a monte adiacenti all’estremità 5′ dei cDNA o degli ORF utilizzando CRISPR/Cas9 insieme all’RNA guida singola (sgRNA), mentre il secondo passo consiste nell’inserire un modulo UAS nei plasmidi linearizzati del cDNA o dell’ORF utilizzando una reazione a passo singolo. CRISPRmass consente la costruzione semplice, veloce, efficiente ed economica di varie librerie di plasmidi. La libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF può essere utilizzata per lo screening del guadagno di funzione in cellule in coltura e per la costruzione di una libreria UAS-cDNA/ORF transgenica a livello di genoma in Drosophila.
Introduction
Lo screening genetico imparziale dell’intero genoma è un approccio potente per identificare i geni coinvolti in un determinato processo biologico e chiarirne il meccanismo. Pertanto, è ampiamente utilizzato in vari campi della ricerca biologica. Circa il 60% dei geni di Drosophila sono conservati nell’uomo 1,2 e ~75% dei geni delle malattie umane hanno omologhi in Drosophila3. Lo screening genetico si divide principalmente in due tipi: perdita di funzione (LOF) e guadagno di funzione (GOF). Gli screening genetici LOF in Drosophila hanno svolto un ruolo fondamentale nel chiarire i meccanismi che governano quasi ogni aspetto della biologia. Tuttavia, la maggior parte dei geni di Drosophila non ha evidenti fenotipi LOF4 e, pertanto, lo screening GOF è un metodo importante per studiare la funzione di quei geni 4,5.
Il sistema binario GAL4/UAS è comunemente usato per l’espressione genica tessuto-specifica in Drosophila6. In questo sistema, il tessuto esprime specificamente l’attivatore della trascrizione del lievito GAL4 che si lega all’elemento responsivo GAL4 (UAS) e quindi attiva la trascrizione dei componenti genetici a valle (ad esempio, cDNA e ORF)6. Per eseguire screening GOF a livello di genoma in Drosophila, abbiamo bisogno di costruire una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF a livello di genoma e, successivamente, una libreria transgenica UAS-cDNA/ORF in Drosophila.
La costruzione di una libreria di plasmidi UAS-cDNA/ORF a livello di genoma con metodi convenzionali a partire da cloni di cDNA/ORF disponibili al pubblico richiede tempo e laboriosità, poiché ogni gene richiede progetti individualizzati, tra cui la progettazione e la sintesi di primer, la reazione a catena della polimerasi (PCR) e la purificazione del gel, il sequenziamento, la digestione di restrizione e così via 7,8. Pertanto, la costruzione di una tale libreria plasmidica è un passo limitante nella creazione di una libreria UAS-cDNA/ORF transgenica a livello di genoma in Drosophila. Recentemente, abbiamo risolto con successo questo problema sviluppando un nuovo metodo, l’assemblaggio modulare basato su CRISPR (CRISPRmass)9. Il cuore di CRISPRmass è quello di manipolare le sequenze vettoriali condivise di una libreria di plasmidi attraverso una combinazione di tecnologia di editing genetico e tecnologia di clonazione senza soluzione di continuità.
Qui, presentiamo un protocollo per CRISPRmass, che include reazioni in provetta in due fasi massicciamente parallele seguite da trasformazione batterica. CRISPRmass è un metodo semplice, veloce, efficiente ed economico che, in linea di principio, può essere utilizzato per la costruzione ad alto rendimento di varie librerie di plasmidi.
Strategia CRISPRmass
La procedura di CRISPRmass inizia con reazioni parallele in provetta in due fasi prima della trasformazione di Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). La fase 1 è la scissione delle ossa vettoriali identiche dei plasmidi cDNA/ORF da parte di Cas9/sgRNA. Un sito di scissione ideale è adiacente all’estremità 5′ del cDNA/ORF. I prodotti per la scollatura non devono essere purificati. La fase 2 consiste nell’inserimento di un modulo UAS vettorialmente specifico nei plasmidi cDNA/ORF linearizzati Cas9/sgRNA mediante assemblaggio di Gibson (di seguito denominata reazione a passo singolo), con conseguente produzione di plasmidi UAS-cDNA/ORF. Le sequenze terminali 5′ e 3′ di un modulo UAS si sovrappongono a quelle dei plasmidi cDNA/ORF linearizzati, consentendo la reazione a passo singolo.
I prodotti di reazione a passo singolo sono direttamente sottoposti alla trasformazione di E. coli . In teoria, solo le colonie di UAS-cDNA/ORF desiderate possono crescere su piastre Luria-Bertani (LB) che contengono antibiotici di selezione corrispondenti al gene di resistenza agli antibiotici del modulo UAS. Il modulo UAS è composto da un modulo UAS principale, un gene di resistenza agli antibiotici distinto da quello del cDNA o dei plasmidi ORF e dalle sequenze terminali 5′ e 3′. Un modulo UAS principale comprende 10 copie di UAS, un promotore minimo Hsp70, una sequenza attB per l’integrazione genomica mediata da phiC31 e un marcatore di trasformazione mini-bianco per Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le fasi più critiche di CRISPRmass sono la progettazione degli sgRNA e la valutazione degli sgRNA. La selezione di sgRNA altamente efficienti per Cas9 è la chiave del successo di CRISPRmass. Se si osservano pochissime o nessuna colonia sulla maggior parte delle piastre LB contenenti antibiotici dopo la trasformazione di E. coli con prodotti di assemblaggio della reazione in un’unica fase, controllare la digestione plasmidica mediante elettroforesi su gel di agarosio. Se i plasmidi non sono ben digeriti, controllare l’a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sponsorizzato dalla National Natural Science Foundation of China (32071135 e 31471010), dallo Shanghai Pujiang Program (14PJ1405900) e dalla Natural Science Foundation di Shanghai (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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