Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF
Summary
Apresentamos um protocolo para montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), um método para construção de alto rendimento da biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em Drosophila usando recursos de cDNA/ORF disponíveis publicamente. O CRISPRmass pode ser aplicado à edição de várias bibliotecas de plasmídeos.
Abstract
A triagem genômica funcional oferece uma abordagem poderosa para investigar a função do gene e depende da construção de bibliotecas de plasmídeos em todo o genoma. As abordagens convencionais para a construção de bibliotecas de plasmídeos são demoradas e trabalhosas. Portanto, desenvolvemos recentemente um método simples e eficiente, montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos de DNA complementar de sequência de ativação upstream / quadro de leitura aberto (UAS-cDNA / ORF) em todo o genoma. Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, tomando como exemplo a construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF baseada em GAL4/UAS. O protocolo inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas, seguidas de transformação bacteriana. O primeiro passo é linearizar os plasmídeos de biblioteca de cDNA ou ORF de DNA complementar (cDNA) ou quadro de leitura aberta (ORF) existentes, cortando as sequências vetoriais upstream compartilhadas adjacentes à extremidade 5 ‘de cDNAs ou ORFs usando CRISPR / Cas9 junto com RNA guia único (sgRNA), e o segundo passo é inserir um módulo UAS nos plasmídeos linearizados de cDNA ou ORF usando uma reação de etapa única. O CRISPRmass permite a construção simples, rápida, eficiente e econômica de várias bibliotecas de plasmídeos. A biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF pode ser utilizada para triagem de ganho de função em células cultivadas e para construir uma biblioteca transgênica UAS-cDNA/ORF em todo o genoma em Drosophila.
Introduction
A triagem genética imparcial do genoma completo é uma abordagem poderosa para identificar genes envolvidos em um determinado processo biológico e elucidar seu mecanismo. Portanto, é amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica. Aproximadamente 60% dos genes de Drosophila são conservados em humanos 1,2 e ~ 75% dos genes de doenças humanas têm homólogos em Drosophila3. A triagem genética é dividida principalmente em dois tipos: perda de função (LOF) e ganho de função (GOF). As telas genéticas LOF em Drosophila desempenharam um papel crítico na elucidação de mecanismos que governam quase todos os aspectos da biologia. No entanto, a maioria dos genes de Drosophila não possui fenótipos LOFóbvios 4 e, portanto, a triagem GOF é um método importante para estudar a função desses genes 4,5.
O sistema binário GAL4 / UAS é comumente usado para expressão gênica específica do tecido em Drosophila6. Nesse sistema, o tecido expressa especificamente o ativador de transcrição de levedura GAL4 que se liga ao elemento responsivo GAL4 (UAS) e, assim, ativa a transcrição dos componentes genéticos a jusante (por exemplo, cDNA e ORF) 6 . Para realizar triagens GOF em todo o genoma em Drosophila, precisamos construir uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma e, posteriormente, uma biblioteca transgênica de UAS-cDNA/ORF em Drosophila.
A construção de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em todo o genoma por métodos convencionais a partir de clones de cDNA/ORF disponíveis publicamente é demorada e trabalhosa, pois cada gene requer projetos individualizados, incluindo design e síntese de primers, reação em cadeia da polimerase (PCR) e purificação em gel, sequenciamento, digestão de restrição e assim por diante 7,8. Portanto, a construção de tal biblioteca de plasmídeos é uma etapa limitante da taxa na criação de uma biblioteca transgênica UAS-cDNA / ORF em todo o genoma em Drosophila. Recentemente, resolvemos com sucesso esse problema desenvolvendo um novo método, a montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass)9. O núcleo do CRISPRmass é manipular as sequências vetoriais compartilhadas de uma biblioteca de plasmídeos por meio de uma combinação de tecnologia de edição de genes e tecnologia de clonagem contínua.
Aqui, apresentamos um protocolo para CRISPRmass, que inclui reações massivamente paralelas em tubos de ensaio de duas etapas seguidas de transformação bacteriana. O CRISPRmass é um método simples, rápido, eficiente e econômico que, em princípio, pode ser usado para a construção de alto rendimento de várias bibliotecas de plasmídeos.
Estratégia CRISPRmass
O procedimento de CRISPRmass começa com reações paralelas em tubo de ensaio de duas etapas antes da transformação de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). A etapa 1 é a clivagem dos esqueletos vetoriais idênticos dos plasmídeos cDNA / ORF por Cas9 / sgRNA. Um local de clivagem ideal é adjacente à extremidade 5 ‘do cDNA / ORF. Os produtos de clivagem não precisam ser purificados. A etapa 2 é a inserção de um módulo UAS específico do vetor nos plasmídeos linearizados de cDNA/ORF Cas9/sgRNA pela montagem de Gibson (doravante denominada reação de etapa única), resultando em plasmídeos UAS-cDNA/ORF. As sequências terminais 5 ‘e 3’ de um módulo UAS se sobrepõem às dos plasmídeos cDNA / ORF linearizados, permitindo a reação de etapa única.
Os produtos de reação de etapa única são diretamente submetidos à transformação de E. coli . Teoricamente, apenas as colônias UAS-cDNA/ORF desejadas podem crescer em placas Luria-Bertani (LB) que contêm antibióticos de seleção correspondentes ao gene de resistência a antibióticos do módulo UAS. O módulo UAS é composto por um módulo UAS central, um gene de resistência a antibióticos distinto daquele dos plasmídeos cDNA ou ORF e as sequências terminais 5 ‘e 3’. Um módulo UAS central compreende 10 cópias de UAS, um promotor mínimo de Hsp70, uma sequência attB para integração genômica mediada por phiC31 e um marcador de transformação mini-branco para Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas mais críticas do CRISPRmass são o design de sgRNAs e a avaliação de sgRNAs. A seleção de sgRNAs altamente eficientes para Cas9 é a chave para o sucesso do CRISPRmass. Se forem observadas muito poucas ou nenhumas colónias na maioria das placas LB contendo antibióticos após a transformação de E. coli com produtos de montagem de reação de etapa única, verifique a digestão do plasmídeo por eletroforese em gel de agarose. Se os plasmídeos não forem bem digeridos, verifique a atividade de Cas9, a d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi patrocinado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32071135 e 31471010), pelo Programa Pujiang de Xangai (14PJ1405900) e pela Fundação de Ciências Naturais de Xangai (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
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