Ensamblaje modular basado en CRISPR para la construcción de alto rendimiento de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF
Summary
Presentamos un protocolo para el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass), un método para la construcción de alto rendimiento de la biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF en Drosophila utilizando recursos de cDNA/ORF disponibles públicamente. CRISPRmass se puede aplicar a la edición de varias bibliotecas de plásmidos.
Abstract
El cribado de genómica funcional ofrece un enfoque potente para sondear la función de los genes y se basa en la construcción de bibliotecas de plásmidos de todo el genoma. Los enfoques convencionales para la construcción de bibliotecas de plásmidos requieren mucho tiempo y son laboriosos. Por lo tanto, recientemente hemos desarrollado un método simple y eficiente, el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass), para la construcción de alto rendimiento de una biblioteca de plásmidos de ADN complementario de secuencia activadora/marco de lectura abierto (UAS-cDNA/ORF) de todo el genoma. Aquí, presentamos un protocolo para CRISPRmass, tomando como ejemplo la construcción de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF basada en GAL4/UAS. El protocolo incluye reacciones masivas paralelas de dos pasos en el tubo de ensayo seguidas de una transformación bacteriana. El primer paso es linealizar los plásmidos de biblioteca de ADNc u ORF de ADN complementario (ADNc) o de marco de lectura abierto (ORF) existentes cortando las secuencias vectoriales ascendentes compartidas adyacentes al extremo 5′ de ADNc u ORF utilizando CRISPR/Cas9 junto con ARN guía único (sgRNA), y el segundo paso es insertar un módulo UAS en los plásmidos linealizados de ADNc u ORF utilizando una reacción de un solo paso. CRISPRmass permite la construcción sencilla, rápida, eficiente y rentable de varias bibliotecas de plásmidos. La biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF se puede utilizar para el cribado de ganancia de función en células cultivadas y para construir una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénico de todo el genoma en Drosophila.
Introduction
El cribado genético imparcial del genoma completo es un enfoque eficaz para identificar los genes implicados en un determinado proceso biológico y dilucidar su mecanismo. Por lo tanto, es ampliamente utilizado en diversos campos de la investigación biológica. Aproximadamente el 60% de los genes de Drosophila se conservan en humanos 1,2, y ~75% de los genes de enfermedades humanas tienen homólogos en Drosophila3. El cribado genético se divide principalmente en dos tipos: pérdida de función (LOF) y ganancia de función (GOF). Los cribados genéticos de LOF en Drosophila han desempeñado un papel fundamental en la elucidación de los mecanismos que gobiernan casi todos los aspectos de la biología. Sin embargo, la mayoría de los genes de Drosophila no tienen fenotipos LOF obvios4 y, por lo tanto, el cribado de GOF es un método importante para estudiar la función de esos genes 4,5.
El sistema binario GAL4/UAS se usa comúnmente para la expresión génica específica de tejido en Drosophila6. En este sistema, el tejido expresa específicamente el activador de transcripción de levadura GAL4 que se une al elemento de respuesta GAL4 (UAS) y, por lo tanto, activa la transcripción de los componentes genéticos posteriores (por ejemplo, ADNc y ORF)6. Para realizar cribados de GOF en todo el genoma en Drosophila, necesitamos construir una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF de todo el genoma y, posteriormente, una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénica en Drosophila.
La construcción de una biblioteca de plásmidos UAS-cDNA/ORF de todo el genoma mediante métodos convencionales a partir de clones de cDNA/ORF disponibles públicamente requiere mucho tiempo y laboriosidad, ya que cada gen requiere diseños individualizados, incluido el diseño y la síntesis de cebadores, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la purificación en gel, la secuenciación, la digestión de restricción, etc. 7,8. Por lo tanto, la construcción de una biblioteca de plásmidos de este tipo es un paso limitante de la velocidad en la creación de una biblioteca de UAS-cDNA/ORF transgénica de todo el genoma en Drosophila. Recientemente, hemos resuelto con éxito este problema mediante el desarrollo de un método novedoso, el ensamblaje modular basado en CRISPR (CRISPRmass)9. El núcleo de CRISPRmass es manipular las secuencias vectoriales compartidas de una biblioteca de plásmidos a través de una combinación de tecnología de edición de genes y tecnología de clonación sin interrupciones.
Aquí, presentamos un protocolo para CRISPRmass, que incluye reacciones de probeta masivamente paralelas de dos pasos seguidas de transformación bacteriana. CRISPRmass es un método sencillo, rápido, eficiente y rentable que, en principio, puede utilizarse para la construcción de alto rendimiento de varias bibliotecas de plásmidos.
Estrategia CRISPRmass
El procedimiento de CRISPRmass comienza con reacciones paralelas de probeta de dos pasos antes de la transformación de Escherichia coli (E. coli) (Figura 1). El paso 1 es la escisión de las columnas vertebrales vectoriales idénticas de los plásmidos cDNA/ORF por Cas9/sgRNA. Un sitio de escisión ideal es adyacente al extremo 5′ del ADNc/ORF. Los productos de escisión no tienen que ser purificados. El paso 2 es la inserción de un módulo UAS específico del vector en los plásmidos linealizados cDNA/ORF Cas9/sgRNA mediante ensamblaje de Gibson (en lo sucesivo, reacción de un solo paso), lo que da como resultado plásmidos UAS-cDNA/ORF. Las secuencias terminales 5′ y 3′ de un módulo UAS se superponen con las de los plásmidos linealizados cDNA/ORF, lo que permite la reacción en un solo paso.
Los productos de reacción de un solo paso se someten directamente a la transformación de E. coli . Teóricamente, solo las colonias deseadas de UAS-cDNA/ORF pueden crecer en placas Luria-Bertani (LB) que contienen antibióticos de selección correspondientes al gen de resistencia a antibióticos del módulo UAS. El módulo UAS está compuesto por un módulo UAS central, un gen de resistencia a antibióticos distinto del de los plásmidos de ADNc u ORF, y las secuencias terminales 5′ y 3′. Un módulo central de UAS consta de 10 copias de UAS, un promotor mínimo Hsp70, una secuencia attB para la integración genómica mediada por phiC31 y un marcador de transformación mini-blanco para Drosophila7.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos más críticos de CRISPRmass son el diseño de sgRNAs y la evaluación de sgRNAs. La selección de sgRNAs altamente eficientes para Cas9 es clave para el éxito de CRISPRmass. Si se observan muy pocas o ninguna colonia en la mayoría de las placas LB que contienen antibióticos después de la transformación de E. coli con productos de ensamblaje de reacción de un solo paso, verifique la digestión de plásmidos mediante electroforesis en gel de agarosa. Si los plásmidos no se digieren bien, compruebe la acti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue patrocinado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32071135 y 31471010), el Programa Pujiang de Shanghái (14PJ1405900) y la Fundación de Ciencias Naturales de Shanghái (19ZR1446400).
Materials
| Aluminum Cooling Block | Aikbbio | ADMK-0296 | To perform bacterial transformation |
| DEPC-Treated Water | Invitrogen | AM9906 | |
| Gel Extraction Kit | Omega | D2500 | To purify DNA from agarose gel |
| Gel Imaging System | Tanon | 2500B | |
| HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit | NEB | E2050 | |
| NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix | NEB | E2621 | |
| Plasmid Mini Kit | Omega | D6943 | To isolate plasmid DNA from bacterial cells |
| Q5 Hot Start High-Fidelity 2x Master Mix | NEB | M0494 | |
| S. pyogenes Cas9 | GenScript | Z03386 | |
| Shaking Incubator | Shanghai Zhichu | ZQLY-180V | |
| T series Multi-Block Thermal Cycler | LongGene | T20 | To perform PCR |
| Trans10 Chemically Competent Cell | TranGen BioTech | CD101 | |
| Ultraviolet spectrophotometer | Shimadzu | BioSpec-nano | To measure concentration of DNA or RNA |
References
- Adams, M. D., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science. 287 (5461), 2185-2195 (2000).
- Rubin, G. M., et al. Comparative genomics of the eukaryotes. Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).
- Reiter, L. T., Potocki, L., Chien, S., Gribskov, M., Bier, E. A systematic analysis of human disease-associated gene sequences in Drosophila melanogaster. Genome Res. 11 (6), 1114-1125 (2001).
- Miklos, G. L., Rubin, G. M. The role of the genome project in determining gene function: insights from model organisms. Cell. 86 (4), 521-529 (1996).
- St Johnston, D. The art and design of genetic screens: Drosophila melanogaster. Nat Rev Genet. 3 (3), 176-188 (2002).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Bischof, J., et al. A versatile platform for creating a comprehensive UAS-ORFeome library in Drosophila. Development. 140 (11), 2434-2442 (2013).
- Xu, R., et al. A large-scale functional approach to uncover human genes and pathways in Drosophila. Cell Res. 18 (11), 1114-1127 (2008).
- Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans. Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287 (5461), 2222-2224 (2000).
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12 (8), 1294-1300 (2002).
- Yang, X., et al. A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs. Nat Meth. 8 (8), 659-661 (2011).
