Méthodes pour permettre la transcriptomique spatiale des tissus osseux

Summary

Nous décrivons ici une méthode qui permet de décalcifier les tissus osseux fraîchement obtenus et de préserver l’ARN de haute qualité. Une méthode est également illustrée pour sectionner des échantillons d’os non déminéralisés contenant de la paraffine fixe au formol (FFPE) afin d’obtenir des résultats de bonne qualité si les tissus frais ne sont pas disponibles ou ne peuvent pas être recueillis.

Abstract

Comprendre la relation entre les cellules et leur emplacement dans chaque tissu est essentiel pour découvrir les processus biologiques associés au développement normal et à la pathologie de la maladie. La transcriptomique spatiale est une méthode puissante qui permet d’analyser l’ensemble du transcriptome dans des échantillons de tissus, fournissant ainsi des informations sur l’expression des gènes cellulaires et le contexte histologique dans lequel les cellules résident. Bien que cette méthode ait été largement utilisée pour de nombreux tissus mous, son application pour l’analyse des tissus durs tels que les os a été difficile. Le principal défi réside dans l’incapacité à préserver une bonne qualité de l’ARN et la morphologie des tissus lors du traitement des échantillons de tissus durs pour la section. Par conséquent, une méthode est décrite ici pour traiter des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus afin de générer efficacement des données transcriptomiques spatiales. La méthode permet de décalcifier les échantillons, ce qui permet d’obtenir des coupes de tissus avec des détails morphologiques préservés tout en évitant la dégradation de l’ARN. De plus, des lignes directrices détaillées sont fournies pour les échantillons qui étaient auparavant intégrés à la paraffine, sans déminéralisation, tels que les échantillons prélevés dans des banques de tissus. À l’aide de ces directives, des données transcriptomiques spatiales de haute qualité générées à partir d’échantillons de banques de tissus de tumeurs primaires et de métastases pulmonaires d’ostéosarcome osseux sont présentées.

Introduction

L’os est un tissu conjonctif spécialisé composé principalement de fibres de collagène de type 1 et de sels inorganiques¹. En conséquence, l’os est incroyablement solide et rigide tout en étant léger et résistant aux traumatismes. La grande force de l’os provient de sa teneur en minéraux. En fait, pour une augmentation donnée du pourcentage de teneur en minéraux, la rigidité est multipliée^{par cinq} 2. Par conséquent, les chercheurs sont confrontés à des problèmes importants lorsqu’ils analysent, au moyen d’une coupe histologique, la biologie d’un échantillon osseux.

L’histologie osseuse non décalcifiée est réalisable et parfois nécessaire, selon le type d’investigation (par exemple, pour étudier la micro-architecture de l’os) ; C’est cependant très difficile, surtout si les spécimens sont grands. Dans ces cas, le traitement des tissus à des fins histologiques nécessite plusieurs modifications des protocoles et techniques standard³. En général, pour effectuer des évaluations histologiques courantes, les tissus osseux sont décalcifiés juste après la fixation, un processus qui peut prendre de quelques jours à plusieurs semaines, selon la taille du tissu et l’agent décalcifiant utilisé⁴. Les coupes décalcifiées sont souvent utilisées pour l’examen de la moelle osseuse, le diagnostic des tumeurs, etc. Il existe trois principaux types d’agents décalcifiants : les acides forts (par exemple, l’acide nitrique, l’acide chlorhydrique), les acides faibles (par exemple, l’acide formique) et les agents chélateurs (par exemple, l’acide éthylènediaminetétracetique ou EDTA)⁵. Les acides forts peuvent décalcifier les os très rapidement, mais ils peuvent endommager les tissus ; les acides faibles sont très courants et conviennent aux procédures de diagnostic ; Les agents chélateurs sont de loin les plus utilisés et les plus appropriés pour la recherche car, dans ce cas, le processus de déminéralisation est lent et doux, ce qui permet de conserver une morphologie de haute qualité et de préserver l’information sur les gènes et les protéines, comme l’exigent de nombreuses procédures (par exemple, hybridation in situ , immunomarquage). Cependant, lorsque l’ensemble du transcriptome doit être préservé, comme pour les analyses d’expression génique, même une déminéralisation lente et douce peut être préjudiciable. Par conséquent, de meilleures approches et méthodes sont nécessaires lorsque l’analyse morphologique des tissus doit être associée à des analyses de l’expression génique des cellules.

Grâce aux récentes améliorations du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq) et de la transcriptomique spatiale, il est désormais possible d’étudier l’expression génique d’un échantillon de tissu, même lorsque l’enrobage de paraffine de fixation au formol (FFPE) a été utilisé pour stocker^{les échantillons de tissus.} Cette opportunité a permis d’accéder à un plus grand nombre d’échantillons, tels que ceux stockés dans des banques de tissus du monde entier. Si le scRNA-seq doit être utilisé, l’intégrité de l’ARN est l’exigence la plus importante ; cependant, dans le cas de la transcriptomique spatiale des échantillons FFPE, des coupes de tissus de haute qualité et de l’ARN de haute qualité sont nécessaires pour visualiser l’expression génique dans le contexte histologique de chaque section de tissu. Bien que cela ait été facilement réalisé avec les tissus mous, on ne peut pas en dire autant des tissus durs comme les os. En effet, à notre connaissance, aucune étude utilisant la transcriptomique spatiale n’a jamais été réalisée sur des échantillons osseux FFPE. Cela est dû à l’absence de protocoles capables de traiter efficacement les tissus osseux FFPE tout en préservant leur contenu en ARN. Ici, une méthode pour traiter et décalcifier des échantillons de tissu osseux fraîchement obtenus tout en évitant la dégradation de l’ARN est d’abord fournie. Ensuite, reconnaissant la nécessité d’une analyse transcriptomique des échantillons FFPE collectés dans les banques de tissus du monde entier, des directives élaborées pour manipuler correctement les échantillons FFPE d’os non déminéralisés sont également présentées.

Protocol

Toutes les procédures sur les animaux décrites ci-dessous ont été approuvées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de l’École de médecine dentaire de l’Université de Pittsburgh. 1. Méthode de préparation de blocs FFPE d’échantillons de tissu osseux nécessitant une déminéralisation Préparation des réactifs et des matériauxPréparez l’EDTA 20% pH 8.0. Pour 1 L, dissoudre 200 g d’EDTA dans 80…

Representative Results

La méthode présentée ici décrit comment traiter des os fraîchement isolés pour obtenir des échantillons FFPE déminéralisés qui peuvent être facilement sectionnés avec un microtome tout en préservant l’intégrité de l’ARN (Figure 1). La méthode a été utilisée avec succès sur des fémurs murins, mais elle peut être suivie pour d’autres échantillons de tissu osseux de dimensions similaires, ou elle peut être adaptée à des échantillons osseux plus grands (par exemp…

Discussion

Ici, une méthode détaillée est fournie pour préparer des blocs FFPE d’os décalcifiés et préserver l’intégrité de l’ARN pour le séquençage (c’est-à-dire le séquençage de nouvelle génération (NGS)) ou pour d’autres techniques liées à l’ARN (c’est-à-dire l’hybridation in situ , la réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse quantitative (qRT-PCR), etc.).

La méthode utilise l’EDTA pour décalcifier les échantillons de tissu osseux ;…

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.