Kemik Dokularının Mekansal Transkriptomiklerini Etkinleştirme Yöntemleri
Summary
Burada, taze elde edilen kemik dokularının dekalsifikasyonuna ve yüksek kaliteli RNA’nın korunmasına izin veren bir yöntemi açıklıyoruz. Taze dokuların mevcut olmadığı veya toplanamadığı durumlarda iyi kalitede sonuçlar elde etmek için demineralize edilmemiş kemiklerin Formalin Sabit Parafin Gömülü (FFPE) örneklerini kesitlemek için bir yöntem de gösterilmiştir.
Abstract
Hücreler arasındaki ilişkiyi ve her bir doku içindeki konumlarını anlamak, normal gelişim ve hastalık patolojisi ile ilişkili biyolojik süreçleri ortaya çıkarmak için kritik öneme sahiptir. Mekansal transkriptomik, doku örnekleri içindeki tüm transkriptomun analizini sağlayan, böylece hücresel gen ekspresyonu ve hücrelerin bulunduğu histolojik bağlam hakkında bilgi sağlayan güçlü bir yöntemdir. Bu yöntem birçok yumuşak doku için yaygın olarak kullanılırken, kemik gibi sert dokuların analizi için uygulanması zor olmuştur. En büyük zorluk, sert doku örneklerini kesitleme için işlerken kaliteli RNA ve doku morfolojisinin korunamamasıdır. Bu nedenle, mekansal transkriptomik verileri etkili bir şekilde oluşturmak için yeni elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek için burada bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, numunelerin dekalsifikasyonuna izin vererek, RNA bozulmasını önlerken korunmuş morfolojik ayrıntılara sahip başarılı doku kesitleri sağlar. Ek olarak, doku bankalarından toplanan numuneler gibi demineralizasyon olmadan daha önce parafine gömülü olan numuneler için ayrıntılı kılavuzlar sağlanmıştır. Bu kılavuzlar kullanılarak, primer tümör ve kemik osteosarkomunun akciğer metastazı doku bankası örneklerinden üretilen yüksek kaliteli mekansal transkriptomik veriler gösterilmektedir.
Introduction
Kemik, esas olarak kollajen tip 1 liflerinden ve inorganik tuzlar1’den oluşan özel bir bağ dokusudur. Sonuç olarak, kemik inanılmaz derecede güçlü ve serttir, aynı zamanda hafif ve travmaya dayanıklıdır. Kemiğin büyük gücü mineral içeriğinden kaynaklanmaktadır. Aslında, mineral içeriği yüzdesindeki herhangi bir artış için, sertlik beş kat artar2. Sonuç olarak, araştırmacılar, bir kemik örneğinin biyolojisini histolojik kesit yoluyla analiz ettiklerinde önemli problemlerle karşı karşıya kalmaktadırlar.
Kalsifiye edilmemiş kemik histolojisi mümkündür ve bazen araştırmanın türüne bağlı olarak gereklidir (örneğin, kemiğin mikro mimarisini incelemek için); Bununla birlikte, özellikle örnekler büyükse, çok zordur. Bu durumlarda, histolojik amaçlar için doku işleme, standart protokollerin ve tekniklerin çeşitli modifikasyonlarını gerektirir3. Genel olarak, yaygın histolojik değerlendirmeleri gerçekleştirmek için, kemik dokuları fiksasyondan hemen sonra dekalsifiye edilir, bu işlem dokunun boyutuna ve kullanılan kireç çözücü ajana bağlı olarak birkaç gün ila birkaç hafta sürebilir4. Dekalsifiye bölümler genellikle kemik iliği muayenesi, tümörlerin teşhisi vb. İçin kullanılır. Üç ana kireç çözücü ajan türü vardır: güçlü asitler (örn. nitrik asit, hidroklorik asit), zayıf asitler (örn. formik asit) ve şelatlama ajanları (örn. etilendiaminetetracetic asit veya EDTA)5. Güçlü asitler kemiği çok hızlı bir şekilde kireçten arındırabilir, ancak dokulara zarar verebilir; zayıf asitler çok yaygındır ve teşhis prosedürleri için uygundur; Şelatlama ajanları, araştırma uygulaması için açık ara en çok kullanılan ve uygun olanlardır, çünkü bu durumda, demineralizasyon işlemi yavaş ve naziktir, bu da birçok prosedürün gerektirdiği gibi yüksek kaliteli morfolojinin tutulmasına ve gen ve protein bilgilerinin korunmasına izin verir (örneğin, yerinde hibridizasyon, immün boyama). Bununla birlikte, gen ekspresyon analizleri gibi tüm transkriptomun korunması gerektiğinde, yavaş ve hafif bir demineralizasyon bile zararlı olabilir. Bu nedenle, dokuların morfolojik analizinin hücrelerin gen ekspresyon analizleri ile eşleştirilmesi gerektiğinde daha iyi yaklaşımlara ve yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır.
Tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-dizilimi) ve uzamsal transkriptomikteki son gelişmeler sayesinde, doku örneklerini saklamak için formalin fiksasyon parafin gömme (FFPE) kullanıldığında bile bir doku örneğinin gen ekspresyonunu incelemek artık mümkündür 6,7,8. Bu fırsat, dünya çapında doku bankalarında saklananlar gibi daha fazla sayıda örneğe erişimin kilidini açtı. Eğer scRNA-seq kullanılacaksa, RNA bütünlüğü en önemli gerekliliktir; bununla birlikte, FFPE örneklerinin uzamsal transkriptomikleri söz konusu olduğunda, her doku bölümünün histolojik bağlamında gen ekspresyonunu görselleştirmek için hem yüksek kaliteli doku kesitleri hem de yüksek kaliteli RNA gereklidir. Yumuşak dokularla bu kolayca başarılırken, kemik gibi sert dokular için aynı şey söylenemez. Aslında, bildiğimiz kadarıyla, FFPE kemik örnekleri üzerinde uzamsal transkriptomik kullanan hiçbir çalışma yapılmamıştır. Bunun nedeni, RNA içeriğini korurken FFPE kemik dokularını etkili bir şekilde işleyebilen protokollerin olmamasıdır. Burada, önce RNA bozulmasını önlerken taze elde edilen kemik dokusu örneklerini işlemek ve kireçten arındırmak için bir yöntem sağlanır. Daha sonra, dünya çapında doku bankalarında toplanan FFPE örneklerinin transkriptomik analizine duyulan ihtiyacın farkında olarak, demineralize edilmemiş kemiklerin FFPE örneklerini uygun şekilde işlemek için geliştirilmiş kılavuzlar da sunulmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, dekalsifiye kemiklerin FFPE bloklarını hazırlamak ve dizileme (yani yeni nesil dizileme (NGS)) veya diğer RNA ile ilgili teknikler (yani in situ hibridizasyon, kantitatif ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR), vb.) için RNA bütünlüğünü korumak için ayrıntılı bir yöntem sağlanmıştır.
Yöntem, kemik dokusu örneklerini kireçten arındırmak için EDTA’yı kullanır; EDTA inkübasyonu, numunelerin yavaş ama ince demineralizasyonuna izin v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Pittsburgh Cure Sarkom (PCS) ve Osteosarkom Enstitüsü (OSI) tarafından sağlanan fonlarla desteklenmiştir.
Materials
| Advanced orbital shaker | VWR | 76683-470 | Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions. |
| Camel Hair Brushes | Ted Pella | 11859 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Dual Index Kit TS Set A 96 rxns | 10X Genomics | PN-1000251 | Use to perform spatial transcriptomics. |
| Ethanol 200 Proof | Decon Labs Inc | 2701 | Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions. |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA) | Thermo Fisher Scientific | S312-500 | Use to prepare EDTA 20% pH 8.0. |
| Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps | Fisher Scientific | 16-100-110 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Fine Precision Probe | Fisher Scientific | 12-000-153 | Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines. |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines. |
| High profile diamond microtome blades | CL Sturkey | D554DD | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Novaseq 150PE | Novogene | N/A | Sequencer. |
| Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS to perform tissue fixation. |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-049 | Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions. |
| Premiere Tissue Floating Bath | Fisher Scientific | A84600061 | Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines. |
| RNase AWAY Surface Decontaminant | Thermo Fisher Scientific | 7002 | Use to clean all surfaces as reported in the method instructions. |
| RNeasy DSP FFPE Kit | Qiagen | 73604 | Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines. |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems | RM2245 | Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines. |
| Sodium hydroxide | Millipore Sigma | S8045-500 | Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water. |
| Space Ranger | 10X Genomics | 2.0.1 | Use to process sequencing data output . |
| Surgipath Paraplast | Leica Biosystems | 39601006 | Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions. |
| Visium Accessory Kit | 10X Genomics | PN-1000194 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Human Transcriptome Probe Kit Small | 10X Genomics | PN-1000363 | Use to perform spatial transcriptomic experiments. |
| Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns | 10X Genomics | PN-1000188 | Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments. |
| Xylene | Leica Biosystems | 3803665 | Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions. |
References
- Baig, M. A., Bacha, D. . Histology, Bone. , (2024).
- Currey, J. D. The mechanical consequences of variation in the mineral content of bone. J Biomech. 2 (1), 1-11 (1969).
- Goldschlager, T., Abdelkader, A., Kerr, J., Boundy, I., Jenkin, G. Undecalcified bone preparation for histology, histomorphometry and fluorochrome analysis. J Vis Exp. 35, 1707 (2010).
- Wallington, E. A. . Histological Methods for Bone. , (1972).
- Callis, G. M., Sterchi, D. L. Decalcification of bone: Literature review and practical study of various decalcifying agents. methods, and their effects on bone histology. J Histotechnol. 21 (1), 49-58 (1998).
- Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. The utilization of formalin fixed-paraffin-embedded specimens in high throughput genomic studies. Int J Genomics. 2017, 1926304 (2017).
- Trinks, A., et al. Robust detection of clinically relevant features in single-cell RNA profiles of patient-matched fresh and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) lung cancer tissue. Cell Oncol (Dordr). , (2024).
- Xu, Z., et al. High-throughput single nucleus total RNA sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded tissues by snRandom-seq. Nat Commun. 14 (1), 2734 (2023).
- 10X Genomics. . Visium Spatial Gene Expression Reagent Kits for FFPE – User Guide., Document Number C CG000407 Rev C, 10x Genomics. , (2021).
- 10X Genomics. . Interpreting Space Ranger Web Summary Files for Visium Spatial Gene Expression for FFPE F FFPEAssay., Document Number CG000499 Rev A, 10x Genomics. , (2022).
- 10X Genomics. . Visium Spatial Gene Expression for FFPE-Tissue Preparation Guide., Document Number C G CG000408 Rev D, 10x Genomics. , (2022).
