Методы обеспечения пространственной транскриптомики костных тканей

Summary

В этой статье мы опишем метод, который позволяет провести декальцификацию свежеполученных костных тканей и сохранить высококачественную РНК. Также проиллюстрирован метод среза образцов недеминерализованной кости с фиксированным парафином формалином (FFPE) для получения результатов хорошего качества, если свежие ткани недоступны или не могут быть собраны.

Abstract

Понимание взаимосвязи между клетками и их расположения в каждой ткани имеет решающее значение для раскрытия биологических процессов, связанных с нормальным развитием и патологией заболевания. Пространственная транскриптомика является мощным методом, который позволяет анализировать весь транскриптом в образцах тканей, тем самым предоставляя информацию об экспрессии клеточных генов и гистологическом контексте, в котором находятся клетки. В то время как этот метод широко используется для многих мягких тканей, его применение для анализа твердых тканей, таких как кости, было сложной задачей. Основная проблема заключается в невозможности сохранить РНК и морфологию тканей хорошего качества при обработке образцов твердых тканей для среза. Таким образом, здесь описан метод обработки свежеполученных образцов костной ткани для эффективного получения пространственных транскриптомных данных. Этот метод позволяет проводить декальцификацию образцов, обеспечивая успешные срезы тканей с сохраненными морфологическими деталями, избегая при этом деградации РНК. Кроме того, приведены подробные рекомендации для образцов, которые ранее были залиты парафином, без деминерализации, таких как образцы, собранные из банков тканей. С использованием этих рекомендаций представлены высококачественные данные пространственной транскриптомики, полученные из образцов банка тканей первичной опухоли и метастазирования в легкие остеосаркомы костей.

Introduction

Кость – это специализированная соединительная ткань, состоящая в основном из волокон коллагена 1 типа и неорганических солей¹. В результате кость получается невероятно прочной и жесткой, в то же время легкой и травмостойкой. Большая прочность кости обусловлена содержанием в ней минералов. Фактически, при любом заданном увеличении процентного содержания минералов жесткость увеличивается в пять^раз2. Следовательно, исследователи сталкиваются со значительными проблемами при анализе биологии костного образца с помощью гистологического среза.

Гистология недекальцинированной кости возможна, а иногда и необходима, в зависимости от типа исследования (например, для изучения микроархитектуры кости); Тем не менее, это очень сложная задача, особенно если экземпляры крупные. В этих случаях обработка тканей в гистологических целях требует нескольких модификаций стандартных протоколов и методик³. Как правило, для проведения общих гистологических оценок костные ткани декальцифицируются сразу после фиксации, что может занять от нескольких дней до нескольких недель, в зависимости от размера ткани и используемого декальцифицирующего агента^. Декальцинированные срезы часто используются для обследования костного мозга, диагностики опухолей и т.д. Существует три основных типа декальцинирующих агентов: сильные кислоты (например, азотная кислота, соляная кислота), слабые кислоты (например, муравьиная кислота) и хелатирующие агенты (например, этилендиаминэтрицензиновая кислота или ЭДТА)⁵. Сильные кислоты могут очень быстро декальцинировать кость, но они могут повредить ткани; слабые кислоты очень распространены и подходят для диагностических процедур; Хелатирующие агенты на сегодняшний день являются наиболее используемыми и подходящими для исследовательского применения, поскольку в этом случае процесс деминерализации является медленным и щадящим, что позволяет сохранить высококачественную морфологию и сохранить информацию о генах и белках, как того требуют многие процедуры (например, гибридизация in situ , иммуноокрашивание). Однако, когда необходимо сохранить весь транскриптом, например, для анализа экспрессии генов, даже медленная и щадящая деминерализация может быть вредной. Следовательно, необходимы более совершенные подходы и методы, когда морфологический анализ тканей должен сочетаться с анализом экспрессии генов клеток.

Благодаря недавним усовершенствованиям в секвенировании РНК одиночных клеток (scRNA-seq) и пространственной транскриптомике, теперь стало возможным изучать экспрессию генов образца ткани даже в тех случаях, когда для хранения образцов тканей использовалось парафиновложение фиксации формалина (FFPE) ^6,7,8. Эта возможность открыла доступ к большему количеству образцов, например, хранящихся в банках тканей по всему миру. Если необходимо использовать scRNA-seq, наиболее важным требованием является целостность РНК; однако в случае пространственной транскриптомики образцов FFPE для визуализации экспрессии гена в гистологическом контексте каждого среза ткани необходимы как высококачественные срезы ткани, так и высококачественные РНК. В то время как это было легко достигнуто с помощью мягких тканей, этого нельзя сказать о твердых тканях, таких как кости. На самом деле, насколько нам известно, ни одно исследование с использованием пространственной транскриптомики никогда не проводилось на образцах костей FFPE. Это связано с отсутствием протоколов, которые могли бы эффективно обрабатывать костные ткани FFPE с сохранением содержания в них РНК. В этом случае сначала предлагается метод обработки и декальцинации свежеполученных образцов костной ткани, избегая деградации РНК. Затем, признавая необходимость транскриптомного анализа образцов FFPE, собранных в банках тканей по всему миру, также представлены разработанные рекомендации по надлежащему обращению с образцами FFPE недеминерализованных костей.

Protocol

Все описанные ниже процедуры на животных были одобрены в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию в Школе стоматологической медицины Университета Питтсбурга. 1. Способ получения блоков FFPE образцов костной ткани, требующих д?…

Representative Results

Представленный здесь метод описывает, как обрабатывать свежевыделенные кости для получения деминерализованных образцов FFPE, которые можно легко разрезать с помощью микротома с сохранением целостности РНК (рис. 1). Этот метод был успешно применен на бедренных костях мыш?…

Discussion

В данном случае подробно описан способ получения блоков FFPE из декальцинированных костей и сохранения целостности РНК для секвенирования (т.е. секвенирования нового поколения (NGS)) или для других методов, связанных с РНК (т.е. гибридизация in situ , количественная полимеразная цепная ре?…

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.