Metodi per abilitare la trascrittomica spaziale dei tessuti ossei

Summary

Qui descriviamo un metodo che consente la decalcificazione dei tessuti ossei appena ottenuti e la conservazione di RNA di alta qualità. Viene inoltre illustrato un metodo per il sezionamento di campioni FFPE (Formalin Fixed Paraffin Embedded) di ossa non demineralizzate per ottenere risultati di buona qualità se i tessuti freschi non sono disponibili o non possono essere raccolti.

Abstract

Comprendere la relazione tra le cellule e la loro posizione all’interno di ciascun tessuto è fondamentale per scoprire i processi biologici associati al normale sviluppo e alla patologia della malattia. La trascrittomica spaziale è un potente metodo che consente l’analisi dell’intero trascrittoma all’interno di campioni di tessuto, fornendo così informazioni sull’espressione genica cellulare e sul contesto istologico in cui risiedono le cellule. Sebbene questo metodo sia stato ampiamente utilizzato per molti tessuti molli, la sua applicazione per l’analisi di tessuti duri come l’osso è stata impegnativa. La sfida principale risiede nell’incapacità di preservare l’RNA di buona qualità e la morfologia dei tessuti durante l’elaborazione dei campioni di tessuto duro per il sezionamento. Pertanto, qui viene descritto un metodo per elaborare campioni di tessuto osseo appena ottenuti per generare efficacemente dati di trascrittomica spaziale. Il metodo consente la decalcificazione dei campioni, garantendo sezioni di tessuto di successo con dettagli morfologici preservati ed evitando la degradazione dell’RNA. Inoltre, vengono fornite linee guida dettagliate per i campioni precedentemente inclusi in paraffina, senza demineralizzazione, come i campioni raccolti dalle banche dei tessuti. Utilizzando queste linee guida, vengono mostrati dati di trascrittomica spaziale di alta qualità generati da campioni di banche di tessuti di tumore primario e metastasi polmonari dell’osteosarcoma osseo.

Introduction

L’osso è un tessuto connettivo specializzato composto principalmente da fibre di collagene di tipo 1 e sali inorganici¹. Di conseguenza, l’osso è incredibilmente forte e rigido pur essendo allo stesso tempo leggero e resistente ai traumi. La grande forza dell’osso deriva dal suo contenuto di minerali. Infatti, per ogni dato aumento della percentuale di contenuto di minerali, la rigidità aumenta di cinque volte². Di conseguenza, i ricercatori si trovano di fronte a problemi significativi quando analizzano, mediante sezionamento istologico, la biologia di un campione osseo.

L’istologia ossea non decalcificata è fattibile e talvolta richiesta, a seconda del tipo di indagine (ad esempio, per studiare la microarchitettura dell’osso); È, tuttavia, molto impegnativo, soprattutto se gli esemplari sono di grandi dimensioni. In questi casi, il processamento tissutale a fini istologici richiede diverse modifiche dei protocolli e delle tecniche standard³. In generale, per eseguire le comuni valutazioni istologiche, i tessuti ossei vengono decalcificati subito dopo la fissazione, un processo che può richiedere da alcuni giorni a diverse settimane, a seconda delle dimensioni del tessuto e dell’agente decalcificante utilizzato⁴. Le sezioni decalcificate sono spesso utilizzate per l’esame del midollo osseo, la diagnosi di tumori, ecc. Esistono tre tipi principali di agenti decalcificanti: acidi forti (ad es. acido nitrico, acido cloridrico), acidi deboli (ad es. acido formico) e agenti chelanti (ad es. acido etilendiamminotetracetico o EDTA)⁵. Gli acidi forti possono decalcificare l’osso molto rapidamente, ma possono danneggiare i tessuti; gli acidi deboli sono molto comuni e adatti per le procedure diagnostiche; Gli agenti chelanti sono di gran lunga i più utilizzati e appropriati per l’applicazione della ricerca poiché, in questo caso, il processo di demineralizzazione è lento e delicato, consentendo il mantenimento di una morfologia di alta qualità e la conservazione delle informazioni geniche e proteiche, come richiesto da molte procedure (ad esempio, ibridazione in situ , immunocolorazione). Tuttavia, quando l’intero trascrittoma deve essere preservato, ad esempio per le analisi dell’espressione genica, anche una demineralizzazione lenta e delicata può essere dannosa. Pertanto, sono necessari approcci e metodi migliori quando l’analisi morfologica dei tessuti deve essere abbinata all’analisi dell’espressione genica delle cellule.

Grazie ai recenti miglioramenti nel sequenziamento dell’RNA a singola cellula (scRNA-seq) e nella trascrittomica spaziale, è ora possibile studiare l’espressione genica di un campione di tessuto anche quando l’inclusione di paraffina per fissazione in formalina (FFPE) è stata utilizzata per conservare i campioni di tessuto ^6,7,8. Questa opportunità ha permesso di accedere a un numero maggiore di campioni, come quelli conservati nelle banche dei tessuti di tutto il mondo. Se lo scRNA-seq deve essere impiegato, l’integrità dell’RNA è il requisito più importante; tuttavia, nel caso della trascrittomica spaziale di campioni FFPE, sono necessarie sia sezioni di tessuto di alta qualità che RNA di alta qualità per visualizzare l’espressione genica nel contesto istologico di ciascuna sezione di tessuto. Mentre questo è stato facilmente ottenuto con i tessuti molli, lo stesso non si può dire per i tessuti duri come le ossa. Infatti, per quanto ne sappiamo, nessuno studio che utilizzi la trascrittomica spaziale è mai stato condotto su campioni ossei FFPE. Ciò è dovuto alla mancanza di protocolli in grado di elaborare efficacemente i tessuti ossei FFPE preservandone il contenuto di RNA. In questo caso, viene fornito prima un metodo per elaborare e decalcificare i campioni di tessuto osseo appena ottenuti, evitando la degradazione dell’RNA. Quindi, riconoscendo la necessità di un’analisi trascrittomica dei campioni FFPE raccolti nelle banche dei tessuti di tutto il mondo, vengono presentate anche le linee guida sviluppate per gestire correttamente i campioni FFPE di ossa non demineralizzate.

Protocol

Tutte le procedure sugli animali descritte di seguito sono state approvate in conformità con la Guida per la cura e l’uso degli animali da laboratorio presso la School of Dental Medicine dell’Università di Pittsburgh. 1. Metodo per preparare blocchi FFPE di campioni di tessuto osseo che richiedono demineralizzazione Preparazione dei reagenti e dei materialiPreparare EDTA 20% pH 8.0. Per 1 L, sciogliere 200 g di EDTA in 800 mL di acqua ultrapura, regolare il…

Representative Results

Il metodo qui presentato descrive come elaborare ossa appena isolate per ottenere campioni di FFPE demineralizzati che possono essere facilmente sezionati con un microtomo preservando l’integrità dell’RNA (Figura 1). Il metodo è stato impiegato con successo su femori murini, ma può essere seguito per altri campioni di tessuto osseo di dimensioni simili, oppure può essere adattato per campioni ossei più grandi (ad esempio, campioni umani) aumentando tutti i parametri (tempistiche, volumi…

Discussion

Qui, viene fornito un metodo dettagliato per preparare blocchi FFPE di ossa decalcificate e preservare l’integrità dell’RNA per il sequenziamento (ad esempio, sequenziamento di nuova generazione (NGS)) o per altre tecniche correlate all’RNA (ad esempio, ibridazione in situ , reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa quantitativa (qRT-PCR), ecc.).

Il metodo utilizza l’EDTA per decalcificare campioni di tessuto osseo; l’incubazione con EDTA consente una demineralizzazio…

Materials

Advanced orbital shaker	VWR	76683-470	Use to keep tissues under agitation during incubation as reported in the method instructions.
Camel Hair Brushes	Ted Pella	11859	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Dual Index Kit TS Set A 96 rxns	10X Genomics	PN-1000251	Use to perform spatial transcriptomics.
Ethanol 200 Proof	Decon Labs Inc	2701	Use to perform tissue dehydration as reported in the method instructions.
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (EDTA)	Thermo Fisher Scientific	S312-500	Use to prepare EDTA 20% pH 8.0.
Fisherbrand Curved Medium Point General Purpose Forceps	Fisher Scientific	16-100-110	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Fine Precision Probe	Fisher Scientific	12-000-153	Use to handle FFPE sections as reported in the guidelines.
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15	Use to attach sectioned scrolls as reported in the guidelines.
High profile diamond microtome blades	CL Sturkey	D554DD	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Novaseq 150PE	Novogene	N/A	Sequencer.
Paraformaldehyde (PFA) 32% Aqueous Solution EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714-S	Dilute to final concentration of 4% with 1x PBS  to perform tissue fixation.
Phosphate buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010-049	Ready to use. Use to dilute PFA and to perform washes as reported in the method instructions.
Premiere Tissue Floating Bath	Fisher Scientific	A84600061	Use to remove wrinkles from FFPE sections as reported in the guidelines.
RNase AWAY Surface Decontaminant	Thermo Fisher Scientific	7002	Use to clean all surfaces as reported in the method instructions.
RNeasy DSP FFPE Kit	Qiagen	73604	Use to isolate RNA from FFPE sections once they have been generated as reported in the guidelines.
Semi-Automated Rotary Microtome	Leica Biosystems	RM2245	Use to section FFPE blocks as reported in the guidelines.
Sodium hydroxide	Millipore Sigma	S8045-500	Prepare 10 N solution by slowly dissolving 400 g in 1 liter of Milli-Q water.
Space Ranger	10X Genomics	2.0.1	Use to process sequencing data output .
Surgipath Paraplast	Leica Biosystems	39601006	Use to perform tissue infliltration and embedding as reported in the method instructions.
Visium Accessory Kit	10X Genomics	PN-1000194	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Human Transcriptome Probe Kit Small	10X Genomics	PN-1000363	Use to perform spatial transcriptomic experiments.
Visium Spatial Gene Expression Slide Kit 4 rxns	10X Genomics	PN-1000188	Use to place the sections if performing spatial transcriptomic experiments.
Xylene	Leica Biosystems	3803665	Use to perform tissue clearing as reported in the method instructions.