Encyclopedia of Experiments: Biology
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Transcript
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- Per iniziare, rimuovi la testa da una mosca adulta anestetizzata. Coprire la mosca decapitata con una soluzione contenente saline tamponate da fosfati, o PBS, e albumina di siero bovino, o BSA, per evitare l'essiccazione. Tenere la mosca vicino al torace con le forcep, quindi tirare l'addome con un secondo paio di forcep per esporre l'intestino. Poiché il raccolto, o il sacco di stoccaggio del cibo, sarà attaccato al torace, allontanare delicatamente l'intestino dal torace.
Una volta staccato, allontanare il raccolto dall'addome per aprire l'intestino. Togliere l'estremità posteriore della mosca per iniziare a liberare l'intestino dalla cavità addominale. Continuare a tirare l'intestino per estrarre l'intero tessuto dall'addome. Una volta liberato, rimuovere il mento, i tubuli malpighiani, il broncio posteriore e le ovaie per lasciare solo il midgut sezionato, il sito primario di digestione all'interno della mosca.
Nel protocollo di esempio, sezioneremo i midgut di mosche adulte giovani e vecchie per essere ulteriormente analizzati tramite lo smistamento delle celle attivato dalla fluorescenza o FACS.
- Prima di iniziare la dissezione, anestetizzare una fiala di 40 mosche con anidride carbonica su un letto di mosca standard. Quindi utilizzare una lama di rasoio per decapitare tutte le mosche e trasferirle in un piatto di dissezione rivestito con gel di agarosio. Versare abbastanza PBS freddo più BSA nel piatto per coprire l'agarosio. Le mosche galleggeranno.
Quindi, per ogni insetto, a sua volta, afferrare un addome volante con un paio di forcep e il torace con un altro. Separare il torace dall'addome. L'intestino sarà visibile e molto probabilmente il raccolto sarà ancora collegato al torace. Afferrare l'intestino e tirarlo fuori dal torace. Quindi, afferrare il raccolto e estrarre leggermente l'intestino leggermente prima dall'addome per dispiegarlo.
Quindi, utilizzare una delle forcep per afferrare l'estremità posteriore dell'addome e l'altra per afferrare il bordo della cuticola aperta anteriormente. Tirare l'estremità posteriore per rompere la cuticola e continuare a tirare posteriormente molto delicatamente, fino a quando l'intero intestino non è stato estratto dalla cavità addominale. Rimuovere il prenegut, i tubi malpighiani, il pinna posteriore e le ovaie, lasciando il midgut nudo.
Poiché i moscerini sono isolati, utilizzare una pipetta Pasteur in vetro per trasferire periodicamente diversi tessuti intestinali alla volta in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri contenente PBS freddo più BSA sul ghiaccio.
