Summary
전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다.
Abstract
전통적으로 수직 슬라이스와 망막의 전체 마운트 준비는 망막 회로의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 그러나, amacrine 세포로 망막 뉴런의 많은 세포의 형태가 심각하게 수직 조각에 손상 있어야되도록 가로 그들의 dendrites를 확장합니다. 전체 마운트 준비, 특히 패치 - 클램프 녹음을 위해 중간 계층에있는 망막 뉴런 인해 glial 세포 (뮬러 세포) 님의 endfeets의 광범위한 범위에 쉽게 액세스할 수 없습니다. 여기, 우리는 망막 손상 뉴런의 돌기 형태를 보존하는 방법을 깔끔히 소설을 설명합니다. 망막은 저온 용융 아가로 오스 겔에 포함된 이후 슬라이스는 vibratome 기계를 사용하여 망막의 내부 계층에서 수평으로 만들어졌습니다. 망막의 수평 슬라이스 준비에, 우리는 패치 - 클램프 녹음, 칼슘 이미징 기술, immunocytochemistry, RT - PCR 및 단일 세포를 사용하여, 그들의 형태와 비교하여 망막 뉴런의 기능을 공부했습니다.
Protocol
- 한천 블록 (30 MG / ML, 즉 3%, 증류수로)를 준비합니다. 용해와 전자렌지를 최초의 유리 그릇에 그것을 부어. 4 O C.에 냉장고에 음식 보관
팁 : 한천 블록이 사전에 준비되어야합니다.
- 준비 낮은 온도 용해 아가로 오스 겔 (중간 25 MG / ML, 즉 2.5 %). 그것을 디졸브, 전자렌지. 35 O C.에있는 온수 욕조에 보관
팁 : 아가로 오스 겔이 너무 섹시하지 보관. 너무는 뜨겁다면, 그것은 확정되는 데 시간이 오래 걸립니다, 그리고 젤은 망막을 죽일 수 있습니다
. - 동물, 명백히하다에게 안구를 안락사와 세안 컵으로 엽니다. 유리체 유머를 녹일 수, 열린 세안 컵이있다면 반드시, 매체 hyaluronidase 10 분 (0.07 MG / ML)에 절어있다.
- 블록 (예, 마우스 망막에 대한 1cm가 X 1.5 cm)에 한천을 잘라 굳게 인스턴트 접착제에 의해 vibratome 무대에 첨부하여 보내드립니다. 한천 블록이 젖었 유지.
- 기계에서 5 정도에서 칼날을 놓습니다. 부드럽게 약의 속도에 한천 블록의 상단 표면을 잘라. 50 μm의 / 초, 주파수. 50 Hz에서.
팁 : 한천 블록의 상단 표면이 완전히 부드럽고 평평한되었는지 확인하십시오. 몇 가지 상처는 (적어도 3 회) 한천 블록의 부드럽고 평평한 표면을 필요 수 있습니다.
- hyaluronidase없는 매체로 세안 컵을 씻어. 안료 상피에서 망막을 분리하여 필터 종이에 photoreceptor 쪽을 놓으십시오. 단단히 필터 종이에 망막을 첨부하려면 필터 종이에 여러 번 망막을 진공.
팁 : 망막이 완전히 평면 필터 종이에 첨부되어 있는지 확인합니다. 이 필터 종이에 망막을 넣어 후, 망막 (Fig.2A)를 둘러싼 초과 필터 종이를 잘라. 초과 여과지는 종종 망막의 해당 계층에 갈의 칼날을 방지합니다.
- 부드럽게 한천 블록에있는 여분의 매체를 쓸어 조심스럽게 한천 블록에 필터 종이에 망막을 놓으십시오. 단단히 한천 블록에 여과지를 삽입하려면 필터 용지의 가장자리에 즉시 접착제를 첨부해 주시기 바랍니다.
팁 : unexpectable 균열을 방지하려면, 한천 블록의 상단 표면에 가능한 전면으로 망막를 놓습니다.
- 부드럽게 망막을 통해 낮은 온도 용해 아가로 오스 젤 잔. 1 분 기다린 후 부드럽게 아래로 냉각로에있는 매체를 부어. 아가로 오스 겔은 신속하게 확정됩니다.
팁 : 너무 뜨거운 아가로 오스 겔은 망막을 죽이면.
- 한천 블록의 상단 표면 위의 여러 수백 μm의에 칼날 위치를 허용하고 부드럽게 경화 아가로 오스 겔의 상단을 잘라.
- 블레이드 위치를 내려. 내부 핵 계층 (한천 블록의 상단 표면 위 200 사이 250 μm의 약)의 근위 분의 수준에서 망막을 잘라요.
팁 : 블레이드 너무 많아 속도는 심각한 망막 손상을 것입니다. 약. 50 μm의 / 초 (50 Hz에서)이 적합합니다.
- amacrine 세포가 처형될 위기에 다운됩니다 확인할 수 있습니다. 조심스럽게 경화 아가로 오스 겔와 함께 망막의 슬라이스를 선택하고 챔버 또는 접시에 얼굴까지 그것을 놓으십시오.
팁 : 마우스 망막은 작은과 물결 모양이기 때문에, 그것이 적절한 계층에서 완벽한 수평 슬라이스를 얻을 어렵습니다. "경사"슬라이스는 망막의 상대 평면 슬라이스를 얻을 다른 방법 수 있습니다. 경사 슬라이스를 얻으려면, 필터 종이와 같은 Fig.2B 같이 한천 블록에있는 망막 사이에 또 다른 필터 종이를 넣어. 당신은 완벽한 수평 단면을 기대할 수는 없지만, amacrine 세포의 소마는 조각의 표면에 일부 지역은 항상있다.
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Discussion
망막의 수평 슬라이스 준비의 여러 가지 중요한 장점이 있습니다.
첫째, 같은 amacrine 세포와 수평 세포와 같은 가로 dendrites를 확장하고 세포의 형태가 보존됩니다. 그것은 그것이 생리적 속성과 세포의 형태를 비교하는 것은 매우 중요하므로, 망막에 amacrine 세포의 20 종류 (맥닐 및 Masland, 1998) 이상이있다는 것을 보여왔다.
둘째, 전체 마운트 망막에 glial 세포의 endfeets의 광범위한 보험 amacrine 세포 패치 pipettes의 액세스를 방지합니다. 가로 조각에서 amacrine 세포의 소마는 조각의 표면에 노출됩니다.
이들은 조각의 표면에 위치하기 때문에 셋째, 화학 시약 쉽게 타겟 세포 및 dendrites에 도달할 수 있습니다. 워시 (Wash) - 및 세척 아웃 화학 물질의 신속하고 용이합니다.
넷째, 이러한 종래의 칼슘 이미징과 같은 형광 이온 이미징은 performable입니다. 전통적인 수직 조각 또는 전체 마운트 망막에서 이미지 자체에 대한 여기 표시등이 photoreceptors을 활성화한다. 여기에 대한 오염 가벼운 evoked 유물이 없습니다 않도록 수평 슬라이스 준비에 photoreceptors과 photopigments가 완전히 제거됩니다. photoreceptors의 배경 활동이 제거되기 때문에 또한, 영상의 신호 대 잡음 비율이 훨씬 높다. 수평 슬라이스 준비의 가장 큰 단점은 photoreceptors와 신경절 세포 사이의 수직 연결이되므로 슬라이스 이내에 시각 정보 처리가없는 상처입니다.
이 기술은 금붕어, 마우스 및 토끼 (Fig.1B)와 같은 표준 동물의 망막에 적용됩니다. 수평 단면의 방법은 뉴런과 망막에있는 신경 회로의 기능을 조사하는 대체 방법을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
모든 실험 프로토콜은 동물의 사용을위한 건강 지침 국립 연구소에 따라 실시되었다.
Acknowledgments
우리는 DRS 감사합니다. 망막의 수평 슬라이스 준비 절차를 확립하기 위해 우리에게 귀중한 조언과 제안을 주셔서 리차드 H. Masland 및 Akimichi 가네코.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Sigma-Aldrich | A-1296 | |
| Agarose L | Wako Pure Chemical Industries, Ltd. | 317-01182 | Low-temperature melting agarose |
| Hyaluronidase | Sigma-Aldrich | Type I-S, 300 U/mg | |
| Medium | in mM: 102 NaCl, 3.1 KCl, 2.0 CaCl2, 1.0 MgCl2, 23 NaHCO3, and 10 glucose, maintained at pH 7.8, or, Ames’ Solution (Sigma) | ||
| Microwave | |||
| Hot water bath | 35 °C | ||
| Vibratome slicer | Leica Microsystems | VT1000S | |
| MF-Membrane filters | EMD Millipore | HAWP01300 | Filter paper , pore size 0.45 µm |
| Dissection tools | forceps, blade, pinch, twizzer, etc. | ||
| Instant glue | e.g. Alonalpha, Krazy Glu | ||
| 50 mL Syringe | |||
| Syringe filter | EMD Millipore | SX0001300 |
References
- Azuma, T., Enoki, R., Iwamuro, K., Kaneko, A., Koizumi, A. Multiple spatiotemporal patterns of dendritic Ca2+ signals in goldfish retinal amacrine cells. Brain Res. , 64-73 (2004).
- Koizumi, A., TC, J. akobs, Masland, R. H. Inward rectifying currents stabilize the membrane potential in dendrites of mouse amacrine cells: patch-clamp recordings and single-cell. , 328-340 (2004).
- MA, M. acN. eil, RH, M. asland Extreme diversity among amacrine cells: implications for function. Neuron. , 971-982 (1998).
