リバーシブルビオチン化によって原形質膜タンパク質エンドサイトーシス率を測定

Summary

規制エンドサイトーシスは、膜タンパク質の大部分の細胞表面発現レベルを制御します。ここでは、ドーパミントランスポーター（DAT）、ポリトープ膜​​タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するために還元、膜非透過性ビオチン化試薬を利用する。メソッドは、ほとんどの細胞膜タンパク質のエンドサイトーシス率を測定するための直接的なアプローチを促進する。

Abstract

細胞膜タンパク質は、受容体、イオンチャネル、トランスポーターとポンプで構成されるタンパク質の大規模、多様なグループです。これらのタンパク質の活性は栄養デリバリー、細胞の興奮、および化学的シグナル伝達を含む主要な携帯電話のイベント、様々な責任があります。多くの細胞膜タンパク質は、動的にタンパク質の表面発現を変化させることによってタンパク質の機能を調節するエンドサイトーシスの人身売買、によって規制されている。タンパク質のエンドサイトーシスを促進するメカニズムは複雑であり、完全に多くの膜蛋白質のために理解されていません。完全に与えられたタンパク質のエンドサイトーシス売買を制御するメカニズムを理解するためには、それはタンパク質のエンドサイトーシスの速度を正確に測定することが重要です。多くの受容体の場合は、直接エンドサイトーシスの速度の測定は、頻繁に標識された受容体リガンドを利用して実現されています。しかし、そのようなトランスポーター、ポンプ、イオンチャネルなど膜タンパク質の多くのクラスに対して、エンドサイトーシス速度を測定するために使用できる便利なリガンドはありません。本報告では、我々はドーパミントランスポーター（DAT）エンドサイトーシス率を測定するために採用することを可逆的ビオチン化の方法を説明します。このメソッドは、内在化率を測定するための直接的なアプローチを提供し、容易にほとんどの膜タンパク質の人身売買の研究に用いることができる。

Protocol

手順の概要： このアプローチを使用して、細胞表面のタンパク質が共有結合膜の透過性を使用して、使用可能な外リジン残基上のビオチンで標識され、人身売買制限された条件下でのジスルフィド結合のビオチン化試薬（スルホ- NHS – SS -ビオチン）（すなわち、低温）（図1参照説明のため）。細胞の1つのセットが人身売買許容条件にシフトし（37℃）とビオチン化タンパ…

Discussion

一般的な問題 ：これらの実験で発生する最も一般的な問題は、貧しいストリップ効率です。ストリップの効率は、結果を解釈できることに非常に重要です。ストリップは非常に効率的でない限り、それは内面化の車線内の任意のビオチン化タンパク質は、実際には、表面から内部化されたと結論することはできません。ストリップ≥90％の効率が最適であり、そしてストリップがこの?…