Summary
このプロトコルは、ミトコンドリアクリステを再構築して、高精度、高解像度、および高スループットの3Dイメージングを実現する方法について説明します。
Abstract
未知の情報が豊富であるだけでなく、3次元(3D)の視点から洗練された細胞小器官の微細構造の動的特徴を理解することは、機構研究にとって重要です。電子顕微鏡(EM)は、優れたイメージング深度を提供し、高解像度の画像スタックの再構築を可能にして、ナノメートルスケールでも細胞小器官の微細構造形態を調査できます。したがって、3D再構築は、その比類のない利点のために重要性を増しています。走査型電子顕微鏡(SEM)は、連続したスライスの同じ関心領域から大きな構造を3Dで再構築できるハイスループット画像取得技術を提供します。したがって、細胞小器官の真の3D微細構造を復元するための大規模な3D再構成におけるSEMの適用はますます一般的になっています。このプロトコルでは、膵臓癌細胞のミトコンドリアクリステを研究するために、連続超薄切片と3D再構成技術の組み合わせを提案します。これらの技術がどのように実行されるかの詳細は、オスミウム-チオカルボヒドラジド-オスミウム(OTO)法、シリアル超薄切片イメージング、および視覚化表示を含む、このプロトコルで段階的に説明されています。
Introduction
ミトコンドリアは細胞内で最も重要な細胞小器官の1つです。それらは細胞の生体エネルギーと代謝の中心的なハブとして機能し1,2、癌において重要な役割を果たします3。膵臓がん(PC)は、その急速な広がりと高い死亡率のために、治療が最も困難ながんの1つです4。主にミトコンドリアの形態の変化によって引き起こされるミトコンドリア機能障害3,5,6,7は、PC8の根底にある疾患メカニズムに関連しています。ミトコンドリアも非常に動的であり、これはネットワーク接続とクリステ構造の頻繁かつ動的な変化に反映されています9。クリステ構造の再形成は、ミトコンドリア機能と細胞状態に直接影響を与える可能性があり10,11、腫瘍細胞の成長、転移、および腫瘍微小環境の変化中に著しく変化します12,13。
近年、科学者たちはEM観察14,15,16,17を用いてこの細胞小器官を研究しています。たとえば、研究者は3D再構成技術を使用してミトコンドリアのダイナミクスを分析しました6、7、18、19。電子顕微鏡画像の3D再構成の一般的な概念と方法は、早くも196820に正式に確立され、電子顕微鏡、電子回折、およびコンピューター画像処理を組み合わせてT4ファージテールを再構築することが含まれていました。これまで、電子顕微鏡3Dイメージング技術は、画像解像度21、自動化度22、処理量23の面で大きな進歩を遂げ、組織レベルからナノメートルスケールのオルガネラ微細構造レベル24まで、生物学研究においてますます幅広い規模で使用されてきました。近年、電子顕微鏡3Dイメージングも幅広い用途の有望な技術となっています25、26、27。
ミトコンドリアクリステへの注目の高まりは、特に微細構造体積イメージングの本質的な要件を示しています。透過型電子顕微鏡(TEM)は、銅グリッド(400メッシュ)28に集められたサンプルを視覚化するために使用され、電子ビームはセクションを通過します。しかしながら、銅グリッドの範囲が限られているため、同じサンプル29の連続スライスを完全に画像化することは不可能である。これは、TEMイメージング中の標的構造の研究を複雑にする。さらに、TEMは、複数のスライスの切断と収集、およびそれらを順次イメージングするなど、時間がかかり、エラーが発生しやすい手動タスクに依存しているため21、大量のサンプルの微細構造再構成には適していません23。現在、TEMカメラアレイ(TEMCA)30 や2台の第2世代TEMCAシステム(TEMCA2)31など、短時間でハイスループットなイメージングを自動化する専用装置を使用することで、大容量サンプルイメージングの高解像度再構成を実現しています。ただし、このタイプのイメージングには、カスタマイズされた機器が必要なため、入手が容易で普遍的であるという利点はありません。
TEMと比較して、SEM32、33に基づいて大面積の数千のシリアル体積画像を自動的に生成する方法は、シリアルイメージングの効率および信頼性を高め、より高いz解像度を提供する34。たとえば、シリアルブロック面走査電子顕微鏡(SBF-SEM)と集束イオンビーム走査電子顕微鏡(FIB-SEM)はどちらも、高速、効率、解像度で微細構造の3D再構成を実現することを可能にしました35,36。ただし、SBF-SEMのダイヤモンドナイフまたはFIB-SEM33,37の集束イオンビームによるフライス加工によって、ブロック表面が機械的に削り取られることは避けられません。試料に対する2つの方法の破壊性のために、さらなる分析のために同じ標的構造を再び再構築することは不可能である38、39、40。さらに、EMを使用して癌細胞の3Dオルガネラ微細構造を再構築し、病理学的変化を観察することを試みた研究はほとんどありません12。このような理由から、膵臓がん細胞などのがん細胞の病態メカニズムをさらに解明するために、ウルトラミクロトームと電界放出型走査電子顕微鏡(FE-SEM)を用いて、ミトコンドリアの微細構造をクリステレベルで解析する新しい断面像を3次元再構成する技術を提案する。この技術により、効率的でアクセスしやすい方法で高解像度のデータを取得できます。ウルトラミクロトームを使用して作られた連続超薄切片は、グリッドケースに半永久的に保管し、数年後でも複数回再イメージングすることができます41。FE-SEMは、高解像度のイメージング、高倍率、汎用性を提供できるため、さまざまな研究分野でツールとして高く評価されています42。オルガネラの微細構造を3Dで表示するために、FE-SEM 43,44によって生成された後方散乱電子を使用して有用な解像度でシリアル2D画像スタックを生成する技術を使用して、特別な装置なしでターゲット領域またはそれらに関連する構造のハイスループットおよびマルチスケールイメージングを達成することもできます45.電荷アーチファクトの生成は、取得した画像の品質に直接影響するため、滞留時間を短くすることが特に重要です。
したがって、本研究では、ミトコンドリアクリステ46の3D構造を再構築するためにこのSEM技術で採用された実験手順について詳しく説明します。具体的には、従来のOTO標本作製法44,47を用いたスライスサンプルの作成、ウルトラミクロトームスライスによる切片採取の完了、FE-SEMによる逐次2Dデータの取得など、Amiraソフトウェアを用いたミトコンドリア領域の半自動セグメンテーションと3D再構成のデジタル化を実現するためのプロセスを紹介します。
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Protocol
1.材料の準備
- 12 mLのDMEM培地(10%ウシ胎児血清および100 U/mLペニシリン-ストレプトマイシン)で2 x 106 Panc02細胞を培養し、5%二酸化炭素および95%空気の雰囲気下で37°Cおよび95%湿度で48時間維持します。
- Panc02細胞を回収し、28 x g で2分間遠心分離した後、上清を廃棄します。サンプルが適切なサイズ(1 x 107 セル)であることを確認してください、そうしないと、次の固定および脱水手順がうまく機能しません。
- 固定液として1 mLの2.5%グルタルアルデヒドを添加し、新鮮なPanc02細胞を1.5 mLマイクロ遠心チューブに4°Cで一晩固定します。
注意: サンプルは、次の各ステップ(ステップ1.3〜1.11)で1,006 x g で5分間遠心分離する必要があります。 - 固定液を吸引し、サンプルを0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回すすぎ、次に室温で二重蒸留水(ddH2O)でそれぞれ10分間2回すすぎます。
- 1%四酸化オスミウム(OsO4)と1.5%フェロシアン化カリウムを含む溶液50 μLを1:1の比率で4°Cで1時間加えます。その後、毎回0.1 M PBSで10分間2回すすぎ、さらにddH2Oですすぎます。
- 1 mLの1%チオカルボヒドラジド(TCH)を加え、室温で30分から1時間インキュベートした後、ddH2Oで毎回10分間4回すすぎます。
- 50μLの1%OsO4を添加し、室温で1時間固定した後、ddH2Oで毎回10分間4回すすぎます。
- 1 mLの2%酢酸ウラニルを4°Cで一晩加え、ddH2Oで4回、毎回10分間すすぎます。
- 1 mLのウォルトン溶液(0.066 gの硝酸鉛を10 mLの0.03 mol/Lアスパラギン酸ストック溶液に溶解)を60°Cで加え、さらに1時間インキュベートします。
- ddH2Oで毎回10分間4回すすぎ、次に段階的なアルコールシリーズで毎回10分間脱水します:50%アルコール、70%アルコール、80%アルコール、90%アルコール1x、および100%アルコール2x。その後、100%アセトン中で毎回10分間2回脱水します。脱水には各溶液1 mLを使用します。.
- 200 μLのアセトンをPon 812エポキシ樹脂と3:1、1:1、および1:3の比率で混合します。サンプルを室温でそれぞれ2時間、4時間、4時間樹脂に浸し、100%Pon 812エポキシ樹脂を一晩含浸させます。
注:染色および樹脂包埋ステップを実行する場合、これらは有毒物質であるため、ドラフト内で操作することが重要です。さらに、実験中は白衣と耐溶剤手袋を着用する必要があります。 - 試料を埋め込み型に入れ、60°Cのオーブンに48時間入れて重合させます。フラット埋め込み29 を使用して、サンプルの周囲の樹脂の外観を減らします。これにより、試料の設置が簡素化され、その後の画像セグメンテーションに対する帯電アーチファクトの影響が軽減されます。
注: 後で水平な切断面を生成するには、金型穴に少量の樹脂を追加し、過剰に充填しないように注意します。 - シリコンウェーハを最初に洗浄し、次に濃縮H 2 SO4 / H 2O2溶液で30分間親水化することによってシリコンウェーハを準備します。ウルトラミクロトームを用いて親水化したシリコンウェーハ上に厚さ70nmのスライスストリップを連続的に回収し、60°Cのオーブンで10分間乾燥させます。
注意: スライスがウェーハの表面に浮かぶときにスライスをゆっくりとキャプチャして、スライスの損失や変形を防ぎます。
2. 画像取得と3次元再構成
- シリコンウェーハをステージに取り付ける前に、切片を蒸留水で3回洗浄し、風乾します。1 cm x 0.5 cmの大きさの導電性カーボンテープをカットし、シリコンウェーハとSEM試料ステージの間に貼り付けてサンプルのセットアップを完了します(図2E)。
- FE-SEM加速電圧パラメータを2 kVに設定し、作動距離は4 mmです(図3B および 表1)。
注意: 信号対雑音比を改善し、画像のノイズを減らすために、可能な限り低倍率で観察してください。倍数が増加すると、SEMのスキャン範囲が狭くなり、画像上の電荷蓄積が増加します。 - 上部のメニューバーにある H / Lアイコン をクリックします。まず、低倍率で、ターゲットスライスストリップの最初のセクションの向きを変えてから、 H / L オプション(図3A)をもう一度クリックして高倍率モードに切り替えます。画像の明るさ、コントラスト、および倍率を調整して、目的の構造に適した画像を収集します。
- [プロジェクトビュー]>[データを開く]を選択し、解析する画像ファイルをソフトウェアにインポートします。
- [スライスの整列>編集]をクリックして画像を 整列 し(図4B)、画像の透明度を変更して左下のメニューバーの [強度範囲 ]の値を調整します。ここでは、半自動アライメント戦略を使用します。具体的には、自動位置合わせにより、画像を前の画像と重ね合わせてから、手動で微調整を行います。
注:この作業では、位置合わせのプロセス中に、前の画像を参照として使用し、移動と回転の操作を使用して、2つの画像のターゲット構造を最大限に重ね合わせました。 [現在のスライスペア を整列]をクリックすると、画像を自動的に整列させることができますが、配置が間違っている可能性があります。 - サブボリュームの抽出モジュールを選択し、スタック全体の重なり合う部分のサイズに合わせてアライメントされたデータセットをクリップします。
- セグ メンテーションサブ セクション(図4C)で、 セグメンテーション>リサンプル>保存を選択します。 魔法の杖 のしきい値と ブラシ ツールのサイズを選択して、正しい範囲を選択します。ここでも、最初に 魔法の杖 を使用して適切な広い領域を自動的に選択し、次に ブラシ を使用して詳細を正確に記述することにより、半自動セグメンテーション方法を採用します。
注: マジックワンド は、 マスキング 値を変更し、 描画制限線を使用することにより、対象の構造と周囲の構造の間に存在するピクセル強度の明らかな違いに基づいて画像をセグメント化するために適用できます。画像取得中に発生する帯電アーチファクトを区別することはできません。そのため、ターゲット リージョンのセグメンテーションが正しくなくなる可能性があります。 ブラシ ツールを使用して手動でセグメント化し、生物学的構造を正確に再構築できます。 - [セグメンテーション>選択]で、[+]アイコンをクリックして、選択した領域を追加します(図4C)。
- 上記の手順(2.8)を繰り返して、目的の微細構造を再構築するための選択が完了するまで、異なる画像で同じターゲット構造を選択します。
注:ミトコンドリアのリモデリングプロセス中、ターゲットオブジェクトの選択は、連続した画像のグループの中央にある画像から実行する必要があります。最初または最後の画像から必要な領域が選択されている場合、再構築結果は完全な3Dビジュアライゼーションを表示できません。 - 地域セグメンテーションが完了したら、オブジェクトのサイズと画像の解像度に最適な結果に従って画像ファイルを生成します。 [切り抜きエディタ]をクリックし、[ 仮想スライダー ]ボックスに番号6を入力します(図4C)。
- 左側のドロップダウン メニューで、[ プロジェクト ]サブセクションの下にある灰色の領域を右クリックし、[ サーフェスを生成]>[作成>適用]を選択します。生成されたファイルで、 サーフェス ビュー モジュールを使用して、サーフェス構造と 3D 表現を作成します。
3. 定量化
- [ 小さなスポットを削除]をクリックして適用> (図4D)。 [プロジェクト ]サブセクションで、灰色の領域を右クリックし、[ ラベル解析]>[適用 ]を選択します(図4D)。
- 列の名前をカスタマイズし、メジャー グループを選択します。ネイティブ測定ボックスからボリューム3dと長さ3dを選択します。
- 画面の左下隅にある[ 適用 ]ボタンをクリックします。データをコピーし、GraphPadなどの統計ソフトでグラフ化します。
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Representative Results
細胞培養(図1A)では、まず膵臓がん細胞を完全培養液で培養した対照群、(1S,3R)-RSL348(RSL3、フェロトーシス活性化因子、100nM)群、およびRSL3(100nM)プラスフェロスタチン-149(Fer-1、フェロトーシス阻害剤、100nM)群に分けました。以上の実験ステップにより、走査型電子顕微鏡により、対照群、RSL3群、阻害剤群(RSL3+Fer-1群)について、それぞれ38枚(補足図1)、43枚(補足図2)、44枚(補足図3)の連続画像を取得した。1,280×960画素の画像を8,000倍の倍率(解像度12.40nm/画素)で撮影しました。細胞領域のしわおよび汚染の両方が切片の上に観察されなかった。電子顕微鏡の写真は、細胞内のミトコンドリアや小胞体などの細胞小器官を明確に区別することができました(図1E)。
FE-SEMによる2D画像の観察は、癌細胞の対照群(図5A)において、ミトコンドリアが細胞質全体に分布しており、それらのほとんどは球形または楕円形であり、均一にふっくらしていることを示した。さらに、比較的規則的で細長いクリステ建築がはっきりと見えました。逆に、RSL3群(図5D)では、ミトコンドリアの大部分が収縮形態、膜密度の増加、および比較的曖昧なクリステ構造を示しました。SEM写真(図5E)を詳しく調べると、比較的少数のクリステが無傷のままであったため、すべてのミトコンドリアクリステが変性または消失したわけではないことが明らかになりました。RSL3群と比較して、阻害剤群では、ほとんどのミトコンドリアがミトコンドリアクリステの内在構造を維持しており、ミトコンドリアクリステ構造の少数のみが明らかではありませんでした(図5G)。
2D情報はミトコンドリアの形態の違いを示すが、それは時々、詳細で実際の3D構造の偏った理解をもたらす可能性がある50、51。3D条件下(図5C)の対照群のクリステ構造は2D画像と一致したが、RSL3群では異なっていた。このグループでは、完全なミトコンドリアクリステの存在も2D画像で観察できましたが(図5E)、3D下のミトコンドリア(図5F)は不規則で、中央で一般的に空胞化されていました。阻害剤群(図5I)は多様なクリステ形状を示し、一部のミトコンドリアクリステのみが局所的な崩壊を示しました。このように、RSL3群の結果から、2次元解析のみを用いることで、結果の一方的な理解につながる可能性があることがわかる。2D画像の結果は、3D表示用に一連の画像を積み重ねたときに表示される結果と比較して偏っているため、2D情報のみで生成された結果を一般化することはできません。ミトコンドリアに対するRSL3の効果をより客観的に実証するために、3D再構成データを使用してミトコンドリアの変化を定量化および測定しました52。対照群と比較して、RSL3群の3Dミトコンドリアの長さと体積は有意に減少しましたが、阻害剤群の定量結果は他の2つのグループの結果の間にありました(図5J、K)。これらの定量的データは、RSL3がより小さく分解されたミトコンドリアを産生し、阻害剤の添加がこの効果を減少させることを示唆している。
図6Bおよび図6Cに示すように、フェロトーシス誘導因子RSL3は、ミトコンドリアの形態を変化させ53,54、RSL3によって誘発される癌治療における動的細胞死の遍在型を表す可能性のあるフェロトーシスを誘発することによって、ミトコンドリア機能不全を引き起こし、細胞代謝に影響を及ぼすことが決定された55。
図1:膵臓がん細胞ミトコンドリアの3D再構築のための一般的なワークフロー。 このプロトコルで説明されている3D再構成実験の一般的なワークフローが示されています。(a)膵臓癌細胞の培養。(B)樹脂ブロックの作製。(C)ウルトラミクロトームを用いた連続切片の採取。(D)電界放出型走査電子顕微鏡を用いた2次元画像の取得。(E)シーケンシャルSEM画像における標的ミトコンドリアの位置。(F)ミトコンドリアの3D解析。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:親水化されたシリコンウェーハ上に連続スライスをスライスストリップに取り付けるための装置。 (A)ウェーハを保持するための鉗子を備えた角度調整可能なマニピュレーター。(B)ウルトラミクロトームの隣に置かれたウェーハホルダーのフレーム。(C)ダイヤモンドナイフを含む青いスロットへのシリコンウェーハの位置決め。(D)シリコンウェーハとダイヤモンドナイフブレードの位置関係を示すクローズアップ。(E)導電性カーボン接着剤でSEMのサンプルステージにスライスストリップが取り付けられたシリコンウェーハ。(F)シリアルスライスストリップの一般的な概要を示すクローズアップ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:パラメータの設定と画像の取得のプロセス。 (A) FE-SEMのメニューバー(矢印はH / Lオプションを指しています)。(B)撮像パラメータ及び条件の表。(C)3つのグループにおける連続した2D画像の概要。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:Amiraを使用してミトコンドリアを3Dで視覚化するためのステップバイステップガイド。 (A)特定のフォルダから画像をインポートします。(B)ターゲット構造に従って画像スタックを整列させる。(C)関心領域をセグメント化して追加する。(D)3D構造を再構築し、定量化データを追加する。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:各グループのミトコンドリアの2Dおよび3D形態。 対照群の2D癌細胞形態を(A)8,000倍の倍率および(B)15,000倍の倍率で示す。(C)対照群のミトコンドリア形態の3D表現。RSL3群の2D癌細胞形態を(D)8,000倍の倍率および(E)15,000倍の倍率で示す。(F)RSL3群のミトコンドリア形態の3D表現。RSL3+Fer-1(阻害剤)群の2D癌細胞形態を(G)8,000倍の倍率および(H)15,000倍の倍率で示す。(i)RSL3+Fer-1(阻害剤)群のミトコンドリア形態の3D表現。各群におけるミトコンドリアの(J)長さおよび(K)平均体積に関する定量的データである。有意差はアスタリスクで示され、スチューデントのt検定を使用して計算されました(対照群、*p≤0.05、**p≤0.01、***p≤0.001。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図6:がん細胞のミトコンドリア形態の2Dレベルと3Dレベルで の違い。 (A)8,000倍の倍率でのRSL3群の2次元がん細胞形態。(B)より高い倍率での2Dミトコンドリア形態。(C)特定のミトコンドリアの3D表現。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| イメージングパラメータ | 条件 |
| データサイズ | 1280 × 960 |
| ピクセルサイズ | 12.40234 |
| 加速電圧 | 2000ボルト |
| 作動距離 | 3700μm |
| 排出電流 | 13700 nA |
| ビーム電流 | 10μA |
| 電流制限アパーチャ | FE-SEMの2番グレーチング |
| 滞留時間 | 32 マイクロ秒/ピクセル |
| セル数 | 107 |
| イメージボリューム | 10×8×2.66μm, 212.8μm³ |
| 10×8×3.01μm, 240.8μm³ | |
| 10×8×3.08μm, 246.4μm³ |
表1:画像取得のための記録条件とデータセットパラメータの概要。
補足図1: 対照群からの38の癌細胞微小切片の画像の概要。 各マイクロセクションの画像番号は上から下に並べられています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2: RSL3群の43個のがん細胞微小切片の画像の概要。 各マイクロセクションの画像番号は上から下に並べられています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:RSL3+Fer−1(阻害剤)群からの44個の癌細胞微小切片の画像のOビュー。 各マイクロセクションの画像番号は上から下に並べられています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介する方法は、連続した超薄膜切片から生成された2D断層画像の積層とセグメンテーションに電子顕微鏡と画像処理技術を適用することを含む3D再構成技術を適用するための有用なステップバイステップガイドです。このプロトコルは、高解像度レベルでの構造の強力な再現性とより高い精度の利点を持つオルガネラ微細構造の3D視覚化によって対処できる2D画像の限界を強調しています。さらに重要なことに、この3D視覚化を腫瘍細胞に適用して、病理学的メカニズムの研究をより簡単で信頼性の高いものにすることができます。本研究では、異なる条件下で3組の連続切片を比較することでミトコンドリアクリステの立体構造を可視化する手法を検討し、がん細胞で起こるRSL3誘導ミトコンドリアクリステ膜分解を検証した56。これらの結果は、抗膵臓がん薬としてのRSL3の作用機序に関する洞察を提供します。
高解像度の2D画像の取得は、ミトコンドリアクリステの3D再構成57のプロセスにおいて重要な役割を果たし、画質は再構成結果22、58に直接影響します。したがって、この方法には、SEM画像59で生成される帯電アーチファクトなどのいくつかの制限もあり、その結果、ターゲット構造の誤ったセグメンテーションにつながる可能性がある。この問題は、スライススキャン時間を短縮し、SEMに焦点電荷補償器34,60を装備し、TCHを使用して追加の金属61で染色することによってサンプルを電子に対してより伝導性にすることができるOTO法を使用することによって解決することができる。自動画像セグメンテーションに依存することは、構造の範囲を決定するという点で不正確になる傾向がありますが、手動セグメンテーションは時間がかかります58。したがって、画像収集62を実現するためのSEMの高速スキャンの利点に基づいて、Amiraソフトウェアの半自動セグメンテーションを使用して、効率的なイメージングおよび再構成を可能にすることができる。Amiraソフトウェアを使用すると、FIJIおよびMIB63を使用するよりも正確で正確な結果を得ることもできます。3Dイメージングの重要なステップは、超薄型切片を取得することです。画像の連続性に影響を与える脱落、破壊、歪みなどの問題は、断面収集中によく発生します。スライスの紛失や破損などの問題を解決するために、スライスストリップの収集のサポートとして親水化されたシリコンウェーハを使用しました。
SBF−SEMおよびFIB−SEMは切片の変形または欠陥を減少させることができるが、これらの技術はイメージング速度が遅く、高価な機器を必要とし、目的の構造を再イメージングすることができない64,65,66。FIB-SEMはイメージング中のシステムの安定性に欠け、一方SBF-SEMは複雑なサンプル調製ステップと面倒なワークフローによって妨げられます34。最近、誘導放出枯渇(STED)顕微鏡イメージングがミトコンドリア構造の研究に徐々に適用されています。この方法は、ミトコンドリア標識用のプローブの構築を通じて、生細胞内のミトコンドリアクリステの3Dリアルタイム画像をモニターします67。蛍光色素標識は、ミトコンドリア融合および核分裂中のクリステアにおける変化過程を明らかにすることができる68。しかしながら、生細胞は強い光に対する耐性が限られているため、この技術を長期のSTEDイメージングに使用することは困難である68。さらに、STEDは、その解像度、画像深度、およびピクセル番号69によって制限されます。
他の技術と比較して、連続超薄切片と3D再構成技術を組み合わせてオルガネラの微細構造を広い視野から観察することで、短時間でハイスループットなイメージングが可能になるだけでなく、離散時間でターゲット構造の高解像度画像を調べることもできます21これにより、イメージング速度と再構成の柔軟性が向上します。さらに、オルガネラの形態変化や他のオルガネラとの空間的つながりをさらに調べることができます。これらの側面を定量化することができ、隣接するオルガネラを再構築してそれらの位置関係を表示することによって、変化のメカニズムをより正確に明らかにすることができる70、71。Amira58を用いた3D再構成と連続切断イメージングのこの技術は、疾患とオルガネラの微細構造変化との相関をナノスケール72で明らかにし、医学、生物学、その他の分野で広く使用されており、効果的な新しい治療法の開発への道を開きます73,74。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
この研究は、浙江省自然科学財団の助成金(Z23H290001、LY19H280001)の支援を受けました。中国国家自然科学財団の助成金(82274364、81673607、および81774011);湖州科学技術助成金の公共福祉研究プロジェクト(2021GY49、2018GZ24)。浙江省中国医科大学中国医学アカデミー医学研究センターのパブリックプラットフォームからの多大な支援、技術サポート、実験的サポートに感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| (1S,3R)-RSL3 | MCE | HY-100218A | |
| Acetone | SIGMA | 179124 | |
| Amira | Visage Imaging | 2020.2 | |
| Aspartic acid | MCE | HY-42068 | |
| Dulbecco's modified Eagle’s medium | Gibco | 11995115 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| Ferrostatin-1 | MCE | HY-100579 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10437010 | |
| Field emission scanning electron microscope | HITACHI | SU8010 | |
| Glutaraldehyde | Alfa Aesar | A10500.22 | |
| Lead nitrate | SANTA CRUZ | sc-211724 | |
| Osmium Tetroxide | SANTA CRUZ | sc-206008B | |
| Panc02 | European Collection of Authenticated Cell Cultures | 98102213 | |
| Penicillin-streptomycin | Biosharp | BL505A | |
| Phosphate Buffered Saline | Biosharp | BL302A | |
| Pon 812 Epoxy resin | SPI CHEM | GS02660 | |
| Potassium ferrocyanide | Macklin | P816416 | |
| Thiocarbohydrazide | Merck | 223220 | |
| Ultramicrotome | LEICA | EMUC7 | |
| Uranyl Acetate | RHAWN | R032929 |
References
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