Lesione neurale indotta da laser a due fotoni: un metodo per osservare la degenerazione e la rigenerazione dell'assone nelle larve di Drosophila

Overview

Questo video descrive l'ablazione laser a due fotoni degli assoni in una larva di Drosophila melanogaster e un protocollo di esempio per indurre lesioni e immagini il sito della lesione.

Protocol

Questo protocollo è un estratto da Li et al., A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp.

1. Lesioni da due fotoni e imaging confocale

1. Configurazione del microscopio
   NOTA: Per questo esperimento è stato utilizzato un microscopio a scansione laser confocale con un laser a due fotoni, ma saranno sufficienti anche altri sistemi con una configurazione equivalente. Il laser a due fotoni (930 nm) è stato utilizzato per fornire lesioni e un laser Argon (488 nm) è stato utilizzato per l'imaging confocale della GFP.
   1. All'inizio di ogni sessione, accendere il laser a due fotoni e/o i laser confocali e il microscopio. Aprire il software di imaging.
   2. Per lesioni da due fotoni, impostare i seguenti parametri per l'imaging della GFP con il laser a due fotoni a 930 nm (1.950 mW).
      1. Selezionare la modalità di scansione delle linee. Apri il foro stenopeica fino in fondo. Aumentare l'intensità del laser a ~20% (390 mW).
      2. Selezionare 512 x 512 come scansione del fotogramma. Utilizzare la velocità massima di scansione (in genere con il tempo di rigonfiamento dei pixel a 0,77 μs). Assicurarsi che il numero medio sia 1 e che la profondità del bit sia di 8 bit.
      3. Impostate il guadagno su ~750 e l'offset su 0.
      4. Salvare questo protocollo sperimentale pre-impostato come 2P GFP 930 Ablation, consentendo un facile riutilizzo negli esperimenti futuri.
   3. Per l'imaging confocale, impostare i seguenti parametri per l'imaging GFP con il laser Argon a 488 nm:
      1. Selezionare la scheda Acquisizione e quindi Z-stack.
      2. Sotto "Laser", accendere la potenza per il laser Argon da 488 nm.
      3. Vai a Canali,seleziona il laser da 488 mm e aumenta la potenza del laser al 5-10%. Per il foro stenopeica, utilizzare l'unità ariosa 1-2 (AU). Regola il guadagno su 650.
      4. In modalità diacquisizione selezionare 1024 x 1024 come scansione del fotogramma, utilizzare la velocità massima di scansione, un numero medio di 2 e una profondità di bit di 8 Bit.
      5. Salvare questo protocollo sperimentale pre-impostato come GFP Imaging.
2. Anestesia delle larve con etere dietile e montaggio
   1. In una cappa aspirante, posizionare una piastra di vetro da 60 mm in una piastra di Petri in plastica da 15 cm. Piegare e posare un pezzo di carta velina nella parte inferiore del piatto di vetro, quindi posizionare un piatto di agar succo d'uva sul tessuto. Aggiungere l'etere dietile nel piatto di vetro, al punto che la carta velina è imbevuta e c'è uno strato di etere liquido che rimane nel piatto. Tieni sempre il coperchio.
   2. Preparare uno scivolo di vetro con una goccia di alocarbonio 27 olio al centro. Aggiungere 4 punti di grasso sottovuoto sui quattro angoli dello scivolo, per supportare successivamente il copripavimento.
   3. Usa le flesse per raccogliere una larva pulita e posizionarla sul piatto di agar nel piatto di vetro da 60 mm. Coprire il piatto di vetro con il coperchio e attendere che la larva smetta di muoversi. Per lesioni/imaging PNS, estraggono la larva non appena la coda smette di contrarsi. Per il SNC, attendere che l'intera larva diventi immobile, in particolare i segmenti della testa.
      NOTA: La tempistica dell'esposizione all'etere è critica. Cfr. discussione.
   4. Raccogliere con cura la larva anestetizzata e posizionarla a testa in su nella goccia di olio di alocarbonio sullo scivolo. Aggiungere una coverlip sopra la diapositiva. Utilizzare una pressione delicata per spingere verso il basso sul coverslip, fino a quando non tocca la larva (Figura 1A).
   5. Regolare la posizione della larva spingendo delicatamente il coverslip verso sinistra o destra per arrotolare la larva, in modo che il neurone / assone / dendrite di interesse sia in cima e più vicino alla lente del microscopio.
   6. Per la lesione del PNS, montare il lato dorsale della larva verso l'alto, in modo che entrambe le trachee siano visibili. Quindi arrotolare la larva ~ 30 gradi a sinistra per ferire gli assoni neuronali di classe III (Figura 1B e 1C), 90 gradi per ferire gli assoni neuronali di classe IV (Figura 1B e 1E), o ~ 30 gradi per ferire i dendriti neuronali di classe IV ( Figura2A).
   7. Per la lesione del SNC, posizionare la larva in modo che sia perfettamente ventrale verso l'alto (Figura 3A), in modo che la regione di interesse sia più vicina alla lente del microscopio nel piano z.
3. Lesione da laser a due fotoni
   1. Posizionare lo scivolo con la larva al microscopio e fissarlo in posizione con il supporto dello scivolo sul palco. Usa l'obiettivo 10X (0.3 NA) per trovare la larva.
   2. Aggiungere 1 goccia di olio obiettivo sul coverslip, passare all'obiettivo 40X (1.3 NA) e regolare la messa a fuoco.
   3. Passare alla modalità di scansione e riutilizzare il protocollo sperimentale 2P GFP 930 Ablation. Assicurati che il foro stenopeica sia aperto fino in fondo.
      NOTA: La configurazione deve essere ottimizzata in base ai singoli sistemi.
   4. Avvia la modalità Live per individuare l'area di interesse (ROI) e ottimizza le impostazioni per ottenere una buona qualità dell'immagine con lo zoom appropriato.
      NOTA: Lo scopo di questo passaggio è quello di trovare il neurone / assone / dendrite per ferire, piuttosto che prendere l'immagine di migliore qualità. Pertanto, utilizzare le impostazioni minime sufficienti per visualizzare l'area di destinazione, al fine di evitare la sovraesposizione o il fotobleaching.
   5. Interrompere la scansione live, in modo che il pulsante Ritaglia diventi disponibile. Lasciamo che l'immagine fissa funa da tabella di marcia. Selezionare la funzione Ritaglia e regolare la finestra di scansione in modo che si concentri sulla destinazione da ferire.
   6. Ridurre il ROI in modo che sia la dimensione del potenziale sito di lesione. Ad esempio, basta coprire la larghezza di un assone o di una dendrite, per garantire la precisione della lesione e ridurre i danni ai tessuti vicini. Se lo si desidera, ingrandire il ROI prima del ritaglio, consentendo lesioni più precise.
   7. Aprire una nuova finestra di imaging. Ridurre la velocità di scansione e aumentare l'intensità del laser. Determinare l'aumento dell'intensità del laser in base al segnale di fluorescenza tissutale scansionato in modalità Live.
   8. In genere, impostare l'intensità del laser a due fotoni a partire dal 25% per le lesioni PNS e dal 50-100% per le lesioni VNC. Per la lesione dell'assone PNS, assicurarsi che l'intensità del laser sia di ~ 480 mW e che il tempo di dimora dei pixel sia di 8,19 μs. Per la lesione dell'assone VNC, assicurarsi che l'intensità del laser e il tempo di divago dei pixel siano di solito rispettivamente 965-1930 mW e 8,19-32,77 μs.
   9. Avviare la scansione continua. Lasciare il cursore al passaggio del mouse sul pulsante Continuo. Tieni d'occhio l'immagine e interrompi la scansione non appena si osserva un drastico aumento della fluorescenza.
      NOTA: L'aspetto del picco di fluorescenza è dovuto all'autofluorescenza nel sito della lesione.
   10. Tornare alla modalità Live riutilizzando le impostazioni. Trova l'area di interesse che è stata appena presa di mira regolando lo stato attivo.
       NOTA: Una buona indicazione di lesioni di successo è la comparsa di un piccolo cratere, struttura ad anello o detriti localizzati proprio nel sito della lesione.
   11. Passare al neurone successivo e ripetere dal passaggio 1.3.5, per ferire più neuroni in un singolo animale. Oppure ripetere il passaggio 1.3.5 aumentando gradualmente la potenza e/o riducendo la velocità di scansione se la lesione iniziale era insufficiente.
       NOTA: Nel caso in cui la potenza del laser sia troppo alta, una grande area danneggiata sarà visibile nell'immagine di scansione dal vivo post-lesione. Troppe lesioni possono causare la morte della larva.
   12. Recupera la larva rimuovendo attentamente il coverslip e trasferendo la larva ferita su un nuovo piatto con pasta di lievito. Abbandona diverse grotte sul piatto di agar con le fusto; in alternativa, crea un'isola di agar nel piatto invece di usare l'intero piatto, per ridurre la possibilità che la larva striscia fuori dal piatto.
   13. Mettere la piastra in una piastra di Petri da 60 mm con tessuto umido (imbevuto di soluzione di acido propionico allo 0,5%) e coltura a temperatura ambiente o 25 °C.
       NOTA: La larva rimarrà nella fase larvale per circa un giorno in più a temperatura ambiente (22 °C) rispetto a 25 °C.
4. Imaging confocale post-infortunio
   1. Immagini la larva ferita nei punti di tempo desiderati preparando la larva usando la stessa procedura di anestesia e montando come nel passaggio 1.2, quindi imaging con il laser confocale.
      NOTA: Immagine della larva a 24 ore dopo la lesione (AI) per confermare la lesione assonale e a 48 h AI (neuroni da classe IV) o 72 h AI (neuroni da classe III) per valutare la rigenerazione.
   2. Individuare la larva utilizzando l'obiettivo 10X, quindi passare a un obiettivo 25X (0.8 NA). Riutilizzare il protocollo sperimentale GFP Imaging.
   3. Fare clic sul pulsante Live e individuare lo stesso neurone ferito in precedenza.
   4. Impostare la prima e l'ultima posizione Z nella finestra di scansione dal vivo. Premere interrompi e fare clic su Avvia esperimento per acquisire un'immagine dello stack Z.
      NOTA: Assicuratevi che un punto di normalizzazione (il punto convergente dell'assone) sia incluso nell'acquisizione delle immagini in modo che sia possibile la quantificazione della rigenerazione (Figura 1D, 1F) – questo viene discusso ulteriormente nella sezione analisi dei dati.
   5. Passare a Elaborazione immagini, selezionare l'immagine appena scattata e generare una proiezione di intensità massima. Salvare sia le immagini di proiezione z-stack che di massima intensità.

Representative Results

Figura 1: La rigenerazione dell'assone neuronale da neurone nella periferia mostra la specificità della classe. (A e B) Disegno schematico che mostra la posizione delle larve. (C) Disegno schematico dei neuroni di classe III da. (D) Gli assoni dei neuroni da di classe III ddaF, etichettati con 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, non riescono a ricrescere. (E) Disegno schematico dei neuroni di classe IV da. (F) Gli assoni dei neuroni da di classe IV v'ada, etichettati con ppk-CD4-tdGFP/+, ricresceno oltre il sito di lesione. (D e F) La linea rossa indica la lunghezza dell'assone mentre la linea tratteggiata verde segna la distanza tra il corpo cellulare e il punto convergente dell'assone (DCAC). Il punto blu segna il punto convergente dell'assone. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Rigenerazione della dendrite dei neuroni da parte del neurone. (A) Rappresentazione illustrativa dei neuroni di classe IV da. (B) Rappresentazione illustrativa della rigenerazione della dendrite nella classe IV da neuron ddaC, etichettata con ppk-CD4-tdGFP/+. L'ablazione laser è mirata al punto di diramazione primario ed è condotta a 48 h AEL. A 24 ore viene confermata la trasezione della lesione ai della neurite e viene quantificata a 72 ore la rigenerazione dell'IA. I dendriti dei neuroni ddaC dimostrano una sostanziale ricrescita, con nuovi rami dendritici che spuntano dal gambo reciso per affiancare lo spazio vuoto. Vale la pena notare che i nuovi rami terminali vengono continuamente aggiunti ai dendriti illesi in questa fase di sviluppo. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Rigenerazione dell'assone neuronale da parte del VNC. (A) Disegno schematico di una larva di Drosophila montata su una diapositiva e immagine al microscopio. Gli assoni neuronali di classe IV da nel VNC sono stati visualizzati in una larva ppk-CD4tdGFP/+. Nell'immagine ingrandita e nel disegno schematico vengono visualizzati due segmenti di commissure candidati. Ognuno di loro ha due siti di lesioni (cerchi rossi). (B) Immagini confocali di un segmento ferito immagini a 8, 24 e 72 ore dopo l'infortunio (AI). Le linee rosse raffigurano gli assoni ricrescenti. (C) Misurazione e normalizzazione degli assoni ricrescenti. Barra di scala = 20 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Diethyl ether, ACS reagent, anhydrous	Acros Organics	AC615080010
Halocarbon 27 Oil	Genesee Scientific	59-133
Propionic Acid	J.T.Baker	U33007
Cover Glasses: Rectangles	Fisher Scientific	12-544-D	50 mm X 22 mm
Zeiss LSM 880 laser scanning microscope	Zeiss
Zen software	Zeiss
Chameleon Ultra II	Coherent