Summary
Il significato delle piccole colonie nella resistenza ai farmaci di Candida spp. non è stato completamente esplorato. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) offre una strategia promettente contro le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Questo studio dimostra che l'aPDT mediata dal bengala rosa disattiva efficacemente la Candida glabrata e induce piccole colonie, presentando una procedura unica.
Abstract
Di fronte a un tasso di mortalità del 40% nei pazienti con candidemia, la Candida resistente ai farmaci e i loro piccoli mutanti rimangono una delle principali sfide terapeutiche. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prende di mira più strutture fungine, a differenza degli antibiotici/antimicotici, contrastando potenzialmente la resistenza. I metodi tradizionali per indurre piccole colonie si basano sul bromuro di etidio o sul fluconazolo, che possono influenzare la suscettibilità ai farmaci e le risposte allo stress. Questo studio ha studiato l'applicazione della luce verde (picco 520 nm) e del fotosensibilizzatore del bengala rosa (RB) per combattere un isolato di Candida glabrata resistente ai farmaci. I risultati hanno rivelato che il trattamento con aPDT ha inibito significativamente la crescita cellulare (riduzione del ≥99,9%) e ha indotto efficacemente la formazione di colonie piccole, come evidenziato dalle dimensioni ridotte e dalla perdita della colorazione dell'indicatore redox mitocondriale. Questo studio fornisce la prova iniziale che l'aPDT può indurre colonie piccole in un ceppo di C. glabrata multiresistente in vitro, offrendo un approccio potenzialmente trasformativo per combattere le infezioni fungine resistenti.
Introduction
Le infezioni fungine, in particolare quelle causate dalla Candida albicans e dalla Candida glabrata, sempre più resistente ai farmaci, rappresentano una seria minaccia globale1. Queste infezioni possono essere mortali, specialmente per i pazienti ospedalizzati e quelli con un sistema immunitario indebolito. L'aumento della resistenza antifungina minaccia il controllo della candidosi invasiva, una grave infezione fungina con elevata mortalità, in particolare da Candida albicans2. I ceppi resistenti ostacolano un trattamento efficace, aumentando potenzialmente sia la complessità che i tassi di mortalità. Nella contea di Alameda, California, USA, C. glabrata è diventata la specie invasiva più diffusa3. Questo cambiamento nella prevalenza e nella distribuzione delle specie di Candida può essere influenzato dalle pratiche sanitarie locali, dai dati demografici dei pazienti, dall'utilizzo di agenti antifungini e dalla prevalenza dei fattori di rischio per le infezioni da Candida.
Piccoli mutanti nella Candida, privi di mitocondri funzionali, rivelano come questo organello influenzi la risposta ai farmaci, la virulenza e la resistenza allo stress 4,5. C. glabrata forma facilmente queste colonie, acquisendo sensibilità ai polieni mentre la perde a favore degli azoli6. La sensibilità azolica e la funzione respiratoria sono strettamente collegate, con una diminuzione della respirazione che porta alla resistenza attraverso la perdita di DNA mitocondriale7. Piccole colonie di C. glabrata con resistenza all'azolo sono state isolate da campioni di feci umane da un ricevente di trapianto di midollo osseo sottoposto a trattamento con fluconazolo8 e da flaconi di emocoltura di pazienti con infezioni del flusso sanguigno9. Le loro potenziali implicazioni nella resistenza ai farmaci, nella virulenza e nella risposta allo stress evidenziano il loro significato clinico. Inoltre, le loro proprietà distinte li rendono strumenti preziosi per indagare su questioni fondamentali nella biologia mitocondriale5. Man mano che la ricerca sui mutanti petite continua, è probabile che le loro applicazioni nella ricerca clinica e di base si espandano.
Questo studio ha scoperto che la terapia fotodinamica (PDT) può indurre piccole colonie in C. glabrata, ampliando la gamma di metodi oltre le tecniche tradizionali di esposizione di C. glabrata al bromuro di etidio o al fluconazolo.
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Protocol
1. Coltura di C. glabrata
NOTA: Per gli esperimenti viene utilizzato un C. glabrata multiresistente (C2-1000907) resistente alla maggior parte degli agenti antifungini, incluso il fluconazolo. Potrebbe essere necessario adattare le condizioni sperimentali al ceppo specifico, poiché possono esistere variazioni tra ceppi diversi. Tutti gli esperimenti hanno utilizzato Candida in fase logaritmica coltivata a 25 °C (che imita l'infezione naturale) per coerenza. La mancanza di ife di C. glabrata semplifica la quantificazione rispetto a C. albicans, che forma ife a 37 °C10.
- Per preparare una coltura in fase loglogaritmica di C. glabrata, prelevare una singola colonia da una piastra di agar e trasferirla in una provetta di vetro con 3 ml di terreno sterile di peptone destrosio di lievito (YPD) (vedere Tabella dei materiali). Incubare per 14-16 ore a 25 °C agitando (155 giri/min, angolo di 45° per aumentare la trasmissione dell'aria al fluido).
- Dopo l'incubazione, diluire la coltura con YPD fresco a un OD600 di 0,1 utilizzando una tecnica sterile. Incubare a 25 °C per 6 h agitando a 155 giri/min. Verificare la fase logaritmica di C. glabrata misurando l'OD600. Puntare a 0,65-1,00, che corrisponde a 1 × 10 7-1,5 × 107 cellule/mL.
2. Induzione di piccole colonie mediante bromuro di etidio, fluconazolo e terapia fotodinamica
- Induzione di piccole colonie di bromuro di etidio
- Regolare una sospensione di lievito a una OD600 di 0,1 (5 × 106 cellule/mL) con YPD a un volume finale di 3 mL, quindi aggiungere 30 μL di bromuro di etidio (10 mg/mL) (vedere la Tabella dei materiali) per una concentrazione finale di 100 μg/mL.
- Incubare la sospensione di lievito per una notte (16-18 h) a 25 °C, 155 giri/min, angolo di 45°. Regolare su un OD600 di 0,65 (1 × 107 cellule/mL). Eseguire una serie di diluizioni di 10 volte in una piastra a 96 pozzetti aggiungendo 20 μl della sospensione di lievito aggiustata a 180 μl di PBS per pozzetto. Questo crea sei diluizioni che vanno da 10-1 a 10-5.
- Selezionare 4 fattori di diluizione (ad es. 100, 101, 102 e 103) e piastra 3 gocce (20 μL) ciascuna su 4 quadranti di piastre di agar YPD (triplicate).
- Incubare le piastre per una notte a 37 °C. Selezionare i quadranti con 5-80 colonie dalle diluizioni precedentemente scelte per la colorazione con tricheniltetrazolio cloruro (TTC)11 (vedere fase 3). Scansiona le lastre a 1200 dpi utilizzando uno scanner ottico a colori a 48 bit.
- Induzione di piccole colonie di fluconazolo
NOTA: Per accelerare il processo, utilizzare cellule T3 (una miscela di cellule normali e piccole ottenute dopo 3 trattamenti RB-PDT; vedere fase 2.3) per la formazione di piccole colonie indotta dal fluconazolo. Questo perché il trattamento standard in genere provoca una formazione più lenta.- Preparare e regolare una sospensione di cellule di lievito come descritto al punto 2.1.1.
- Incubare per una notte (16-18 h) a 25 °C. Regolare nuovamente l'OD600 a 0.1.
- Trasferire 1 mL della sospensione regolata in una provetta sterile da 5 mL.
- Immergere un batuffolo di cotone sterile (lungo 15 cm, con una punta di 0,9 cm x 2,6 cm, vedere Tabella dei materiali) nella sospensione di lievito, assicurandosi del contatto con il fondo della provetta e ruotandolo per rimuovere il liquido in eccesso dalla parete della provetta.
- Preparare le piastre nella cappa utilizzando l'agar Mueller-Hinton (vedi Tabella dei materiali).
- Tampona il cotone avanti e indietro sull'agar, ruota di 60° due volte, quindi tampona il perimetro per una copertura uniforme.
- Sterilizzare le pinze sulla fiamma per 1-2 s, lasciandole raffreddare brevemente, quindi usarle per raccogliere i dischi vuoti.
- Dividi il piatto in tre settori uguali usando un pennarello. Posizionare un disco vuoto al centro di ogni settore.
- Aggiungere 12,5 μL di brodo di fluconazolo (2 mg/mL, vedere la Tabella dei materiali) a ciascun disco (25 μg/disco), mescolare accuratamente per evitare bolle e incubare a 37 °C per 20-24 ore.
- Eseguire la colorazione TTC (vedere il passaggio 3). Scansiona le lastre a 1200 dpi utilizzando uno scanner ottico a colori a 48 bit.
- Induzione di colonie di PDT
NOTA: Funghi diversi possono produrre un numero diverso di piccole colonie dopo la PDT. Alcuni ceppi potrebbero non produrne affatto.- Preparare il sistema aPDT.
NOTA: La procedura di configurazione per il dispositivo del sistema aPDT segue il metodo riportato da Hung et al12. In breve, il sistema aPDT è costituito da un array di LED verdi con un picco a 520 nm (vedi Tabella dei materiali), che illumina la luce dal basso con un buon allineamento con ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. - Regolare la sospensione di cellule di lievito nel terreno YPD a un OD600 di 0,65 (circa 1 × 107 cellule/mL).
- Miscelare 1 mL della sospensione di lievito con 111 μL di rosa bengala al 2% (RB, Figura 1) (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta con tappo rotondo per ottenere una concentrazione finale di RB dello 0,2%. Incubare la miscela a 25 °C per 15 minuti, ruotandola con un angolo di 45° a 155 giri/min.
- Trasferire la miscela in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare a 16.100 x g per 2,5 minuti (a temperatura ambiente).
- Scartare il surnatante e raschiare delicatamente il tubo cinque volte sul fondo della cappa per risospendere il pellet.
- Lavare la sospensione con 1x PBS quattro volte per rimuovere tutto l'RB. Ogni lavaggio è seguito da una risospensione del pellet con un breve vortice o pipettaggio per una risospensione completa.
- Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1000 μL di PBS. La soluzione è di colore rosa chiaro. Trasferire 200 μl della sospensione di lievito caricata con RB lavata in ciascuno dei tre pozzetti in una piastra a 96 pozzetti (triplicata).
- Posizionare la piastra a 96 pozzetti sul sistema di illuminazione fotodinamica con lampadine a LED che emettono luce verde dal basso. Spegnere le luci della stanza per garantire un'illuminazione uniforme ed evitare interferenze. Attivare il sistema di illuminazione a LED per erogare la dose di PDT di 4,38 J/cm2 in 2 minuti; Assicurarsi che il sistema sia correttamente allineato con i pozzetti.
- Dopo l'irradiazione, diluire la sospensione di lievito in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 20 μL di sospensione di lievito in un pozzetto contenente 180 μL di PBS, creando una diluizione di 10 volte. Ripetere per le diluizioni rimanenti per ottenere un intervallo da 10-1 a 10-5.
- Scegli quattro fattori di diluizione (ad esempio, da 10-2 a 10-5) in base all'aggiustamento della concentrazione delle cellule di lievito.
- Per ogni fattore di diluizione, piastra 3 gocce (20 μL ciascuna) per quadrante su piastre di agar YPD.
- Dopo che la sospensione di lievito è stata completamente assorbita, circa 10 minuti dalle piastre di agar, capovolgere e incubare per una notte a 37 °C.
- Definire T0 come il parente di controllo C. glabrata senza trattamento PDT. Preparare i funghi T0 nella fase di crescita del tronco come descritto sopra ed esporli a 4,38 J/cm2 di luce verde in presenza dello 0,2% di RB. Questa condizione di PDT inibisce costantemente da 3 a 3,5 log di crescita fungina.
- Denotare i funghi sopravvissuti come T1 ed esporli nuovamente alla stessa dose di PDT dopo che sono stati espansi in vitro in una fase di crescita logaritmica. I funghi sopravvissuti dopo la seconda PDT sono indicati come T2 e così via.
- Il giorno successivo, scegli quadranti con un numero di colonie compreso tra 5 e 80. Contare il numero di colonie in ciascun quadrante e calcolare il titolo con la seguente formula: Unità formante colonia (CFU)/mL = Numero di colonie (media del triplicato) × Fattore di diluizione × 50.
- Eseguire la colorazione TTC (vedere il passaggio 3). Scansiona la lastra come descritto in precedenza (passaggio 2.2).
- Preparare il sistema aPDT.
3. Analisi della funzione mitocondriale (test di colorazione TCC)
NOTA: TTC è un indicatore redox e un accettore di elettroni. Diventa rosso quando i composti bianchi vengono rotti dagli elettroni11. Si noti che non tutte le cellule formano necessariamente colonie visibili entro 24 ore dalla coltura su una piastra di agar. Le colonie con mitocondri funzionali diventano rosse, mentre quelle con mitocondri non funzionali rimangono bianche. Ciò consente la differenziazione tra colonie con diversa funzionalità mitocondriale.
- Dopo il trattamento, diluire le sospensioni di Candida su piastre di agar YPD in base alla densità cellulare desiderata per ottenere colonie distinte per una facile visualizzazione e colorazione.
- Dopo 24 ore di crescita a 37 °C, le colonie visibili si formano da una singola cellula. Pipettare 20 μl di TTC al 20% direttamente al centro di ciascuna colonia.
- Dopo il completo assorbimento, circa 10 minuti di TTC da parte delle colonie, incubare a 37 °C per 30-40 minuti.
4. Cinetica di crescita di C. glabrata normale e piccola
NOTA: Sono stati confrontati tre ceppi di lievito: C. glabrata C2-1000907 T0 (isolato clinico senza trattamento con PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 dopo 3 colonie consecutive che presentano RB-PDT con un diametro medio di 1,5 ± 0,8 mm simile alle cellule parentali) e T3p (piccole colonie di C. glabrata C2-1000907 dopo 3 RB-PDT consecutive).
- Regolare la sospensione di cellule di lievito in terreno YPD a un OD600 di 0,1 (5 × 106 cellule/mL) in una provetta da 3 mL.
- Misurare automaticamente l'OD600 della coltura statica ogni 20 minuti utilizzando il lettore di micropiastre multimodale (vedi Tabella dei materiali) per 24 ore.
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Representative Results
I dati sono presentati come media con ± errore standard e sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti, con almeno triplicati in ciascun gruppo. I dati sperimentali, inclusi i conteggi delle colonie, le misurazioni OD600 e i risultati della colorazione TTC, sono stati rappresentati graficamente e analizzati statisticamente utilizzando grafici e software statistici (vedi Tabella dei materiali). Per analizzare i dati è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale o il t-test e un valore p <0,05 è stato considerato significativo. La scansione è stata eseguita con uno scanner ottico a colori a 48 bit con una risoluzione di 1200 dpi e le successive misurazioni dei diametri delle colonie sono state condotte utilizzando il software ImageJ.
Come illustrato nelle curve di crescita nella Figura 2, i piccoli mutanti di C. glabrata C2-1000907 (T3p) hanno mostrato una crescita più lenta rispetto ai funghi parentali non trattati di dimensioni regolari (T0). Quando C. glabrata è stato miscelato con 0,2% di RB per 15 minuti ed esposto a 4,38 J/cm2 di luce verde (trattamento PDT), il titolo dei funghi è diminuito da 107,5 CFU/mL a 104,5 CFU/mL (almeno 3 log, Figura 3) rispetto al gruppo di controllo (solo RB), che aveva una densità cellulare di circa 10,7 CFU/mL. Inoltre, dopo aPDT, sono state osservate colonie piccole. Queste piccole colonie avevano una dimensione media di 0,4 mm ± 0,25 mm invece della solita dimensione di 1,5 mm ± 0,8 mm (Figura 4A). Le colonie di piccole dimensioni con disfunzione mitocondriale possono essere identificate dalle dimensioni e dal colore dopo la colorazione con TTC al 20%. Le piccole colonie che hanno mantenuto un colore bianco (Figura 3B, frecce bianche) hanno mostrato una disfunzione mitocondriale, mentre alcune colonie più piccole di colore rosso e colonie di dimensioni normali hanno mantenuto la normale funzione mitocondriale (Figura 4B). Il tradizionale agente intercalante del DNA, il bromuro di etidio (Figura 4C) e il fluconazolo (Figura 4D) possono indurre efficacemente piccoli mutanti di Candida. La diffusione del disco è un metodo semplice per definire la suscettibilità ai farmaci nei funghi. Nella Figura 4D, una chiara zona circolare di non crescita circondava il disco fluconazolo contenente 25 μg di fluconazolo nella coltura T0 (senza PDT), indicando una minore resistenza ai farmaci in questo fungo parentale. Tuttavia, il C. glabrata C2-1000907 è ancora definito come un ceppo resistente dalla minima concentrazione di inibizione verso il fluconazolo (dati non mostrati) e dal diametro della zona chiara. Nella coltura T3, molte piccole colonie si sono formate vicino al disco (freccia, pannello inferiore), suggerendo resistenza ai farmaci dopo tre ripetuti trattamenti con PDT.
Figura 1: Struttura molecolare della rosa del Bengala (RB). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curve di crescita di C. glabrata C2-1000907 24 ore dopo RB-PDT ripetitiva. Le curve di crescita sono state confrontate per tre ceppi: C. glabrata C2-1000907 T0 (cellule parentali naive), T3n (colonie di dimensioni normali dopo 3 trattamenti ripetuti) e T3p (colonie piccole dopo 3 trattamenti ripetuti). Rispetto a T0 e T3n, le colonie di T3p hanno mostrato un tasso di crescita significativamente più lento (n = 3, p < 0,05). Tutte le cellule sono coltivate in terreno YPD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Inibizione della crescita di C. glabrata C2-1000907 dopo aPDT. Un singolo trattamento con aPDT con una dose leggera di 4,38 J/cm² e 0,2% di RB ha inibito significativamente la crescita di C. glabrata C2-1000907 di 3 log rispetto al controllo naïve (p < 0,0001, t-test non appaiato). Le barre di errore rappresentano la media ± SEM, i dati sono raggruppati da 3 esperimenti indipendenti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Analisi della disfunzione mitocondriale mediante colorazione con tricheniltetrazolio cloruro (TCC). (A) C. glabrata C2-1000907, 24 ore dopo il trattamento con aPDT (0,2% RB, 4,38 J/cm² luce verde), ha mostrato una distribuzione dimensionale delle colonie bimodali, con colonie grandi (1,5 mm ± 0,8 mm) e piccole (0,4 mm ± 0,25 mm). (B) La colorazione TCC ha rivelato che le grandi colonie erano funzionali, poiché diventavano rosse, mentre le piccole colonie non erano funzionali, poiché rimanevano bianche. (C) Le colonie piccole sono state indotte anche dal bromuro di etidio (100 μg/mL per 30-40 minuti) e (D) dal trattamento con fluconazolo (25 μg/mL). Una chiara zona circolare di non crescita circondava il disco di fluconazolo contenente 25 μg di fluconazolo nella coltura T0 (senza PDT), indicando suscettibilità. Nella coltura T3, molte piccole colonie si sono formate vicino al disco (freccia, pannello inferiore), suggerendo resistenza ai farmaci dopo tre ripetuti trattamenti con PDT. Barre della scala: 1 mm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio rivela la PDT come il primo metodo riportato per indurre la formazione di piccole colonie nella Candida, superando gli effetti stabiliti del bromuro di etidio e del fluconazolo. Questa nuova osservazione richiede ulteriori esplorazioni per svelare le sue implicazioni sia per l'eradicazione fungina diminuendo la virulenza che per l'emergere di meccanismi di resistenza.
La PDT mediata da RB inibisce efficacemente la crescita di C. glabrata, suggerendo un potenziale approccio terapeutico alternativo per le infezioni da Candida. Come fotosensibilizzatore attivato dalla luce, RB produce ossigeno singoletto e specie reattive dell'ossigeno (ROS) se esposto a una lunghezza d'onda specifica. Questo stress ossidativo provoca danni ai componenti cellulari essenziali come lipidi, proteine e acidi nucleici13, portando alla disfunzione mitocondriale, come mostrato nel presente studio. Ciò rende difficile per la Candida sviluppare resistenza attraverso i meccanismi convenzionali osservati con i farmaci antifungini standard.
I tre ceppi di lievito utilizzati in questo studio, T0, T3n e T3p, mostrano modelli di crescita distinti. T0 rimane non trattato, mentre T3n e T3p subiscono RB-PDT tre volte. T3n mostra colonie di dimensioni normali, mentre T3p mostra colonie piccole. La crescita più lenta delle piccole colonie può indicare alterazioni nell'energia cellulare e nel metabolismo. Il fenotipo petite, spesso associato a disfunzione mitocondriale4, potrebbe portare a una ridotta respirazione aerobica, influenzando di conseguenza la cinetica di crescita complessiva. La ridotta respirazione aerobica nelle piccole colonie potrebbe influenzare la loro virulenza, suscettibilità ai farmaci o capacità di persistere in ambienti diversi. Questa connessione ha potenziali implicazioni cliniche e fornisce strade per future direzioni di ricerca.
Il bromuro di etidio, un agente intercalante del DNA, inibisce la sintesi del DNA mitocondriale e degrada il DNA mitocondriale esistente, trasformando la Candida in piccole colonie con disfunzione mitocondriale14. Il fluconazolo, comunemente usato per trattare le infezioni da Candida, può indurre resistenza ai farmaci e sviluppo di colonie minuscole in C. glabrata6. I mutanti petite possono mostrare resistenza ai farmaci azolici attraverso l'attivazione del fattore di trascrizione PDR1 e la sua regolazione dei geni CDR1 e CDR215. Inoltre, a causa della perdita parziale o completa del DNA mitocondriale, la funzione mitocondriale è compromessa16.
La PDT ha dimostrato efficacia nel ridurre la virulenza batterica17, indurre la suscettibilità agli antibiotici18 e ridurre la formazione di biofilm19 nei batteri. Gli studi sulla PDT contro le infezioni fungine sono limitati20. Questa scoperta solleva domande intriganti su come RB-PDT influenzi i mitocondri in C. glabrata. Per comprendere appieno come la RB-PDT influisce sulle cellule di lievito, è fondamentale comprendere i meccanismi molecolari che causano le variazioni di crescita. Tuttavia, i piccoli mutanti indotti dalla PDT sono attualmente poco studiati e le loro basi meccanicistiche dettagliate rimangono poco chiare. Sono necessarie ulteriori indagini per determinare se ci sono differenze tra piccole colonie create con vari metodi. Capire come si formano i piccoli nelle specie di Candida è importante per studiare la relazione tra funzione mitocondriale e patogenicità. Inoltre, i piccoli mutanti possono servire come modello per esplorare i meccanismi di resistenza ai farmaci antifungini.
Il presente studio, pur fornendo preziose informazioni sugli effetti della PDT mediata da RB su C. glabrata e sull'emergere di piccole colonie, presenta alcune limitazioni che dovrebbero essere considerate. In primo luogo, lo studio si è concentrato principalmente su esperimenti in vitro e la traduzione di questi risultati in contesti clinici merita ulteriori indagini. Inoltre, i meccanismi molecolari specifici alla base della formazione di piccole colonie dopo RB-PDT e le loro potenziali implicazioni per la resistenza ai farmaci antifungini richiedono un'esplorazione più approfondita. Inoltre, mentre lo studio ha confrontato i modelli di crescita di diversi ceppi di lievito, ulteriori analisi molecolari e genetiche potrebbero fornire una comprensione più profonda dei cambiamenti metabolici e genetici associati alla formazione di piccole colonie.
Inoltre, la potenziale variabilità nella risposta a RB-PDT tra diversi isolati clinici di C. glabrata non è stata affrontata in questo studio, evidenziando la necessità di indagini più ampie specifiche per ceppo. Gli studi futuri che affrontano queste limitazioni saranno cruciali per una comprensione più completa delle implicazioni della PDT mediata da RB e dell'emergere di piccole colonie nel contesto delle strategie di trattamento antimicotico.
In sintesi, questa indagine rivela che aPDT induce piccoli mutanti di C. glabrata (C2-1000907) con funzione mitocondriale compromessa. Questo meccanismo unico potrebbe offrire un nuovo metodo per gli studi antifungini. Il preciso meccanismo d'azione alla base delle piccole colonie indotte da PDT rimane da chiarire ed esplorare le potenziali differenze rispetto ad altri metodi sarà fondamentale per ottimizzare le strategie terapeutiche.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Acknowledgments
Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm filter | Merck, Taipei, Taiwan | Millex, SLGVR33RS | |
| 1.5 mL microfuge tube | Neptune, San Diego, USA | #3745 | |
| 20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) | Sigma-Aldrich, MO, USA | T8877 | |
| 5 mL polypropylene round bottom tube | Corning, AZ, USA | 352059 | |
| 5 mL round-bottom tube with cell strainer cap | Corning, AZ, USA | Falcon, #352235 | |
| 96-well plate | Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan | #16196 | |
| Agar | BRS, Tainan, Taiwan | AG012 | |
| Blank disk | Advantec, Tokyo, Japan | 49005040 | |
| Centrifuge | Eppendorf, UK | 5415R | |
| Ethidium bromide solution | Sigma-Aldrich, MO, USA | E1510 | |
| Fluconazole, 2 mg/mL | Pfizer, NY, USA | BC18790248 | |
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 7.0 | |
| Green light emitting diode (LED) strip | Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan | 5050 | Excitation wave: 500~550 nm |
| Low Temperature. shake Incubators | Yihder, Taipei, Taiwan | LM-570D (R) | |
| Mouth care cotton swabs | Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan | 161357 | |
| Muller Hinton II agar | BD biosciences, California, USA | 211438 | |
| Multimode microplate reader | Molecular Devices | SpectraMax i3x | |
| OD600 spectrophotometer | Biochrom, London, UK | Ultrospec 10 | |
| Rose Bengal | Sigma-Aldrich, USA | 330000 | stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C |
| Sterilized glass tube | Sunmei, Tainan, Taiwan | AK45048-16100 | |
| Yeast Extract Peptone Dextrose Medium | HIMEDIA, India | M1363 |
References
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