Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

השראת מושבות קטנות בקנדידה מבריקה באמצעות טיפול פוטודינמי בתיווך בנגל

Published: March 29, 2024 doi: 10.3791/66549
Automatic Translation
*1,2, *3, 4,5, 1,2, 6, 2, 3, 1,6, 2,7,8
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4National Institute of Infectious Diseases and Vaccinology, National Health Research Institutes, 5Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 6Insititute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 8Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

המשמעות של מושבות קטנות בקנדידה spp. עמידות לתרופות לא נחקרה במלואה. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) מציע אסטרטגיה מבטיחה נגד זיהומים פטרייתיים עמידים לתרופות. מחקר זה מדגים כי aPDT בתיווך בנגל ורד מבטל ביעילות קנדידה גלברטה וגורם למושבות קטנות, ומציג הליך ייחודי.

Abstract

מול שיעור תמותה של 40% בחולי קנדידמיה, קנדידה עמידה לתרופות והמוטציות הקטנות שלהם נותרו אתגר טיפולי גדול. טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי (aPDT) מכוון למבנים פטרייתיים מרובים, בניגוד לאנטיביוטיקה/אנטי-פטרייתיות, מה שעלול לסכל עמידות. שיטות מסורתיות לגרימת מושבות קטנות מסתמכות על אתידיום ברומיד או פלוקונזול, שיכולים להשפיע על רגישות לתרופות ותגובות לחץ. מחקר זה בדק את היישום של אור ירוק (שיא 520 ננומטר) ופוטונסיטייזר ורד בנגלי (RB) כדי להילחם במבודד קנדידה גלברטה עמיד לתרופות. הממצאים הראו כי טיפול ב- aPDT עיכב באופן משמעותי את צמיחת התאים (הפחתה של ≥99.9%) וגרם ביעילות להיווצרות מושבות קטנות, כפי שמעידה הקטנת גודל ואובדן צביעת מחוון חיזור מיטוכונדריאלי. מחקר זה מספק ראיות ראשוניות לכך ש-aPDT יכול לגרום למושבות קטנות בזן C. glabrata עמיד לתרופות במבחנה, ומציע גישה בעלת פוטנציאל טרנספורמטיבי למאבק בזיהומים פטרייתיים עמידים.

Introduction

זיהומים פטרייתיים, במיוחד אלה הנגרמים על ידי קנדידה אלביקנס וקנדידה גלברטה עמידה יותר ויותר לתרופות, מהווים איום עולמי רציני1. זיהומים אלה יכולים להיות קטלניים, במיוחד עבור חולים מאושפזים ואלה עם מערכת חיסונית מוחלשת. עלייה בעמידות האנטי פטרייתית מאיימת על השליטה בקנדידה פולשנית, זיהום פטרייתי חמור עם תמותה גבוהה, במיוחד מקנדידה אלביקנס2. זנים עמידים מעכבים טיפול יעיל, מה שעלול להגדיל הן את המורכבות והן את שיעורי התמותה. במחוז אלאמדה, קליפורניה, ארה"ב, C. glabrata הפך למין הפולש הנפוץ ביותר3. שינוי זה בשכיחות ובתפוצה של מיני קנדידה עשוי להיות מושפע משיטות בריאות מקומיות, דמוגרפיה של מטופלים, שימוש בחומרים אנטי פטרייתיים ושכיחות גורמי סיכון לזיהומי קנדידה.

מוטנטים קטנים בקנדידה, חסרי מיטוכונדריה פונקציונלית, חושפים כיצד אברון זה משפיע על התגובה לתרופות, אלימות ועמידות ללחץ 4,5. C. glabrata יוצר בקלות מושבות אלה, רוכש רגישות לפוליאנים תוך שהוא מאבד אותו לאזולים6. רגישות לאזול ותפקוד נשימתי קשורים זה לזה באופן מורכב, עם נשימה מופחתת המובילה להתנגדות באמצעות אובדן DNA מיטוכונדריאלי7. מושבות קטנות של C. glabrata עם עמידות לאזול בודדו מדגימות צואה אנושיות ממושתל מח עצם שעבר טיפול פלוקונזול8 ומבקבוקי תרבית דם של חולים עם זיהומים בזרם הדם9. ההשלכות האפשריות שלהם על עמידות לתרופות, אלימות ותגובה ללחץ מדגישות את המשמעות הקלינית שלהם. בנוסף, התכונות הייחודיות שלהם הופכות אותם לכלים רבי ערך לחקר שאלות בסיסיות בביולוגיה מיטוכונדריאלית5. ככל שהמחקר על מוטנטים קטנים נמשך, היישומים שלהם במחקר קליני ובסיסי כאחד צפויים להתרחב.

מחקר זה גילה כי טיפול פוטודינמי (PDT) יכול לגרום למושבות קטנות ב - C. glabrata, להרחיב את מגוון השיטות מעבר לטכניקות המסורתיות של חשיפת C. glabrata לאתידיום ברומיד או fluconazole.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. טיפוח של C. glabrata

הערה: C. glabrata עמיד לתרופות מרובות (C2-1000907) העמיד לרוב הסוכנים האנטי פטרייתיים, כולל fluconazole, משמש לניסויים. ייתכן שיהיה צורך להתאים את תנאי הניסוי לזן הספציפי, שכן ייתכנו שינויים בין זנים שונים. כל הניסויים השתמשו בקנדידה לוג-פאזה שגדלה ב-25 מעלות צלזיוס (מחקה זיהום טבעי) לעקביות. חוסר הקורים של C. glabrata מפשט את הכימות בהשוואה ל - C. albicans, היוצר קורים ב- 37 ° C10.

  1. כדי להכין תרבית לוג-פאזה של C. glabrata, בחרו מושבה בודדת מצלחת אגר והעבירו אותה למבחנה מזכוכית עם 3 מ"ל של שמרים סטריליים פפטון דקסטרוז (YPD) בינוני (ראו טבלת חומרים). יש לדגור במשך 14-16 שעות ב-25°C עם רעידות (155 סל"ד, זווית של 45° כדי להגביר את העברת האוויר לתווך).
  2. לאחר הדגירה, יש לדלל את התרבית עם YPD טרי ל-OD600 של 0.1 בטכניקה סטרילית. יש לדגור ב-25°C למשך 6 שעות עם רעידות ב-155 סל"ד. אמת את שלב היומן של C. glabrata על ידי מדידת OD600. כוון 0.65-1.00, אשר מתאים 1 × 10 7-1.5 × 107 תאים / מ"ל.

2. אינדוקציה של מושבות קטנות על ידי אתידיום ברומיד, fluconazole וטיפול פוטודינמי

  1. השראת מושבה קטנה Ethidium bromide
    1. התאם תרחיף שמרים ל- OD600 של 0.1 (5 × 106 תאים/מ"ל) עם YPD לנפח סופי של 3 מ"ל, ולאחר מכן הוסף 30 מיקרוליטר של ציר אתידיום ברומיד (10 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים) לקבלת ריכוז סופי של 100 מיקרוגרם/מ"ל.
    2. יש לדגור על מתלי השמרים למשך הלילה (16-18 שעות) ב-25°C, 155 סל"ד, זווית של 45°. התאם ל- OD600 של 0.65 (1 × 10,7 תאים/מ"ל). בצע סדרת דילול פי 10 בצלחת של 96 בארות על ידי הוספת 20 μL של תרחיף השמרים המותאם ל- 180 μL של PBS לכל באר. זה יוצר שישה דילולים הנעים בין 10-1 ל 10-5.
    3. בחר 4 גורמי דילול (למשל, 100, 101, 102 ו- 103) וצלחת 3 טיפות (20 μL) כל אחד על 4 רבעים של לוחות אגר YPD (משולש).
    4. לדגור על צלחות לילה ב 37 °C (77 °F). בחר רבעים עם 5-80 מושבות מהדילולים שנבחרו בעבר עבור צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TTC)11 (ראה שלב 3). סרוק לוחות ברזולוציה של 1,200 dpi באמצעות סורק אופטי בצבע מלא של 48 סיביות.
  2. אינדוקציה של מושבה קטנה Fluconazole
    הערה: כדי לזרז את התהליך, השתמש בתאי T3 (תערובת של תאים נורמליים וקטנים המתקבלים לאחר 3 טיפולי RB-PDT; ראה שלב 2.3) להיווצרות מושבה קטנה הנגרמת על ידי פלוקונזול. הסיבה לכך היא שטיפול סטנדרטי בדרך כלל גורם להיווצרות איטית יותר.
    1. הכינו וכווננו תרחיף של תאי שמרים כמתואר בשלב 2.1.1.
    2. לדגור לילה (16-18 שעות) ב 25 °C (75 °F). התאם שוב את OD600 ל- 0.1.
    3. העבר 1 מ"ל של המתלה המותאם לצינור סטרילי של 5 מ"ל.
    4. טבלו צמר גפן סטרילי (באורך 15 ס"מ, עם קצה בגודל 0.9X2.6 ס"מ, ראו טבלת חומרים) בתרחיף השמרים, תוך הקפדה על מגע עם תחתית הצינור ופיתול לסילוק עודפי נוזלים מדופן הצינור.
    5. מכינים את הצלחות במכסה המנוע בעזרת אגר מולר-הינטון (ראו טבלת חומרים).
    6. ספוג את הכותנה קדימה ואחורה על האגר, סובב 60° פעמיים, ולאחר מכן ספוג את ההיקף לקבלת כיסוי אחיד.
    7. עקרו מלקחיים מעל להבה במשך 1-2 שניות, אפשרו להם להתקרר לזמן קצר, ואז השתמשו בהם כדי להרים את הדיסקים הריקים.
    8. חלק את הלוח לשלושה סקטורים שווים באמצעות סמן. מקם דיסק ריק אחד במרכז כל מגזר.
    9. הוסף 12.5 μL fluconazole ציר (2 מ"ג / מ"ל, ראה רשימת חומרים) לכל דיסק (25 מיקרוגרם / דיסק), לערבב היטב כדי למנוע בועות, ולדגור ב 37 ° C במשך 20-24 שעות.
    10. בצע את צביעת TTC (ראה שלב 3). סרוק לוחות ברזולוציה של 1,200 dpi באמצעות סורק אופטי בצבע מלא של 48 סיביות.
  3. PDT מושבה קטנה אינדוקציה
    הערה: פטריות שונות עשויות לייצר מספר שונה של מושבות קטנות לאחר PDT. זנים מסוימים עשויים שלא לייצר כלל.
    1. הכן את מערכת aPDT.
      הערה: הליך ההתקנה עבור התקן מערכת aPDT עוקב אחר השיטה שדווחה על-ידי Hung et al12. בקצרה, מערכת aPDT מורכבת ממערך LED ירוק עם שיא של 520 ננומטר (ראה טבלת חומרים), אור מאיר מלמטה עם יישור טוב עם כל באר של צלחת 96 בארות.
    2. כוונן את תרחיף תאי השמרים בתווך YPD ל- OD600 של 0.65 (כ- 1 × 107 תאים/מ"ל).
    3. ערבבו 1 מ"ל של תרחיף שמרים עם 111 מיקרוליטר של 2% ורד בנגלי (RB, איור 1) (ראו טבלת חומרים) בצינור עגול כדי לתת ריכוז RB סופי של 0.2%. דוגרים על התערובת ב-25°C למשך 15 דקות, ומסובבים אותה בזווית של 45° ב-155 סל"ד.
    4. מעבירים את התערובת לצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל וצנטריפוגה במהירות של 16,100 x גרם למשך 2.5 דקות (בטמפרטורת החדר).
    5. השליכו את הסופרנאטנט וגרדו בעדינות את הצינור חמש פעמים על רצפת מכסה המנוע כדי לתלות מחדש את הכדור.
    6. שטפו את המתלים עם 1x PBS ארבע פעמים כדי להסיר את כל ה-RB. כל שטיפה מלווה בהשעיה של הגלולה עם מערבולות קצרות או פיפטינג להשעיה יסודית.
      1. לאחר הכביסה הסופית, להוסיף 1000 μL של PBS. הפתרון הוא בצבע ורוד בהיר. מעבירים 200 μL של תרחיף שמרים שטוף RB לכל אחת משלוש בארות בצלחת 96 בארות (משולש).
    7. מקם את לוח 96 הקידוחים על מערכת התאורה הפוטודינמית עם נורות LED המאירות אור ירוק מלמטה. כבו את אורות החדר כדי להבטיח תאורה אחידה ולמנוע הפרעות. הפעל את מערכת תאורת ה- LED כדי לספק מינון PDT של 4.38 J/cm2 במשך 2 דקות; ודא שהמערכת מיושרת כראוי עם הבארות.
    8. לאחר הקרנה, לדלל את תרחיף השמרים בצלחת 96 באר. הוסף 20 μL של תרחיף שמרים לבאר המכילה 180 μL PBS, ויוצר דילול פי 10. חזור על הפעולה עבור שאר הדילולים כדי להשיג טווח של 10-1 עד 10-5.
    9. בחר ארבעה גורמי דילול (למשל, 10-2 עד 10-5) בהתבסס על התאמת ריכוז תאי השמרים.
    10. עבור כל גורם דילול, צלחת 3 טיפות (20 μL כל אחד) לכל רביע על לוחות אגר YPD.
    11. לאחר שתרחיף השמרים נספג לחלוטין, בסביבות 10 דקות על ידי צלחות אגר, להפוך ולדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
    12. הגדר T0 כקבוצת הביקורת ההורית C. glabrata ללא טיפול PDT. הכינו פטריות T0 בשלב צמיחת היומן כמתואר לעיל וחשפו אותן לאור ירוק של 4.38 J/cm2 בנוכחות 0.2% RB. מצב PDT זה מעכב באופן עקבי 3 עד 3.5 לוגים של צמיחה פטרייתית.
      1. ציינו את הפטריות ששרדו כ-T1 וחשפו אותן שוב לאותו מינון PDT לאחר שהן מורחבות במבחנה לשלב גדילת בולי עץ. הפטריות ששרדו לאחר ה-PDT השני מסומנות כ-T2 וכן הלאה.
    13. למחרת, בחר רבעים עם ספירת מושבות בין 5 ל -80. ספור את מספר המושבות בכל רביע וחשב את הטיטר באמצעות הנוסחה הבאה: יחידה יוצרת-מושבה (CFU)/מ"ל = מספר מושבות (ממוצע של משולש) × גורם דילול × 50.
    14. בצע את צביעת TTC (ראה שלב 3). סרוק את הצלחת כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2).

3. ניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי (בדיקת צביעת TCC)

הערה: TTC הוא מחוון חמצון-חיזור ומקבל אלקטרונים. הוא הופך לאדום כאשר תרכובות לבנות נשברות על ידי אלקטרונים11. שימו לב שלא כל התאים יוצרים בהכרח מושבות נראות לעין תוך 24 שעות לאחר התרבית על צלחת אגר. מושבות עם מיטוכונדריה פונקציונלית הופכות אדומות, ואילו מושבות עם מיטוכונדריה לא תפקודית נשארות לבנות. זה מאפשר הבחנה בין מושבות עם פונקציונליות מיטוכונדריאלית שונה.

  1. לאחר הטיפול, יש לדלל את מתלי הקנדידה על לוחות אגר YPD בהתאם לצפיפות התאים הרצויה כדי לקבל מושבות נפרדות להדמיה קלה ולהכתמה.
  2. לאחר 24 שעות של צמיחה ב 37 °C (77 °F), מושבות גלויות נוצרות מתא יחיד. פיפטה 20 μL של 20% TTC ישירות למרכז כל מושבה.
  3. לאחר ספיגה מלאה, בסביבות 10 דקות של TTC על ידי המושבות, לדגור ב 37 ° C במשך 30-40 דקות.

4. קינטיקה צמיחה של נורמלי וקטן C. glabrata

הערה: שלושה זנים של שמרים הושוו: C. glabrata C2-1000907 T0 (בידוד קליני ללא טיפול PDT), T3n (C. glabrata C2-1000907 לאחר 3 RB-PDT רצופים המציגים מושבות בקוטר ממוצע של 1.5 ± 0.8 מ"מ בדומה לתאי ההורים), ו- T3p (מושבות קטנות של C. glabrata C2-1000907 לאחר 3 RB-PDT רצופים).

  1. כוונן את תרחיף תאי השמרים בתווך YPD ל- OD600 של 0.1 (5 × 10,6 תאים/מ"ל) בצינור של 3 מ"ל.
  2. מדוד באופן אוטומטי את OD600 של התרבית הסטטית כל 20 דקות באמצעות קורא המיקרו-לוחות הרב-מצבי (ראה טבלת חומרים) במשך 24 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים מוצגים כממוצע עם שגיאת תקן ± והתקבלו משלושה ניסויים בלתי תלויים, עם לפחות טריפליקטים בכל קבוצה. נתונים ניסיוניים, כולל ספירת מושבות, מדידות OD600 ותוצאות צביעת TTC, עברו גרפים ונותחו סטטיסטית באמצעות גרפים ותוכנות סטטיסטיות (ראה טבלת חומרים). ANOVA חד-כיווני או מבחן t שימש לניתוח הנתונים, וערך p <0.05 נחשב משמעותי. הסריקה בוצעה באמצעות סורק אופטי בצבע מלא של 48 סיביות ברזולוציה של 1200 dpi, והמדידות הבאות של קוטר המושבה נערכו באמצעות תוכנת ImageJ.

כפי שמתואר בעקומות הגדילה באיור 2, מוטנטים קטנים של C. glabrata C2-1000907 (T3p) הציגו גדילה איטית יותר בהשוואה לפטריות הוריות לא מטופלות בגודל רגיל (T0). כאשר C. glabrata עורבב עם 0.2% RB במשך 15 דקות ונחשף לאור ירוק של 4.38 J/cm2 (טיפול PDT), הטיטר של הפטריות ירד מ-107.5 CFU/mL ל-104.5 CFU/mL (לפחות 3 לוגים, איור 3) בהשוואה לקבוצת הביקורת (RB בלבד), שהייתה בעלת צפיפות תאים של כ-107 CFU/mL. בנוסף, לאחר aPDTs, נצפו מושבות קטנות. הגודל הממוצע של מושבות קטנות אלה היה 0.4 מ"מ ± 0.25 מ"מ במקום הגודל הרגיל של 1.5 מ"מ ± 0.8 מ"מ (איור 4A). מושבות קטנות עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה ניתן לזהות על ידי גודלן וצבעם לאחר צביעה עם 20% TTC. המושבות הקטנות ששמרו על צבע לבן (איור 3B, חיצים לבנים) הפגינו תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, בעוד שחלק מהמושבות הקטנות יותר בצבע אדום ומושבות בגודל נורמלי שמרו על תפקוד מיטוכונדריאלי תקין (איור 4B). החומר המשולב המסורתי של הדנ"א אתידיום ברומיד (איור 4C) ופלוקונזול (איור 4D) יכול לגרום ביעילות למוטציות קטנות של קנדידה. דיפוזיה של דיסק היא שיטה פשוטה להגדרת רגישות לתרופות בפטריות. באיור 4D, אזור מעגלי ברור ללא גדילה הקיף את דיסקת הפלוקונזול שהכילה 25 מיקרוגרם פלוקונזול בתרבית T0 (ללא PDT), מה שמצביע על פחות עמידות לתרופות בפטריית ההורים הזו. עם זאת, C. glabrata C2-1000907 עדיין מוגדר כזן עמיד על ידי ריכוז עיכוב מינימלי לכיוון fluconazole (נתונים לא מוצגים) וקוטר האזור הברור. בתרבית T3, מושבות קטנות רבות נוצרו ליד הדיסק (חץ, פאנל תחתון), מה שמרמז על עמידות לתרופות לאחר שלושה טיפולי PDT חוזרים.

Figure 1
איור 1: המבנה המולקולרי של ורד בנגלי (RB). לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: עקומות גדילה של C. glabrata C2-1000907 24 שעות לאחר RB-PDT חוזר. עקומות גדילה הושוו עבור שלושה זנים: C. glabrata C2-1000907 T0 (תאי הורים נאיביים), T3n (מושבות בגודל תקין לאחר 3 טיפולים חוזרים) ו- T3p (מושבות קטנות לאחר 3 טיפולים חוזרים). בהשוואה ל- T0 ו- T3n, מושבות T3p הציגו קצב צמיחה איטי משמעותית (n = 3, p < 0.05). כל התאים גדלים בתווך YPD. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עיכוב גדילה של C. glabrata C2-1000907 בעקבות aPDT. טיפול aPDT יחיד עם מינון אור של 4.38 J/cm² ו-RB של 0.2% עיכב באופן משמעותי את צמיחת C. glabrata C2-1000907 ב-3 לוגים בהשוואה לקבוצת הביקורת הנאיבית (p < 0.0001, מבחן t לא מזווג). קווי שגיאה מייצגים ממוצע ± SEM, הנתונים נאספים משלושה ניסויים בלתי תלויים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: ניתוח תפקוד לקוי של המיטוכונדריה באמצעות צביעת טריפנילטטרזוליום כלוריד (TCC). (A) C. glabrata C2-1000907, 24 שעות לאחר טיפול ב-aPDT (0.2% RB, 4.38 J/cm² אור ירוק), הציג התפלגות גודל מושבה בימודאלית, עם מושבות גדולות (1.5 מ"מ ± 0.8 מ"מ) וקטנות (קטנות) (0.4 מ"מ ± 0.25 מ"מ). (B) צביעת TCC גילתה כי המושבות הגדולות היו פונקציונליות, שכן הן הפכו אדומות, בעוד שהמושבות הקטנות לא היו פונקציונליות, מכיוון שהן נותרו לבנות. (C) מושבות קטנות הושרו גם על ידי טיפול באתידיום ברומיד (100 מיקרוגרם/מ"ל למשך 30-40 דקות) ו-(D) פלוקונזול (25 מיקרוגרם/מ"ל). אזור מעגלי ברור ללא צמיחה הקיף את דיסקת הפלוקונאזול המכילה 25 מיקרוגרם פלוקונזול בתרבית T0 (ללא PDT), דבר המצביע על רגישות. בתרבית T3, מושבות קטנות רבות נוצרו ליד הדיסק (חץ, פאנל תחתון), מה שמרמז על עמידות לתרופות לאחר שלושה טיפולי PDT חוזרים. פסי קנה מידה: 1 מ"מ. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר זה חושף את PDT כשיטה המדווחת הראשונה לגרימת היווצרות מושבות קטנות בקנדידה, העולה על ההשפעות המבוססות של אתידיום ברומיד ופלוקונזול. תצפית חדשנית זו מחייבת חקירה נוספת כדי לפענח את השלכותיה הן על מיגור פטריות על ידי הפחתת האלימות והן על הופעתם של מנגנוני התנגדות.

PDT בתיווך RB מעכב ביעילות את הצמיחה של C. glabrata, ומציע גישה טיפולית חלופית פוטנציאלית לזיהומי קנדידה. כפוטוסנסיטיזר המופעל על ידי אור, RB מייצר חמצן סינגלט ומיני חמצן תגובתי (ROS) כאשר הוא נחשף לאורך גל מסוים. עקה חמצונית זו גורמת נזק לרכיבים תאיים חיוניים כגון שומנים, חלבונים וחומצות גרעין13, מה שמוביל לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה, כפי שמוצג במחקר הנוכחי. זה מקשה על קנדידה לפתח עמידות באמצעות מנגנונים קונבנציונליים שנצפו עם תרופות אנטי פטרייתיות סטנדרטיות.

שלושת זני השמרים ששימשו במחקר זה, T0, T3n ו-T3p, מציגים דפוסי גדילה שונים. T0 נותר ללא טיפול, בעוד T3n ו- T3p עוברים RB-PDT שלוש פעמים. T3n מציג מושבות בגודל רגיל, בעוד T3p מציג מושבות קטנות. הצמיחה האיטית יותר של המושבות הקטנות עשויה להצביע על שינויים באנרגיה התאית ובחילוף החומרים. הפנוטיפ הקטן, הקשור לעתים קרובות לתפקוד לקוי של המיטוכונדריה4, עלול להוביל לנשימה אירובית לקויה, וכתוצאה מכך להשפיע על קינטיקה של גדילה כללית. הנשימה האירובית הלקויה במושבות קטנות עלולה להשפיע על האלימות שלהם, על רגישותם לתרופות או על יכולתם להתמיד בסביבות שונות. קשר זה טומן בחובו השלכות קליניות פוטנציאליות ומספק אפיקים לכיווני מחקר עתידיים.

אתידיום ברומיד, חומר אינטרקלציה של DNA, מעכב סינתזת DNA מיטוכונדריאלי ומפרק את הדנ"א המיטוכונדריאלי הקיים, והופך את הקנדידה למושבות קטנות עם תפקוד לקוי של המיטוכונדריה14. Fluconazole, המשמש בדרך כלל לטיפול בזיהומי קנדידה, יכול לגרום לעמידות לתרופות ולהתפתחות מושבה קטנה ב - C. glabrata6. מוטנטים קטנים עשויים להפגין עמידות לתרופות אזול באמצעות הפעלת גורם השעתוק PDR1 והרגולציה שלו של גנים CDR1 ו- CDR215. יתר על כן, בשל אובדן חלקי או מלא של DNA מיטוכונדריאלי, תפקוד המיטוכונדריה נפגע16.

PDT הוכיח יעילות בהפחתת אלימות חיידקית17, גרימת רגישות לאנטיביוטיקה18 והפחתת היווצרות ביופילם19 בחיידקים. מחקרים על PDT נגד זיהומים פטרייתיים מוגבלים20. תגלית זו מעלה שאלות מסקרנות לגבי האופן שבו RB-PDT משפיע על המיטוכונדריה ב-C. glabrata. כדי להבין באופן מלא כיצד RB-PDT משפיע על תאי שמרים, הבנת המנגנונים המולקולריים הגורמים לשינויים בגדילה היא חיונית. עם זאת, מוטנטים קטנים המושרים על ידי PDT נחקרים כיום, והיסודות המכניסטיים המפורטים שלהם עדיין אינם ברורים. יש צורך בחקירה נוספת כדי לקבוע אם יש הבדלים בין מושבות קטנות שנוצרו בשיטות שונות. הבנת האופן שבו נוצרים פטיטים במיני קנדידה חשובה לחקר הקשר בין תפקוד מיטוכונדריאלי לפתוגנים. יתר על כן, מוטנטים קטנים יכולים לשמש מודל לחקר מנגנוני עמידות לתרופות אנטי פטרייתיות.

המחקר הנוכחי, תוך מתן תובנות חשובות לגבי ההשפעות של PDT בתיווך RB על C. glabrata והופעתן של מושבות קטנות, יש מגבלות מסוימות שיש לקחת בחשבון. ראשית, המחקר התמקד בעיקר בניסויים חוץ גופיים, ותרגומם של ממצאים אלה למסגרות קליניות מצדיק חקירה נוספת. בנוסף, המנגנונים המולקולריים הספציפיים העומדים בבסיס היווצרות מושבות קטנות בעקבות RB-PDT והשלכותיהם האפשריות על עמידות לתרופות אנטי-פטרייתיות דורשים מחקר מעמיק יותר. יתר על כן, בעוד המחקר השווה את דפוסי הצמיחה של זני שמרים שונים, ניתוחים מולקולריים וגנטיים נוספים יכולים לספק הבנה עמוקה יותר של השינויים המטבוליים והגנטיים הקשורים להיווצרות מושבות קטנות.

יתר על כן, השונות הפוטנציאלית בתגובה ל- RB-PDT בין מבודדים קליניים שונים של C. glabrata לא טופלה במחקר זה, מה שמדגיש את הצורך במחקרים ספציפיים לזנים רחבים יותר. מחקרים עתידיים שיתמודדו עם מגבלות אלה יהיו חיוניים להבנה מקיפה יותר של ההשלכות של PDT בתיווך RB והופעתן של מושבות קטנות בהקשר של אסטרטגיות טיפול אנטי פטרייתיות.

לסיכום, מחקר זה מגלה כי aPDT גורם ל- C. glabrata (C2-1000907) מוטציות קטנות עם תפקוד מיטוכונדריאלי לקוי. מנגנון ייחודי זה עשוי להציע שיטה חדשה למחקרים אנטי פטרייתיים. מנגנון הפעולה המדויק העומד בבסיס מושבות קטנות המושרות על ידי PDT עדיין לא הובהר, ובחינת הבדלים פוטנציאליים משיטות אחרות תהיה חיונית לאופטימיזציה של אסטרטגיות טיפוליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgments

עבודה זו קיבלה מימון ממשרד המדע והטכנולוגיה, טייוואן [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], האוניברסיטה הלאומית צ'נג קונג [K111-B094], [K111-B095], בית החולים האוניברסיטאי הלאומי צ'נג קונג, טייוואן [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Merck, Taipei, Taiwan Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich, MO, USA T8877
5 mL polypropylene round bottom tube Corning, AZ, USA 352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Corning, AZ, USA Falcon, #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Agar BRS, Tainan, Taiwan AG012
Blank disk Advantec, Tokyo, Japan 49005040
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich, MO, USA E1510
Fluconazole, 2 mg/mL Pfizer, NY, USA BC18790248
GraphPad Prism GraphPad Software Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan 5050 Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan 161357
Muller Hinton II agar BD biosciences, California, USA 211438
Multimode microplate reader Molecular Devices SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei, Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Soriano, A., et al. Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations. J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).
  2. Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).
  3. Meyahnwi, D., Siraw, B. B., Reingold, A. Epidemiologic features, clinical characteristics, and predictors of mortality in patients with candidemia in Alameda County, California; a 2017-2020 retrospective analysis. BMC Infect Dis. 22 (1), 843 (2022).
  4. Whittaker, P. A. The petite mutation in yeast. Subcell Biochem. 6, 175-232 (1979).
  5. Hatab, M. A., Whittaker, P. A. Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans. Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).
  6. Defontaine, A., et al. In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata. J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).
  7. Brun, S., et al. Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata. Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).
  8. Bouchara, J. P., et al. In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata. J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).
  9. Badrane, H., et al. Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures. Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).
  10. Shantal, C. -J. N., Juan, C. -C., Lizbeth, B. -U. S., Carlos, H. -G. J., Estela, G. -P. B. Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response. Microbiol Res. 260, 127038 (2022).
  11. Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar. Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).
  12. Hung, J. H., et al. Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans. J Vis Exp. (181), e63558 (2022).
  13. Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis. J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).
  14. Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. S. Factors affecting petite induction and the recovery of respiratory competence in yeast cells exposed to ethidium bromide. Mol Gen Genet. 144 (3), 253-262 (1976).
  15. Chen, X. J., Clark-Walker, G. D. The petite mutation in yeasts: 50 years on. Int Rev Cytol. 194, 197-238 (2000).
  16. Piskur, J. Inheritance of the yeast mitochondrial genome. Plasmid. 31 (3), 229-241 (1994).
  17. Wong, T. W., Wang, Y. Y., Sheu, H. M., Chuang, Y. C. Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus. Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).
  18. Wong, T. W., et al. Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance. J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).
  19. Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. Photodynamic therapy to control microbial biofilms. Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).
  20. Hung, J. H., et al. Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis. Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).

Tags

החודש ב-JoVE גיליון 205 טיפול פוטודינמי אנטי-מיקרוביאלי קנדידה פטיט רוז בנגל
השראת מושבות קטנות בקנדידה מבריקה באמצעות טיפול פוטודינמי בתיווך בנגל
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, C. Y., Hung, J. H., Wu, C. J., … More

Yang, C. Y., Hung, J. H., Wu, C. J., Wang, Z. X., Wang, S. H., Liaw, H. C., Lin, I. H., Yu, C. K., Wong, T. W. Induction of Petite Colonies in Candida glabrate via Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy. J. Vis. Exp. (205), e66549, doi:10.3791/66549 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter