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गुलाब बंगाल-मध्यस्थता फोटोडायनामिक थेरेपी के माध्यम से कैंडिडा ग्लैब्रेट में पेटिट कॉलोनियों का प्रेरण

Published: March 29, 2024 doi: 10.3791/66549
Automatic Translation
*1,2, *3, 4,5, 1,2, 6, 2, 3, 1,6, 2,7,8
1Department of Microbiology and Immunology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Dermatology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 3Department of Ophthalmology, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 4National Institute of Infectious Diseases and Vaccinology, National Health Research Institutes, 5Department of Internal Medicine, National Cheng Kung University Hospital, College of Medicine, National Cheng Kung University, 6Insititute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 7Department of Biochemistry and Molecular Biology, College of Medicine, National Cheng Kung University, 8Center of Applied Nanomedicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

कैंडिडा एसपीपी में खूबसूरत कॉलोनियों का महत्व दवा प्रतिरोध पूरी तरह से पता नहीं लगाया गया है। रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) दवा प्रतिरोधी फंगल संक्रमण के खिलाफ एक आशाजनक रणनीति प्रदान करती है। यह अध्ययन दर्शाता है कि गुलाब की मध्यस्थता वाला एपीडीटी प्रभावी रूप से कैंडिडा ग्लबराटा को निष्क्रिय करता है और एक अनूठी प्रक्रिया पेश करते हुए खूबसूरत कॉलोनियों को प्रेरित करता है।

Abstract

कैंडिडेमिया रोगियों में 40% मृत्यु दर का सामना करते हुए, दवा प्रतिरोधी कैंडिडा और उनके खूबसूरत म्यूटेंट एक प्रमुख उपचार चुनौती बने हुए हैं। रोगाणुरोधी फोटोडायनामिक थेरेपी (एपीडीटी) एंटीबायोटिक्स/एंटीफंगल के विपरीत कई कवक संरचनाओं को लक्षित करती है, संभावित रूप से प्रतिरोध को विफल करती है। खूबसूरत कॉलोनियों को प्रेरित करने के लिए पारंपरिक तरीके एथिडियम ब्रोमाइड या फ्लुकोनाज़ोल पर भरोसा करते हैं, जो दवा की संवेदनशीलता और तनाव प्रतिक्रियाओं को प्रभावित कर सकते हैं। इस अध्ययन ने दवा प्रतिरोधी कैंडिडा ग्लबराटा आइसोलेट का मुकाबला करने के लिए हरी बत्ती (पीक 520 एनएम) और गुलाब बंगाल (आरबी) फोटोसेंसिटाइज़र के आवेदन की जांच की। निष्कर्षों से पता चला है कि एपीडीटी उपचार ने सेल विकास (≥99.9% कमी) को काफी बाधित किया और प्रभावी रूप से पेटीट कॉलोनी गठन को प्रेरित किया, जैसा कि माइटोकॉन्ड्रियल रेडॉक्स संकेतक धुंधला के कम आकार और नुकसान से प्रमाणित है। यह अध्ययन प्रारंभिक साक्ष्य प्रदान करता है कि एपीडीटी इन विट्रो में एक मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी. ग्लब्रेटा स्ट्रेन में खूबसूरत कॉलोनियों को प्रेरित कर सकता है, जो प्रतिरोधी फंगल संक्रमणों से निपटने के लिए संभावित परिवर्तनकारी दृष्टिकोण पेश करता है।

Introduction

फंगल संक्रमण, विशेष रूप से कैंडिडा अल्बिकन्स और तेजी से दवा प्रतिरोधी कैंडिडा ग्लबराटा के कारण, एक गंभीर वैश्विक खतरा पैदा करते हैं1. ये संक्रमण घातक हो सकते हैं, खासकर अस्पताल में भर्ती मरीजों और कमजोर प्रतिरक्षा प्रणाली वाले लोगों के लिए। बढ़ते एंटिफंगल प्रतिरोध से आक्रामक कैंडिडिआसिस के नियंत्रण की धमकी मिलती है, उच्च मृत्यु दर के साथ एक गंभीर फंगल संक्रमण, विशेष रूप से कैंडिडा अल्बिकन्स2 से। प्रतिरोधी उपभेद प्रभावी उपचार में बाधा डालते हैं, संभावित रूप से जटिलता और मृत्यु दर दोनों को बढ़ाते हैं। अल्मेडा काउंटी, कैलिफोर्निया, संयुक्त राज्य अमेरिका में, सी। कैंडिडा प्रजातियों के प्रसार और वितरण में यह बदलाव स्थानीय स्वास्थ्य देखभाल प्रथाओं, रोगी जनसांख्यिकी, एंटिफंगल एजेंटों के उपयोग और कैंडिडा संक्रमण के लिए जोखिम कारकों की व्यापकता से प्रभावित हो सकता है।

कैंडिडा में छोटा म्यूटेंट, कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया की कमी, पता चलता है कि यह अंग दवा की प्रतिक्रिया, उग्रता और तनाव प्रतिरोध 4,5 को कैसे प्रभावित करता है। ग्लब्रेटा आसानी से इन कॉलोनियों का निर्माण करता है, पॉलीनेस के प्रति संवेदनशीलता प्राप्त करता है जबकि इसे एज़ोल्स6 से खो देता है। एज़ोल संवेदनशीलता और श्वसन समारोह जटिल रूप से जुड़े हुए हैं, कम श्वसन के साथ माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए हानि7 के माध्यम से प्रतिरोध के लिए अग्रणी। एज़ोल प्रतिरोध के साथ सी ग्लबराटा की खूबसूरत कॉलोनियों को मानव मल के नमूनों से अलग किया गया है, अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ता से फ्लुकोनाज़ोल उपचार8 से गुजर रहा है और रक्तप्रवाह संक्रमण वाले रोगियों की रक्त संस्कृति की बोतलों से9. दवा प्रतिरोध, उग्रता और तनाव प्रतिक्रिया में उनके संभावित प्रभाव उनके नैदानिक महत्व को उजागर करते हैं। इसके अतिरिक्त, उनके विशिष्ट गुण उन्हें माइटोकॉन्ड्रियल जीव विज्ञान 5 में मौलिक प्रश्नों की जांच के लिए मूल्यवान उपकरण बनातेहैं। जैसा कि पेटिट म्यूटेंट में शोध जारी है, नैदानिक और बुनियादी अनुसंधान दोनों में उनके अनुप्रयोगों का विस्तार होने की संभावना है।

इस अध्ययन में पाया गया कि फोटोडायनामिक थेरेपी (पीडीटी) सी ग्लबराटा में खूबसूरत कॉलोनियों को प्रेरित कर सकती है, जो उजागर करने की पारंपरिक तकनीकों से परे तरीकों की सीमा का विस्तार करती है सी. ग्लबराटा एथिडियम ब्रोमाइड या फ्लुकोनाज़ोल के लिए।

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Protocol

1. सी. ग्लबराटा की खेती

नोट: एक मल्टीड्रग-प्रतिरोधी सी. ग्लबराटा (C2-1000907) जो फ्लुकोनाज़ोल सहित अधिकांश एंटिफंगल एजेंटों के लिए प्रतिरोधी है, का उपयोग प्रयोगों के लिए किया जाता है। प्रयोगात्मक स्थितियों को विशिष्ट तनाव के अनुकूल बनाने की आवश्यकता हो सकती है, क्योंकि विभिन्न उपभेदों के बीच भिन्नताएं मौजूद हो सकती हैं। सभी प्रयोगों लॉग चरण Candida स्थिरता के लिए 25 डिग्री सेल्सियस (प्राकृतिक संक्रमण की नकल) पर उगाया इस्तेमाल किया. सी. ग्लबराटा की हाइपहे की कमी सी अल्बिकन्स की तुलना में परिमाणीकरण को सरल करती है, जो 37 डिग्री सेल्सियस10 पर हाइपहे बनाती है।

  1. सी ग्लबराटा की लॉग-फेज संस्कृति तैयार करने के लिए, अगर प्लेट से एक एकल कॉलोनी चुनें और इसे बाँझ खमीर पेप्टोन डेक्सट्रोज (वाईपीडी) माध्यम के 3 एमएल के साथ एक ग्लास टेस्ट ट्यूब में स्थानांतरित करें (सामग्री की तालिकादेखें)। झटकों के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर 14-16 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें (155 आरपीएम, मध्यम में वायु संचरण बढ़ाने के लिए 45 डिग्री कोण)।
  2. इनक्यूबेशन के बाद, बाँझ तकनीक का उपयोग करके 0.1 के ओडी600 के लिए ताजा वाईपीडी के साथ संस्कृति को पतला करें। 155 आरपीएम पर झटकों के साथ 6 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। के लॉग चरण को सत्यापित करें सी. ग्लबराटा आयुध डिपो600 को मापकर। 0.65-1.00 के लिए निशाना लगाओ, जो 1 × 10 7-1.5 × 107 कोशिकाओं /

2. एथिडियम ब्रोमाइड, फ्लुकोनाज़ोल और फोटोडायनामिक थेरेपी द्वारा खूबसूरत कॉलोनियों का प्रेरण

  1. एथिडियम ब्रोमाइड पेटिट कॉलोनी इंडक्शन
    1. वाईपीडी के साथ 3 एमएल की अंतिम मात्रा में 0.1 (5 × 106 कोशिकाओं / एमएल) के आयुध डिपो600 के लिए एक खमीर निलंबन समायोजित करें, फिर एथिडियम ब्रोमाइड स्टॉक (10 मिलीग्राम / एमएल) के 30 माइक्रोन जोड़ें (सामग्री की तालिका) 100 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम एकाग्रता के लिए।
    2. खमीर निलंबन को रात भर (16-18 घंटे) 25 डिग्री सेल्सियस, 155 आरपीएम, 45 डिग्री कोण पर इनक्यूबेट करें। 0.65 के आयुध डिपो600 (1 × 107 कोशिकाओं / अच्छी तरह से पीबीएस के 180 माइक्रोन के लिए समायोजित खमीर निलंबन के 20 माइक्रोन जोड़कर 96-अच्छी तरह से प्लेट में 10 गुना कमजोर पड़ने वाली श्रृंखला करें। यह 10-1 से 10-5 तक के छह कमजोर पड़ने का निर्माण करता है।
    3. 4 कमजोर पड़ने कारकों (जैसे, 100, 101, 102, और 103) और प्लेट 3 बूंदों (20 माइक्रोन) वाईपीडी अगर प्लेटों (तीन प्रतिकृत) के 4 चतुर्थांश पर प्रत्येक.
    4. 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर प्लेटें सेते हैं. ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीटीसी) धुंधला11 के लिए पहले से चुने गए कमजोर पड़ने से 5-80 कालोनियों के साथ चतुर्थांश का चयन करें (चरण 3 देखें)। 48-बिट पूर्ण-रंग ऑप्टिकल स्कैनर का उपयोग करके 1200 डीपीआई पर प्लेटों को स्कैन करें।
  2. फ्लुकोनाज़ोल पेटिट कॉलोनी इंडक्शन
    नोट: प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए, फ्लुकोनाज़ोल-प्रेरित पेटीट कॉलोनी गठन के लिए टी 3 कोशिकाओं (3 आरबी-पीडीटी उपचार के बाद प्राप्त सामान्य और खूबसूरत कोशिकाओं का मिश्रण; चरण 2.3 देखें) का उपयोग करें। ऐसा इसलिए है क्योंकि मानक उपचार आमतौर पर धीमी गति से गठन का परिणाम होता है।
    1. तैयार करें और एक खमीर सेल निलंबन को समायोजित करें जैसा कि चरण 2.1.1 में वर्णित है।
    2. 25 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (16-18 एच) सेते हैं। OD600 को फिर से 0.1 पर समायोजित करें।
    3. समायोजित निलंबन के 1 एमएल को एक बाँझ 5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित करें।
    4. खमीर निलंबन में एक बाँझ कपास झाड़ू (15 सेमी लंबा, 0.9 सेमी x 2.6 सेमी टिप के साथ, सामग्री की तालिकादेखें) डुबोएं, ट्यूब के नीचे से संपर्क सुनिश्चित करें और ट्यूब की दीवार से अतिरिक्त तरल निकालने के लिए घुमाएं।
    5. म्यूलर-हिंटन अगर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर हुड में प्लेटें तैयार करें.
    6. अगर पर कपास को आगे-पीछे घुमाएं, 60 डिग्री दो बार घुमाएं, फिर परिधि को भी कवरेज के लिए स्वाब करें।
    7. 1-2 एस के लिए एक लौ पर संदंश बाँझ, उन्हें संक्षेप में ठंडा करने के लिए अनुमति देता है, तो उन्हें खाली डिस्क लेने के लिए उपयोग करें.
    8. एक मार्कर का उपयोग करके प्लेट को तीन बराबर क्षेत्रों में विभाजित करें। प्रत्येक सेक्टर के केंद्र में एक रिक्त डिस्क रखें।
    9. प्रत्येक डिस्क (25 माइक्रोग्राम/डिस्क) में 12.5 माइक्रोन फ्लुकोनाज़ोल स्टॉक (2 मिलीग्राम/एमएल, सामग्री की तालिकादेखें) जोड़ें, बुलबुले से बचने के लिए अच्छी तरह मिलाएं, और 20-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
    10. टीटीसी धुंधला प्रदर्शन (चरण 3 देखें). 48-बिट पूर्ण-रंग ऑप्टिकल स्कैनर का उपयोग करके 1200 डीपीआई पर प्लेटों को स्कैन करें।
  3. पीडीटी खूबसूरत कॉलोनी प्रेरण
    नोट: विभिन्न कवक पीडीटी के बाद अलग-अलग संख्या में खूबसूरत कॉलोनियों का उत्पादन कर सकते हैं। कुछ उपभेद बिल्कुल भी उत्पादन नहीं कर सकते हैं।
    1. एपीडीटी प्रणाली तैयार करें।
      नोट: एपीडीटी सिस्टम डिवाइस के लिए सेटअप प्रक्रिया हंग एट अल12 द्वारा रिपोर्ट की गई विधि का अनुसरण करती है। संक्षेप में, एपीडीटी प्रणाली में 520 एनएम ( सामग्री की तालिकादेखें) पर एक चोटी के साथ एक हरे रंग की एलईडी सरणी होती है, जो 96-अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं के साथ अच्छे संरेखण के साथ नीचे से प्रकाश चमकती है।
    2. YPD माध्यम में खमीर सेल निलंबन को 0.65 के आयुध डिपो600 (लगभग 1 × 107 कोशिकाओं/एमएल) में समायोजित करें।
    3. 0.2% की अंतिम आरबी एकाग्रता देने के लिए एक गोल-छाया हुआ ट्यूब में 2% गुलाब बंगाल (आरबी, चित्रा 1) ( सामग्री की तालिकादेखें) के 111 माइक्रोन के साथ खमीर निलंबन के 1 एमएल मिलाएं। 15 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण को इनक्यूबेट करें, इसे 155 आरपीएम पर 45 डिग्री कोण पर घुमाएं।
    4. मिश्रण को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और अपकेंद्रित्र को 2.5 मिनट (कमरे के तापमान पर) के लिए 16,100 x ग्राम पर स्थानांतरित करें।
    5. सतह पर तैरनेवाला त्यागें और धीरे गोली फिर से निलंबित करने के लिए हुड फर्श पर ट्यूब पांच बार परिमार्जन.
    6. सभी आरबी को हटाने के लिए चार बार 1x पीबीएस के साथ निलंबन धो लें। प्रत्येक धोने के बाद पूरी तरह से निलंबन के लिए संक्षिप्त भंवर या पाइपिंग के साथ गोली का पुन: निलंबन किया जाता है।
      1. अंतिम धोने के बाद, पीबीएस के 1000 माइक्रोन जोड़ें। समाधान हल्के गुलाबी रंग का होता है। धोया आरबी लोड खमीर निलंबन के 200 माइक्रोन को 96-अच्छी तरह से प्लेट (ट्रिप्लिकेट) में तीन कुओं में से प्रत्येक में स्थानांतरित करें।
    7. नीचे से हरे रंग की रोशनी चमकते एलईडी बल्ब के साथ फोटोडायनामिक प्रकाश प्रणाली पर 96 अच्छी तरह से थाली स्थिति. एक समान रोशनी सुनिश्चित करने और हस्तक्षेप को रोकने के लिए कमरे की रोशनी बंद कर दें। 2 मिनट में 4.38 J/cm2 की PDT खुराक देने के लिए LED लाइट सिस्टम को सक्रिय करें; सुनिश्चित करें कि सिस्टम कुओं के साथ ठीक से संरेखित है।
    8. विकिरण के बाद, एक 96 अच्छी तरह से थाली में खमीर निलंबन पतला. खमीर निलंबन के 20 माइक्रोन को 180 माइक्रोन पीबीएस युक्त अच्छी तरह से जोड़ें, जिससे 10 गुना कमजोर पड़ने का निर्माण होता है। 10-1 से 10-5 की सीमा प्राप्त करने के लिए शेष कमजोर पड़ने के लिए दोहराएं।
    9. खमीर सेल एकाग्रता समायोजन के आधार पर चार कमजोर पड़ने वाले कारक (जैसे, 10-2 से 10-5) चुनें।
    10. प्रत्येक कमजोर पड़ने कारक के लिए, प्लेट 3 बूंदों (20 माइक्रोन प्रत्येक) YPD अगर प्लेटों पर चतुर्थांश प्रति बूँदें.
    11. खमीर निलंबन पूरी तरह से अवशोषित होने के बाद, अगर प्लेटों द्वारा लगभग 10 मिनट, पलटा और 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर सेते हैं।
    12. पीडीटी उपचार के बिना नियंत्रण माता-पिता सी ग्लबराटा के रूप में टी 0 को परिभाषित करें। ऊपर वर्णित लॉग विकास चरण में टी0 कवक तैयार करें और उन्हें 0.2% आरबी की उपस्थिति में 4.38 जे/सेमी2 हरी बत्ती में उजागर करें। यह पीडीटी स्थिति लगातार फंगल विकास के 3 से 3.5 लॉग को रोकती है।
      1. जीवित कवक को T1 के रूप में निरूपित करें और लॉग ग्रोथ चरण में इन विट्रो में विस्तारित होने के बाद उन्हें फिर से उसी पीडीटी खुराक में उजागर करें। दूसरे पीडीटी के बाद बचे हुए कवक को टी 2 और इसके बाद के रूप में दर्शाया जाता है।
    13. अगले दिन, 5 और 80 के बीच कॉलोनी की गिनती के साथ चतुर्थांश चुनें। प्रत्येक चतुर्थांश में कालोनियों की संख्या की गणना करें और निम्न सूत्र के साथ अनुमापांक की गणना: कॉलोनी बनाने इकाई (CFU)/mL = कालोनियों की संख्या (तीन प्रतियों का औसत) × कमजोर पड़ने कारक × 50.
    14. टीटीसी धुंधला प्रदर्शन (चरण 3 देखें). पहले वर्णित के रूप में थाली स्कैन (2.2 कदम).

3. माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन विश्लेषण (टीसीसी धुंधला परीक्षण)

नोट: टीटीसी एक रेडॉक्स संकेतक और एक इलेक्ट्रॉन स्वीकर्ता है। यह लाल हो जाता है जब सफेद यौगिकों को इलेक्ट्रॉनों11 द्वारा तोड़ दिया जाता है। ध्यान दें कि नहीं सभी कोशिकाओं जरूरी एक अगर प्लेट पर संस्कृति के बाद 24 घंटे के भीतर दिखाई कालोनियों फार्म. कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया वाली कालोनियां लाल हो जाती हैं, जबकि गैर-कार्यात्मक माइटोकॉन्ड्रिया वाले सफेद रहते हैं। यह विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल कार्यक्षमता वाले कालोनियों के बीच भेदभाव की अनुमति देता है।

  1. उपचार के बाद, आसान दृश्य और धुंधला के लिए अलग कालोनियों प्राप्त करने के लिए वांछित सेल घनत्व के अनुसार YPD अगर प्लेटों पर Candida निलंबन पतला.
  2. 37 डिग्री सेल्सियस पर विकास के 24 घंटे के बाद, दृश्य कालोनियों एक एकल सेल से गठन कर रहे हैं. प्रत्येक कॉलोनी के केंद्र पर सीधे 20% टीटीसी के पिपेट 20 माइक्रोन।
  3. पूर्ण अवशोषण के बाद, कालोनियों द्वारा टीटीसी के लगभग 10 मिनट, 30-40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।

4. सामान्य और खूबसूरत सी ग्लबराटा के विकास कैनेटीक्स

नोट: खमीर के तीन उपभेदों की तुलना की गई: C. glabrata C2-1000907 T0 (PDT उपचार के बिना नैदानिक अलग), T3n (C. glabrata C2-1000907 लगातार 3 RB-PDT के बाद पैतृक कोशिकाओं के समान 1.5 ± 0.8 मिमी के औसत व्यास के साथ कालोनियों का प्रदर्शन), और T3p (लगातार 2 RB-PDT के बाद C. glabrata C1000907-3 की खूबसूरत कॉलोनियां)।

  1. वाईपीडी माध्यम में खमीर सेल निलंबन को 3 एमएल ट्यूब में 0.1 (5 × 106 कोशिकाओं/एमएल) के आयुध डिपो600 में समायोजित करें।
  2. स्वचालित रूप से 24 घंटे के लिए मल्टी मोड माइक्रोप्लेट रीडर (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर हर 20 मिनट स्थिर संस्कृति के आयुध डिपो600 को मापें।

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Representative Results

डेटा को ± मानक त्रुटि के साथ माध्य के रूप में प्रस्तुत किया गया है और प्रत्येक समूह में कम से कम तीन प्रतियों के साथ तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त किया गया था। कॉलोनी मायने रखता है, आयुध डिपो600 माप, और टीटीसी धुंधला परिणाम सहित प्रायोगिक डेटा, रेखांकन और सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर ( सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग कर सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया. डेटा का विश्लेषण करने के लिए एक-तरफ़ा एनोवा या टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था, और पी-मान <0.05 को महत्वपूर्ण माना जाता था। स्कैनिंग 1200 डीपीआई के एक संकल्प पर एक 48 बिट पूर्ण रंग ऑप्टिकल स्कैनर के साथ प्रदर्शन किया गया था, और कॉलोनी व्यास के बाद माप ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग कर आयोजित किए गए थे.

जैसा कि चित्र 2 में विकास घटता में दर्शाया गया है, सी ग्लब्रेटा सी 2-1000907 (टी 3 पी) के खूबसूरत म्यूटेंट ने नियमित आकार (टी 0) के अनुपचारित पैतृक कवक की तुलना में धीमी वृद्धि का प्रदर्शन किया। जब सी. ग्लबराटा को 15 मिनट के लिए 0.2% आरबी के साथ मिलाया गया और 4.38 जे/सेमी2 हरी बत्ती (पीडीटी उपचार) के संपर्क में लाया गया, तो कवक का अनुमापांक 107.5 सीएफयू/एमएल से घटकर 104.5 सीएफयू/एमएल हो गया (कम से कम 3 लॉग, चित्रा 3) नियंत्रण समूह (केवल आरबी) की तुलना में, जिसमें लगभग 107 सीएफयू/एमएल का सेल घनत्व था। इसके अतिरिक्त, एपीडीटी के बाद, खूबसूरत कॉलोनियों को देखा गया। इन खूबसूरत कालोनियों का औसत आकार 1.5 मिमी ± 0.8 मिमी(चित्रा 4ए)के सामान्य आकार के बजाय 0.4 मिमी ± 0.25 मिमी था। माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन वाले छोटे आकार की कॉलोनियों को 20% टीटीसी के साथ धुंधला होने के बाद उनके आकार और रंग से पहचाना जा सकता है। एक सफेद रंग (चित्रा 3 बी, सफेद तीर) बनाए रखने वाली खूबसूरत कॉलोनियों ने माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन का प्रदर्शन किया, जबकि कुछ छोटे लाल रंग की कॉलोनियों और सामान्य आकार की कॉलोनियों ने सामान्य माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन (चित्रा 4बी) को बनाए रखा। पारंपरिक डीएनए इंटरकालेटिंग एजेंट एथिडियम ब्रोमाइड (चित्रा 4 सी) और फ्लुकोनाज़ोल (चित्रा 4 डी) प्रभावी रूप से कैंडिडा के खूबसूरत म्यूटेंट को प्रेरित कर सकते हैं। डिस्क प्रसार कवक में दवा संवेदनशीलता को परिभाषित करने के लिए एक सरल विधि है। चित्रा 4 डी में, कोई विकास के एक स्पष्ट परिपत्र क्षेत्र ने टी 0 संस्कृति (पीडीटी के बिना) में 25 माइक्रोग्राम फ्लुकोनाज़ोल युक्त फ्लुकोनाज़ोल डिस्क को घेर लिया, जो इस पैतृक कवक में कम दवा प्रतिरोध का संकेत देता है। फिर भी, C. glabrata C2-1000907 को अभी भी फ्लुकोनाज़ोल (डेटा नहीं दिखाया गया) और स्पष्ट क्षेत्र के व्यास की ओर न्यूनतम अवरोध एकाग्रता द्वारा एक प्रतिरोधी तनाव के रूप में परिभाषित किया गया है। टी 3 संस्कृति में, डिस्क (तीर, निचले पैनल) के पास कई खूबसूरत कॉलोनियों का गठन हुआ, जो तीन बार-बार पीडीटी उपचारों के बाद दवा प्रतिरोध का सुझाव देते हैं।

Figure 1
चित्रा 1: गुलाब बंगाल (आरबी) की आणविक संरचना। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: दोहराए जाने वाले आरबी-पीडीटी के बाद सी ग्लब्राटा सी 2-1000907 24 एच के विकास घटता है। विकास घटता तीन उपभेदों के लिए तुलना की गई: C. glabrata C2-1000907 T0 (भोली पैतृक कोशिकाओं), T3n (3 दोहराया उपचार के बाद सामान्य आकार के साथ कालोनियों), और T3p (3 दोहराया उपचार के बाद खूबसूरत कालोनियों). T0 और T3n की तुलना में, T3p कॉलोनियों ने काफी धीमी वृद्धि दर (n = 3, p < 0.05) प्रदर्शित की। सभी कोशिकाएं वाईपीडी माध्यम में उगाई जाती हैं। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: एपीडीटी के बाद सी ग्लब्रेटा सी 2-1000907 का विकास निषेध। 4.38 J/cm² हल्की खुराक और 0.2% RB के साथ एक एकल aPDT उपचार ने भोले नियंत्रण (p < 0.0001, अयुग्मित t-परीक्षण) की तुलना में C. glabrata C2-1000907 वृद्धि को 3 लॉग से काफी बाधित किया। त्रुटि पट्टियाँ SEM ± माध्य का प्रतिनिधित्व करती हैं, डेटा 3 स्वतंत्र प्रयोगों से पूल किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: ट्राइफेनिलटेट्राज़ोलियम क्लोराइड (टीसीसी) धुंधला का उपयोग करके माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन विश्लेषण। (ए) सी ग्लब्रेटा सी 2-1000907, एपीडीटी उपचार (0.2% आरबी, 4.38 जे / सेमी² हरी बत्ती) के बाद 24 घंटे, बड़े (1.5 मिमी ± 0.8 मिमी) और छोटे (खूबसूरत) कॉलोनियों (0.4 मिमी ± 0.25 मिमी) के साथ एक बिमोडल कॉलोनी आकार वितरण प्रदर्शित किया। (बी) टीसीसी धुंधला पता चला कि बड़ी कॉलोनियां कार्यात्मक थीं, क्योंकि वे लाल हो गईं, जबकि खूबसूरत कॉलोनियां गैर-कार्यात्मक थीं, क्योंकि वे सफेद बनी हुई थीं। (सी) पेटाइट कॉलोनियों को एथिडियम ब्रोमाइड (30-40 मिनट के लिए 100 माइक्रोग्राम / एमएल) और (डी) फ्लुकोनाज़ोल (25 माइक्रोग्राम / एमएल) उपचार द्वारा भी प्रेरित किया गया था। बिना किसी वृद्धि के एक स्पष्ट परिपत्र क्षेत्र ने फ्लुकोनाज़ोल डिस्क को घेर लिया जिसमें T0 संस्कृति (पीडीटी के बिना) में 25 μg फ्लुकोनाज़ोल होता है, जो संवेदनशीलता का संकेत देता है। टी 3 संस्कृति में, डिस्क (तीर, निचले पैनल) के पास कई खूबसूरत कॉलोनियों का गठन हुआ, जो तीन बार-बार पीडीटी उपचारों के बाद दवा प्रतिरोध का सुझाव देते हैं। स्केल बार: 1 मिमी। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

यह अध्ययन पीडीटी को कैंडिडा में खूबसूरत कॉलोनी गठन को प्रेरित करने के लिए पहली रिपोर्ट की गई विधि के रूप में प्रकट करता है, जो एथिडियम ब्रोमाइड और फ्लुकोनाज़ोल के स्थापित प्रभावों को पार करता है। इस उपन्यास अवलोकन को विषाणु को कम करके और प्रतिरोध तंत्र के उद्भव द्वारा फंगल उन्मूलन दोनों के लिए इसके निहितार्थों को जानने के लिए आगे की खोज की आवश्यकता है।

आरबी-मध्यस्थता पीडीटी प्रभावी रूप से सी ग्लब्राटा के विकास को रोकता है, कैंडिडा संक्रमण के लिए एक संभावित वैकल्पिक उपचार दृष्टिकोण का सुझाव देता है। प्रकाश-सक्रिय फोटोसेंसिटाइज़र के रूप में, आरबी एक विशिष्ट तरंग दैर्ध्य के संपर्क में आने पर सिंगलेट ऑक्सीजन और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) का उत्पादन करता है। इस ऑक्सीडेटिव तनाव लिपिड, प्रोटीन, और न्यूक्लिक एसिड13 के रूप में आवश्यक सेलुलर घटकों को नुकसान का कारण बनता है, माइटोकॉन्ड्रियल रोग के लिए अग्रणी, वर्तमान अध्ययन में दिखाया गया है. इससे कैंडिडा के लिए मानक एंटिफंगल दवाओं के साथ देखे गए पारंपरिक तंत्र के माध्यम से प्रतिरोध विकसित करना मुश्किल हो जाता है।

इस अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले तीन खमीर उपभेद, T0, T3n और T3p, अलग-अलग विकास पैटर्न प्रदर्शित करते हैं। T0 अनुपचारित रहता है, जबकि T3n और T3p तीन बार RB-PDT से गुजरते हैं। T3n सामान्य आकार की कॉलोनियों को प्रदर्शित करता है, जबकि T3p खूबसूरत कॉलोनियों को प्रदर्शित करता है। खूबसूरत कालोनियों की धीमी वृद्धि सेलुलर ऊर्जा और चयापचय में परिवर्तन का संकेत दे सकती है। खूबसूरत फेनोटाइप, अक्सर माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन4 से जुड़ा होता है, बिगड़ा हुआ एरोबिक श्वसन हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप समग्र विकास कैनेटीक्स प्रभावित होता है। खूबसूरत कॉलोनियों में बिगड़ा हुआ एरोबिक श्वसन उनकी उग्रता, दवा की संवेदनशीलता, या विभिन्न वातावरणों में बने रहने की क्षमता को प्रभावित कर सकता है। यह कनेक्शन संभावित नैदानिक प्रभाव रखता है और भविष्य के अनुसंधान दिशाओं के लिए अवसर प्रदान करता है।

एथिडियम ब्रोमाइड, एक डीएनए इंटरकालेटिंग एजेंट, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए संश्लेषण को रोकता है और मौजूदा माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए को नीचा दिखाता है, कैंडिडा को माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन14 के साथ खूबसूरत कॉलोनियों में बदल देता है। फ्लुकोनाज़ोल, आमतौर पर कैंडिडा संक्रमण के इलाज के लिए उपयोग किया जाता है, सी ग्लबराटा6 में दवा प्रतिरोध और खूबसूरत कॉलोनी विकास को प्रेरित कर सकता है। पेटिट म्यूटेंट प्रतिलेखन कारक पीडीआर 1 के सक्रियण और जीन सीडीआर1 और सीडीआर215 के विनियमन के माध्यम से एज़ोल दवा प्रतिरोध प्रदर्शित कर सकते हैं। इसके अलावा, माइटोकॉन्ड्रियल डीएनए के आंशिक या पूर्ण नुकसान के कारण, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन16 से समझौता किया जाता है।

पीडीटी ने बैक्टीरियल विषाणु17 को कम करने, एंटीबायोटिक दवाओं के लिए संवेदनशीलता को प्रेरित करने18 और बैक्टीरिया में बायोफिल्म गठन19 को कम करने में प्रभावकारिता का प्रदर्शन किया है। फंगल संक्रमण के खिलाफ पीडीटी पर अध्ययन सीमित हैं20. यह खोज इस बारे में पेचीदा सवाल उठाती है कि आरबी-पीडीटी माइटोकॉन्ड्रिया को कैसे प्रभावित करता है सी। पूरी तरह से समझने के लिए कि आरबी-पीडीटी खमीर कोशिकाओं को कैसे प्रभावित करता है, विकास विविधताओं के कारण आणविक तंत्र को समझना महत्वपूर्ण है। हालांकि, पीडीटी द्वारा प्रेरित खूबसूरत म्यूटेंट वर्तमान में कम अध्ययन किए गए हैं, और उनके विस्तृत यंत्रवत आधार स्पष्ट नहीं हैं। यह निर्धारित करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है कि क्या विभिन्न तरीकों से बनाई गई छोटी कॉलोनियों के बीच कोई अंतर है। यह समझना कि कैंडिडा प्रजातियों में पेटीट्स कैसे बनते हैं, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन और रोगजनकता के बीच संबंधों का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, खूबसूरत म्यूटेंट एंटिफंगल दवा प्रतिरोध तंत्र की खोज के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकते हैं।

वर्तमान अध्ययन, आरबी-मध्यस्थता पीडीटी के प्रभावों में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान करते हुए सी. ग्लबराटा और खूबसूरत कॉलोनियों के उद्भव में, कुछ सीमाएं हैं जिन पर विचार किया जाना चाहिए। सबसे पहले, अध्ययन मुख्य रूप से इन विट्रो प्रयोगों पर केंद्रित है, और नैदानिक सेटिंग्स के लिए इन निष्कर्षों का अनुवाद आगे की जांच वारंट करता है। इसके अतिरिक्त, आरबी-पीडीटी के बाद खूबसूरत कॉलोनियों के गठन और एंटिफंगल दवा प्रतिरोध के लिए उनके संभावित प्रभावों को अंतर्निहित विशिष्ट आणविक तंत्र को अधिक गहन अन्वेषण की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, जबकि अध्ययन ने विभिन्न खमीर उपभेदों के विकास पैटर्न की तुलना की, अतिरिक्त आणविक और आनुवंशिक विश्लेषण पेटिट कॉलोनी गठन से जुड़े चयापचय और आनुवंशिक परिवर्तनों की गहरी समझ प्रदान कर सकते हैं।

इसके अलावा, सी ग्लबराटा के विभिन्न नैदानिक आइसोलेट्स के बीच आरबी-पीडीटी के जवाब में संभावित परिवर्तनशीलता को इस अध्ययन में संबोधित नहीं किया गया था, जिसमें व्यापक तनाव-विशिष्ट जांच की आवश्यकता पर प्रकाश डाला गया था। इन सीमाओं को संबोधित करने वाले भविष्य के अध्ययन आरबी-मध्यस्थता पीडीटी के निहितार्थ और एंटिफंगल उपचार रणनीतियों के संदर्भ में खूबसूरत कॉलोनियों के उद्भव की अधिक व्यापक समझ के लिए महत्वपूर्ण होंगे।

संक्षेप में, इस जांच से पता चलता है कि aPDT बिगड़ा माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन के साथ C. glabrata (C2-1000907) पेटिट म्यूटेंट को प्रेरित करता है। यह अनूठा तंत्र एंटिफंगल अध्ययन के लिए एक नई विधि प्रदान कर सकता है। पीडीटी-प्रेरित खूबसूरत कॉलोनियों में अंतर्निहित कार्रवाई का सटीक तंत्र स्पष्ट किया जाना बाकी है, और चिकित्सीय रणनीतियों के अनुकूलन के लिए अन्य तरीकों से संभावित मतभेदों की खोज करना महत्वपूर्ण होगा।

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Disclosures

लेखक हितों के टकराव की घोषणा नहीं करते हैं।

Acknowledgments

इस काम को विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय, ताइवान [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी [K111-B094], [K111-B095], नेशनल चेंग कुंग यूनिवर्सिटी हॉस्पिटल, ताइवान [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057] से फंडिंग मिली है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filter Merck, Taipei, Taiwan Millex, SLGVR33RS
1.5 mL microfuge tube Neptune, San Diego, USA #3745
20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC) Sigma-Aldrich, MO, USA T8877
5 mL polypropylene round bottom tube Corning, AZ, USA 352059
5 mL round-bottom tube with cell strainer cap Corning, AZ, USA Falcon, #352235
96-well plate Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan #16196
Agar BRS, Tainan, Taiwan AG012
Blank disk Advantec, Tokyo, Japan 49005040
Centrifuge Eppendorf, UK 5415R
Ethidium bromide solution Sigma-Aldrich, MO, USA E1510
Fluconazole, 2 mg/mL Pfizer, NY, USA BC18790248
GraphPad Prism GraphPad Software Version 7.0
Green light emitting diode (LED) strip Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan 5050 Excitation wave: 500~550 nm
Low Temperature. shake Incubators Yihder, Taipei, Taiwan LM-570D (R)
Mouth care cotton swabs Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan 161357
Muller Hinton II agar BD biosciences, California, USA 211438
Multimode microplate reader Molecular Devices SpectraMax i3x
OD600 spectrophotometer Biochrom, London, UK Ultrospec 10
Rose Bengal Sigma-Aldrich, USA 330000 stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 °C
Sterilized glass tube Sunmei, Tainan, Taiwan AK45048-16100
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium HIMEDIA, India M1363

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References

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