הרכבה אגר: שיטה בסיסית של הרכבה עוברי זברה חיה להדמיה לטווח ארוך

Overview

וידאו זה מתאר צעד אחר צעד הוראות על הרכבה עוברי זברה חי על צלחת 6 גם באמצעות agarose להמיס נמוך. הוא גם מספק את התהליך כדי לרכוש תמונות של עוברים חיים ולנתח אותו באמצעות תוכנה.

Protocol

1. הגדרת מיקרוסקופ, רכישת תמונה, עיבוד וניתוח

1. הכן 0.8% נקודת התכה נמוכה (LMP) agarose: להוסיף 0.8 גרם LMP agarose ל 100 מיליליטר E3 וחום עד מומס לחלוטין. בעוד חם, aliquot 1 מ"ל של LMP agarose לתוך 1.5 מ"ל צינורות microfuge בבלוק חימום 37 מעלות צלזיוס. ה-LMP agarose יישאר מותך ב 37 °C (69 °F). הוסף 40 μl של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaine לכל 1 מיליליטר aliquot של LMP agarose ב 37 °C (77 °F).
   1. לאחסן את agarose LMP הנותרים במשך כמה חודשים בצינורות אטומים 50 מ"ל ב 4 מעלות צלזיוס.
2. הרדמה עוברים טרביוטיים שיש לדמות על ידי הוספת 1 מ"ל של 4 מ"ג / מ"ל (25x), pH 7.0 tricaine ל 25 מ"ל של E3 כי העוברים כבר נמצאים.
3. בעדינות מערבולת את המנה, כך העוברים יהיה בריכה באמצע. לאחר מכן, באמצעות פיפטה העברת פלסטיק רחב, לצייר את העוברים בנוזל קטן ככל האפשר. להפוך את פיפטה זקוף בעדינות להקפיץ את העוברים, כך שהם להתיישב לתחתית פיפטה.
   1. עם העוברים בתחתית פיפטה, להעביר אותם 1 מיליליטר aliquot של LMP agarose על ידי נגיעה קלה קצה פיפטה אל פני השטח של agarose. הימנע העברת נוזל עודף כמו זה ידלל את agarose.
4. לאחר גירוש הנוזל העודף מהפיפט, השתמש בפיפט כדי לערבב בעדינות את העוברים בתוך האגורוז, ולאחר מכן השתמש בפיפט כדי להעביר את כל האפרוז והעוברים לבאר של תחתית זכוכית (מס '1.5 coverslip), צלחת 6-well.
   שים לב: הקפד להשליך את פיפטה לאחר העברת העוברים ללוח ההדמיה. שאריות agarose יהיה להגדיר בתוך פיפטה, מה שהפך אותו לא יעיל לשימוש נוסף. במקום זאת, השתמש פיפטה חדשה בכל פעם.
5. תחת סטריאוסקופ, השתמש בקצה פיפטה לטעינת ג'ל קבוע בקצה מחט מתגרה עם ידית עץ כדי למקם את העוברים כלפי מטה לכיוון זכוכית הכיסוי (כדי להבטיח שהם נמצאים במרחק העבודה של מטרת המיקרוסקופ) ובכיוון הרצוי להדמיה.
   שים לב: מקם מחדש ברציפות עד שההתעוררות תגדיר לחלוטין. יש להקפיד על הר העוברים הפרביוטיים לפיהם יש לדמות עובר של הזוג. בהתחשב בכיוון האקראי של העוברים האחידים, עבור זוגות מסוימים זה עלול להיות קשה לדמיין את שני העוברים. בתרחיש זה, לשחזר את העוברים מן agarose באמצעות מלקחיים פיפטה העברת פלסטיק רחב קצה ולאחר מכן remount עבור הדמיה מנקודת מבט אחרת.
6. לאחר agarose יש להגדיר, לכסות עם 2 - 3 מ"ל של E3 בתוספת טריקאין (ו PTU במידת הצורך).
7. צלם את העוברים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל הפוך של שדה רחב, קונפוקל סריקת לייזר או מיקרוסקופ קונפוקל של דיסק מסתובב. בחר את המטרה המתאימה ביותר להדמיה הרצויה. לשדה ראייה של עובר שלם, השתמש במטרה 4x. בחר הגדלה גבוהה יותר, כגון מטרה של 20x, כדי לדמות רקמה ספציפית
   שים לב: אם משתמשים במיקרוסקופ זקוף, הרכבה ב- LMP agarose (בדומה לעיל) על תלוש כיסוי זכוכית. הפוך את כיסויי הזכוכית על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית בעלת טבעת של שומן ואקום מלא באותו E3-tricaine-PTU.
8. תהליך תמונות שנרכשו באמצעות חבילות תוכנה לניתוח תמונה חינם כגון NIH Image J / FIJI.
   שים לב: ספור מספרי תאים וכמת דינמיקה כגון העברת תאים וחלוקת תאים באמצעות אלגוריתמים של פילוח ומעקב.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000