한천 장착: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 를 장착하는 기본 방법

Overview

이 비디오는 낮은 용융 아가로즈를 사용하여 6 웰 플레이트에 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 단계별 지침을 설명합니다. 또한 살아있는 배아의 이미지를 획득하고 소프트웨어를 사용하여 분석하는 프로세스를 제공합니다.

Protocol

1. 현미경 설정, 이미지 수집, 처리 및 분석

1. 0.8% 낮은 융점(LMP) 아가로즈 준비: 0.8g LMP 아가로즈를 100ml E3에 넣고 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 뜨거운 동안, LMP 아가로즈 의 알리 쿼트 1 ml 37 °C 가열 블록에서 1.5 ml 마이크로 퍼지 튜브로. LMP 아가로즈는 37°C에서 용융 상태로 유지됩니다. 4 mg / ml (25x), pH 7.0 트리카인을 LMP 아가로즈 의 각 1 ml 알리쿼트에 37 °C. 참고 : 색소 변형으로 작업하는 경우 각 1ml 알리 쿼트에 0.15 %(50x) PTU의 20 μl을 추가하십시오.
   1. 나머지 LMP 아가로즈를 밀봉된 50ml 튜브에 몇 달 동안 저장하여 4°C에 보관하십시오.
2. 마취파라바이오틱 배아는 4 mg/ml(25x)의 1ml, pH 7.0 트리카인을 E3의 25 ml에 첨가하여 배아가 이미 들어있는 것으로 분석한다.
3. 배아가 중간에 풀이되도록 부드럽게 접시를 소용돌이. 그런 다음, 넓은 기울어진 플라스틱 이송 파이펫을 사용하여 가능한 한 적은 액체로 배아를 그립니다. 파이펫을 똑바로 세워 배아를 부드럽게 바운스하여 파이펫의 맨 아래에 정착합니다.
   1. 파이펫 바닥에 배아를 사용하면 파이펫 끝을 아가로즈 표면에 가볍게 터치하여 LMP 아가로즈 의 1 ml 알리쿼트로 옮겨 넣습니다. 이 아가로즈를 희석할 것이기 때문에 과도한 액체를 옮기지 마십시오.
4. 파이펫에서 여분의 액체를 배출 한 후, 파이펫을 사용하여 아가로즈 내의 배아를 부드럽게 혼합 한 다음 파이펫을 사용하여 모든 아가로즈와 배아를 유리 바닥 (No. 1.5 커버 슬립), 6 웰 플레이트의 우물로 옮겨 냅니다.
   참고: 배아를 이미징 플레이트로 옮김한 후 파이펫을 폐기해야 합니다. 잔류 아가로즈는 파이펫 내부에 설정되어 추가 사용에 효과가 없습니다. 오히려 매번 새 파이펫을 사용하십시오.
5. 입체 스코프에서, 나무 처리 괴롭히는 바늘의 끝에 고정 된 젤 로딩 파이펫 팁을 사용하여 배아를 커버 유리쪽으로 내려 놓고 (현미경 목표의 작업 거리 내에 있는지 확인) 및 이미징을위한 원하는 방향으로.
   참고: 아가로즈가 완전히 설정 될 때까지 지속적으로 재배치. 쌍의 배아가 이미지될 수 있는 파라바이오틱 배아를 탑재하도록 주의하십시오. 결합된 태아의 무작위 방향을 감안할 때, 몇몇 쌍을 위해 두 배아를 모두 심상하기 어려울 지도 모릅니다. 이 시나리오에서는, 집게와 넓은 기울어진 플라스틱 전송 파이펫을 사용하여 아가로즈에서 배아를 복구한 다음 다른 관점에서 이미징을 위해 재마운트합니다.
6. 아가로즈가 설정되면, 트리카인 (및 필요한 경우 PTU)로 보충 E3의 2 - 3 ml로 커버.
7. 반전된 광야 에피 형광, 레이저 스캐닝 공초점 또는 회전 디스크 공초점 현미경을 사용하여 배아를 이미지합니다. 원하는 이미징에 가장 적합한 목표를 선택합니다. 전체 배아 시야의 경우 4배 목표를 사용하십시오. 특정 조직을 이미지화하기 위해 20배 목표와 같은 더 높은 배율을 선택합니다.
   참고: 직립 현미경을 사용하는 경우, 유리 커버 슬립에 LMP 아가로즈 (위와 유사)에 마운트. 같은 E3-트리카인-PTU로 채워진 진공 그리스링이 있는 유리 현미경 슬라이드에 유리 커버슬립을 반전시키십시오.
8. NIH 이미지 J/FIJI와 같은 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 획득한 이미지를 프로세스합니다.
   참고: 셀 번호를 계산하고 세분화 및 추적 알고리즘을 사용하여 셀 마이그레이션 및 셀 분할과 같은 역학을 정량화합니다.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LMP agarose (Ultrapure LMP agarose)	Invitrogen	16520100
Tricaine (powder) (Tricaine Methanesulfonato, Tricaine-S)	Western Chemical Inc	MS 222
Glass-bottom 6-well plates used for imaging	MatTek	P06G1.5-20-F
10 ml pipette pump (green) (Pipette Pump Pipettor)	Novatech International	F37898-0000