制备小鼠脑组织中的免疫电镜
Summary
我们描述transcardiac灌注小鼠，拆除和切片的大脑，以及免疫过氧化物酶染色，树脂包埋，和脑切片切片超薄协议。这些程序完成后，免疫染色材料透射电子显微镜检查的准备。
Abstract
透射电子显微镜（TEM）是非常有用的可视化的小胶质细胞，oligodendrocytic，星形胶质细胞和神经细胞的亚细胞（树突棘，枝蔓，轴突，轴突终端，perikaryon），以及他们的细胞器和细胞骨架在中枢神经系统，高空间分辨率。预嵌入免疫细胞化学与透射电镜相结合，允许具有几个鲜明的特点和鉴定标准（例如，小胶质细胞perikarya和流程，当使用一种抗体对小胶质细胞特异性标志物Iba1（钙离子结合适配器分子1的细胞成分的歧视;提出在这里）），识别细胞分子神经递质的内容（如五羟色胺）和可溶性或膜结合的蛋白质的超微结构定位（例如，5 HT1A和EphA4受体）。在这里，我们描述了协议transcardiac灌注小鼠丙烯醛固定液，拆除和大脑切片，以及免疫过氧化物酶 – 二氨基联苯胺（DAB）染色，树脂包埋，以及超薄的脑切片切片。这些程序完成后，免疫染色的材料是用透射电子显微镜检查的准备。如果严格执行，这种技术之间最佳的超微结构的保存及免疫细胞化学检测提供了一个很好的折衷。
Protocol
Discussion
在这里，我们描述了小鼠脑组织的准备，免疫电镜，最佳的超微结构的保存及免疫细胞化学检测时严格执行程序之间提供了一个很好的折衷协议。
用透射电子显微镜相结合，这种方法可以区分具有几个鲜明的特点和鉴定标准的蜂窝元素。特别是，Iba1免疫过氧化物酶- DAB染色，使确定的小胶质细胞perikarya和流程内的神经纤维，以及分析它们的形态，细胞器超微结构的关系，并?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢少明路和哈里斯答：格尔巴德蠕动泵和vibratome的使用，以及在电子显微镜下研究的罗切斯特大学医学中心为技术援助的核心设施，克伦L. Bentley和盖尔施耐德。这项工作是由来自美国国立卫生研究院（EY019277），白厅基金，宝来惠康基金，和艾尔弗雷德斯隆基金会的AKM的资助。 M.-È.T.是由一个全宗RECHERCHE EN桑特魁北克（FRSQ）博士后奖。
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
Referências
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
