Подготовка ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии
Summary
Мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с просвечивающей электронной микроскопии.
Abstract
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является чрезвычайно полезным для визуализации микроглии, oligodendrocytic, астроцитов и нейронов субклеточных купе (дендрита, дендритных позвоночника, аксона, аксон терминал, perikaryon), а также их внутриклеточных органелл и цитоскелета, в центральной нервной системе при высоким пространственным разрешением. В сочетании с ТЕМ, предварительно вложение иммуноцитохимии позволяет дискриминации клеточных элементов с несколькими отличительными чертами и определение критериев (например, микроглии perikarya и процессов, при использовании антител против микроглии-специфическим маркером Iba1 (ионизированного кальция связывающей молекулы адаптер 1, представленный здесь)), определение нейротрансмиттеров содержание клеточных элементов (например, серотонинергические) и их ультраструктурным локализации растворимых или мембраной белков (например, 5 HT1A и EphA4 рецепторы). Здесь мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей с фиксатором акролеин, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного-диаминобензидина (DAB) окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с ТЕА. Когда строго выполняется, этот метод обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения.
Protocol
Discussion
Здесь мы описали протокол для подготовки ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии, которая обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения, когда процедуры строго выполняется.
В сочета?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Шао-Минг Лу Харрис и А. Гелбард для использования перистальтического насоса и vibratome, а также Карен Л. Бентли и Гейл Шнайдер в электронный микроскоп исследований Основные фонда из Университета Рочестера медицинский центр для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась за счет грантов от NIH (EY019277), Уайтхолл Фонда Burroughs Wellcome фонд и Фонд Альфреда П. Слоуна в АКМ. M.-È.T. финансируется за счет Fonds-де-ла изысканная ан santé Квебека (FRSQ) докторской награды обучения.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
| Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
| *Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
| Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
| *Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
| Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
| Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
| *Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
| Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
| Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
| Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
| Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
| Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
| DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
| Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
| ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
| Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
| High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
| Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
| Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
| Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
| Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.
Referências
- Venable, J. H., Coggeshall, R. A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy. J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).
- Riad, M. Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain. J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).
- Tremblay, M. E. Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus. J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).
- Tremblay, M. E. Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus. J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).
- Bouvier, D. Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain. J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).
- Bouvier, D. EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain. J Neurochem. , (2010).
