Мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с просвечивающей электронной микроскопии.
Просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) является чрезвычайно полезным для визуализации микроглии, oligodendrocytic, астроцитов и нейронов субклеточных купе (дендрита, дендритных позвоночника, аксона, аксон терминал, perikaryon), а также их внутриклеточных органелл и цитоскелета, в центральной нервной системе при высоким пространственным разрешением. В сочетании с ТЕМ, предварительно вложение иммуноцитохимии позволяет дискриминации клеточных элементов с несколькими отличительными чертами и определение критериев (например, микроглии perikarya и процессов, при использовании антител против микроглии-специфическим маркером Iba1 (ионизированного кальция связывающей молекулы адаптер 1, представленный здесь)), определение нейротрансмиттеров содержание клеточных элементов (например, серотонинергические) и их ультраструктурным локализации растворимых или мембраной белков (например, 5 HT1A и EphA4 рецепторы). Здесь мы опишем протокол для transcardiac перфузии мышей с фиксатором акролеин, удаление и срезов мозга, а также иммунопероксидазного-диаминобензидина (DAB) окрашивание, смолы вложения, и ультратонких срезов мозга разделов. После завершения этих процедур, immunostained материал будет готов для рассмотрения с ТЕА. Когда строго выполняется, этот метод обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения.
Здесь мы описали протокол для подготовки ткани мозга мыши для иммуноэлектронной микроскопии, которая обеспечивает отличный компромисс между оптимальными ультраструктурным сохранение и иммуноцитохимического обнаружения, когда процедуры строго выполняется.
В сочета?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Шао-Минг Лу Харрис и А. Гелбард для использования перистальтического насоса и vibratome, а также Карен Л. Бентли и Гейл Шнайдер в электронный микроскоп исследований Основные фонда из Университета Рочестера медицинский центр для оказания технической помощи. Эта работа финансировалась за счет грантов от NIH (EY019277), Уайтхолл Фонда Burroughs Wellcome фонд и Фонд Альфреда П. Слоуна в АКМ. M.-È.T. финансируется за счет Fonds-де-ла изысканная ан santé Квебека (FRSQ) докторской награды обучения.
Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
Sodium pentobarbital (Nembutal) | Ovation Pharmaceuticals | |||
Filter paper 315 24 cm | VWR | 28331-081 | ||
*Acrolein purum (≥95%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 01680 | ||
Sodium borohydride (≥98%) | Sigma-Aldrich (Aldrich) | 452173 | ||
*Prilled paraformaldehyde (PFA) (95%) | Sigma-Aldrich | 441244 | ||
Normal goat serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | ||
Rabbit anti-Iba1 primary antibody | Wako | 019-19741 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Biotin-SP-conjugated AffiniPure F(ab’)2 fragment goat anti-rabbit IgG, Fc fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 111-066-046 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
Peroxidase-conjugated streptavidin | Jackson ImmunoResearch | 016-030-084 | Stored at -20°C, 1:1 in glycerol | |
*Osmium tetroxide 4% solution | Electron Microscopy Sciences | 19150 | Light sensitive | |
Propylene oxide (≥99%) | Sigma-Aldrich (Fluka) | 82325 | ||
Polypropylene disposable beakers (50 mL) | Fisher | 01-291-10 | ||
Aluminium weigh dishes (70 mm) | Fisher | NC9261784 | ||
Durcupan epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14040 | ||
Embedding mold | Electron Microscopy Sciences | 70907 | ||
DPX mountant for histology | Sigma-Aldrich (BioChemika) | 44581 | ||
Gelatin subbed slides | VWR | 100241-864 | ||
ACLAR embedding films (7.8 mm) | Electron Microscopy Sciences | 50425 | ||
Capsule mold | Electron microscopy Sciences | 70150 | ||
High-performance super glue | Corporate Express | LOC30379 | ||
Perfect loop for ultra thin sections | Electron Microscopy Sciences | 70944 | ||
Superfrost slides | Fisher | 22-178-277 | ||
Diamond knife ultra 45° (2.5-3.5 mm) | Diatome | |||
Gelatin from cold water fish skin (~45%) | Sigma-Aldrich (Sigma) | G7765 |
*One should always work under a fume hood and wear nitrile gloves when handling acrolein, paraformaldehyde, and osmium and should also dispose of their waste properly.