Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra embrionarias

Summary

Este artículo describe un método para microdissect retinas del pez cebra con y sin epitelio pigmentario de la retina adjunta, de uno a tres embriones postfertilización días.

Abstract

Pez cebra es un modelo animal popular para la investigación sobre el desarrollo del ojo, debido a su rápida<em> Ex utero</em> El desarrollo y la fecundidad buena. A los 3 días después de la fertilización (dpf), las larvas se mostrará la primera respuesta visual. Muchos genes se han identificado para el control de un desarrollo adecuado de los ojos, pero estamos lejos de una comprensión completa de la arquitectura genética subyacente. Gen de todo el genoma de perfiles de expresión es una herramienta útil para dilucidar red de regulación genética para el desarrollo del ojo. Sin embargo, el pequeño tamaño del ojo de embriones de pez cebra hace que sea difícil obtener los tejidos del ojo intacto y puro para análisis de la expresión. Por ejemplo, la longitud antero-posterior del ojo, entre el día 2 y 3 es de sólo unos 200 a 300 micras, mientras que el diámetro de la lente es m menos de 100. Además, el epitelio pigmentario retiniano (EPR) que subyacen a la retina es un epitelio de una sola capa. Mientras que los perfiles de expresión genética se puede obtener de todo el embrión, que no representan con precisión la expresión de estos tejidos. Por lo tanto el tejido puro debe ser obtenido por un perfil de expresión génica con éxito el desarrollo del ojo. Para solucionar este problema, hemos desarrollado un enfoque para microdissect retina intacta y la retina con el EPR adjunto de fdd 1-3, que abarcan las principales etapas de la morfogénesis del ojo. Todos los procedimientos se puede hacer con unas pinzas finas y suministros generales de laboratorio con microscopios estereoscópicos estándar. Para la disección de la retina, el EPR de una sola capa se elimina y se quitó el cepillo de acción y la adhesión preferencial de los restos del EPR a la superficie de la placa de cultivo para la disección. Para RPE-adjunta la disección de retina, la adhesión de RPE de la placa de la disección se produce antes de la disección a fin de que el EPR puede ser conservado en su totalidad con la retina. Una acción de elevación cuidadosa de este tejido permite la separación de la coroides y la esclerótica presunto. La lente se puede quitar en ambos casos por una aguja de tungsteno grabada químicamente. En resumen, nuestro enfoque puede obtener tejidos intactos los ojos y ha sido utilizado con éxito para el estudio de tejidos específicos perfiles de expresión de la retina del pez cebra^{1, 2} Y el epitelio pigmentario de la retina³.

Protocol

Parte 1: Preparativos antes de microdisección Soluciones E3 medio 4 (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl 2 y 0,33 mM MgSO 4). Solución de Ringer 1, 5 (116 mM NaCl, 2,9 mM KCl, 1,8 mM CaCl 2, 5 mM HEPES, pH 7.2), esterilizado por filtración. NaOH 5N. Ataque químico de las agujas de tungsteno Asegurar un pequeño vaso que contiene NaOH 5 N en una placa de Petri de a…

Discussion

Microdisección de los tejidos del ojo de pez cebra puede efectivamente obtener la retina intacta y las retinas de RPE-adjunto. Esto ayuda considerablemente los estudios de expresión pertenecientes a un tejido ocular específico (es decir, la retina o RPE). De hecho, hemos utilizado con éxito estos procedimientos para obtener los perfiles de expresión de ARN de toda la retina y el EPR ^{1 3.} La utilidad de estos perfiles es apoyado fuertemente por nuestra reciente identificación de las vías y las familias …

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.