Zebra balığı Embriyonik Göz Dokular, Mikrodisseksiyon
Summary
Bu makalede, retina pigment epitel birini üç gün postfertilization embriyolar bağlı olan ve olmayan zebrafish retina microdissect bir yaklaşım açıklanmıştır.
Abstract
Zebra balığı nedeniyle hızlı göz gelişimi üzerinde bir araştırma için popüler bir hayvan modeli<em> Eski utero</em> Geliştirme ve iyi fekondite. 3 gün fertilizasyon (dpf), larvaların ilk görsel tepki gösterecektir. Uygun bir gözün gelişimini kontrol etmek için Birçok genler tespit, ancak altta yatan genetik mimarisinin tam bir anlayış uzak olmuştur. Tüm genom gen ekspresyonu, göz gelişimi için genetik düzenleyici ağ aydınlatmak için yararlı bir araçtır. Ancak, embriyonik zebrafish göz küçük boyutu, zorlu ekspresyon analizi için sağlam ve saf göz dokularında elde etmek için yapar. Örneğin objektif çapı az 100 mikron iken, günde 2 ile 3 arasında gözün ön-arka uzunluğu, sadece yaklaşık 200-300 mm. Ayrıca, retina altında yatan retina pigment epitel (RPE), sadece bir tek katlı epitel. Gen ekspresyon profilleri bütün embriyo elde edilebilir olsa da, onlar doğru bu dokuların ifade temsil yoktur. Bu nedenle saf doku göz gelişimi başarılı bir gen ekspresyon profili için alınmalıdır. Bu sorunu gidermek için, göz morfolojilerinden önemli aşamaları kapsayan RPE ile 1-3 dpf'e bağlı sağlam retina ve retina, microdissect bir yaklaşım geliştirdik. Tüm işlemler, standart stereomicroscopes altında ince forseps ve genel laboratuar gereçleri ile yapılabilir. Retina diseksiyon için, tek katmanlı RPE kaldırılır ve eylem ve tercihli bağlılık diseksiyon için kültür plaka yüzeyine RPE kalıntıları fırçalama sıyrılır. RPE retinanın tamamen korunmuş böylece RPE bağlı retina diseksiyon için, RPE diseksiyonu plaka bağlılık diseksiyonu önce çıkarılması. Bu doku dikkatli bir kaldırma eylemi verimli olası koroid ve sklera ayırabilirsiniz. Objektif, kimyasal olarak kazınmış bir tungsten iğne ile her iki durumda da kaldırılabilir. Kısacası, bizim yaklaşımımız sağlam göz dokularını almak ve başarıyla zebrafish retina doku-spesifik ekspresyon profillerini incelemek için kullanılmıştır.<sup> 1, 2</sup> Ve retinal pigment epitel<sup> 3</sup>.
Protocol
Discussion
Zebrafish göz dokularında Mikrodisseksiyon etkin bir şekilde sağlam retina ve RPE bağlı retina elde edebilirsiniz. Bu ifade belirli bir göz doku (yani retina veya RPE) ile ilgili çalışmalar önemli ölçüde yardımcı olur. Aslında, tüm retina 1 ve RPE 3 RNA ekspresyon profillerini elde etmek için bu işlemler başarıyla kullanmış olması. Bu profilleri programı güçlü bir retina farklılaşma mutant 2 tedirgin olan yollar ve gen ailelerinin son kimlik tarafından des…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Purdue Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden mezun bir başlangıç fonu tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cordless pestle motor | VWR | 47747-370 | ||
| DC power supply | Lascar | PSU130 | Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization. | |
| Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free) | VWR | 47747-366 | These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis. | |
| Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox | World Precision Instruments | 500341 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox | Fine Science Tools | 11252-00 | Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time. | |
| Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm | BD Biosciences | 351007 | These plates are used as dissection plates. | |
| Olympus SZX16 Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed. | |
| Sharpening stone | Fine Science Tools | 29008-01 | Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary | |
| Thermo plate | Tokai Hit | MATS-U55SZX2B | This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success. | |
| Trizol, 100 mL | Invitrogen | 15596-026 | ||
| tungsten wire, 0.015 inch diameter | World Precision Instruments | TGW1510 | ||
| Wooden Applicator | Puritan | 807 | This is used for holding the chemically-etched tungsten needle. |
Referências
- Leung, Y. F., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retina. Zebrafish. 2, 269-283 (2005).
- Leung, Y. F., Ma, P., Link, B. A., Dowling, J. E. Factorial microarray analysis of zebrafish retinal development. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 12909-12914 (2008).
- Leung, Y. F., Ma, P., Dowling, J. E. Gene expression profiling of zebrafish embryonic retinal pigment epithelium in vivo. Invest Ophthalmol Vis Sci. 48, 881-890 (2007).
- Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish : a practical approach. , (2002).
- Westerfield, M. The zebrafish book : a guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev Dyn. 203, 253-310 (1995).
- Fadool, J. M., Dowling, J. E. Zebrafish: a model system for the study of eye genetics. Prog Retin Eye Res. 27, 89-110 (2008).
