Microdissection של רקמות דג הזברה העין עובריים

Summary

מאמר זה מתאר גישה microdissect הרשתיות דג הזברה עם ובלי אפיתל הפיגמנט ברשתית מחוברת, 1-3 עוברים ימים postfertilization.

Abstract

דג הזברה הוא מודל החיה פופולרי למחקר על התפתחות העין בגלל המהירה שלה<em> לשעבר ברחם</em> פיתוח פוריות טובה. על ידי הפריה 3 ימים הודעה (DPF), הזחלים יראה את התגובה החזותית הראשונה. גנים רבים זוהו לשלוט על התפתחות העין הנכונה, אבל אנחנו רחוקים מהבנה מלאה של הארכיטקטורה הגנטית הבסיסית. הגנום כולו הגן פרופיל הביטוי הוא כלי שימושי להבהיר רשת רגולטורית גנטי להתפתחות העין. עם זאת, גודלו הקטן של העין עוברי דג הזברה עושה את זה מאתגר להשיג ברקמות העין שלם וטהור לניתוח הביטוי. לדוגמה, אורך קדמית, אחורית של העין בין יום 2 ו 3 רק כ 200-300 מיקרומטר, כאשר הקוטר של העדשה הוא 100 מיקרומטר פחות. כמו כן, אפיתל הפיגמנט ברשתית (הרשתית) שבבסיס הרשתית היא רק אפיתל שכבה אחת. בעוד הביטוי פרופילים הגן ניתן לקבל העובר כולו, הם לא לייצג במדויק את הביטוי של רקמות אלה. לכן רקמות טהור יש לקבל עבור פרופיל ביטוי מוצלח של פיתוח הגן העין. כדי לטפל בבעיה זו, פיתחנו גישה microdissect הרשתית הרשתית שלם עם הרשתית מחוברים מן DPF 1-3, אשר מכסים שלבים עיקריים של המורפוגנזה העין. כל הנהלים ניתן לעשות עם מלקחיים בסדר וציוד מעבדה כללי לפי stereomicroscopes סטנדרטי. עבור לנתיחה הרשתית, הרשתית שכבה אחת היא להסיר קילף ידי צחצוח הפעולה ואת הדבקות מועדף של שרידי הרשתית אל פני השטח של הצלחת תרבות לנתיחה. עבור לנתיחה הרשתית המצורפת רשתית, הדבקות של הרשתית הצלחת הניתוח יוסר לפני לנתיחה, כך הרשתית ניתן לשמר לחלוטין עם הרשתית. פעולה הרמת זהיר של רקמה זו יכולה ביעילות להפריד את דמית העין sclera משוערת ו. העדשה ניתן להסיר בשני המקרים על ידי מחט טונגסטן חרוט כימית. בקיצור, הגישה שלנו יכול להשיג ברקמות העין שלמים נוצל בהצלחה כדי ללמוד ספציפיים רקמות ביטוי פרופילים של הרשתית דג הזברה^{1, 2} ו אפיתל הפיגמנט ברשתית³.

Protocol

חלק 1: הכנות לפני microdissection פתרונות E3 בינוני 4 (5 mM NaCl, KCl mM 0.17, 0.33 mM CaCl 2 ו – 0.33 mM MgSO 4). הפתרון של הצלצול 1, 5 (116 mM NaCl, KCl m…

Discussion

Microdissection של רקמות דג הזברה עין יכול למעשה לקבל הרשתיות שלם הרשתית המצורפת הרשתיות. זו מסייעת באופן משמעותי מחקרים ביטוי הנוגעים רקמת עין ספציפיים (כלומר הרשתית הרשתית או). למעשה, יש לנו מנוצל בהצלחה הליכים אלה להשיג פרופילים ביטוי RNA של הרשתית כולה ¹ ו ³ הרש?…

Materials

Material Name	Tipo	Company	Catalogue Number	Comment
Cordless pestle motor		VWR	47747-370
DC power supply		Lascar	PSU130	Any DC supply would work. The specific voltage of a different machine will need further optimization.
Disposable pestle & microtube, 1.5 mL (DNase, RNase and pyrogen-free)		VWR	47747-366	These are used for tissue collection in TRIzol for expression analysis.
Dumont #5 forceps, Tips: 0.05 x 0.01mm, Inox		World Precision Instruments	500341	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Dumont #5SF forceps, Tips: 0.025 x 0.005mm, Inox		Fine Science Tools	11252-00	Fine tip dimension is desirable but is not inflexible, as one may need to sharpen the tip from time to time.
Falcon polystyrene culture plates, 60 X 15 mm		BD Biosciences	351007	These plates are used as dissection plates.
Olympus SZX16 Stereomicroscope		Olympus	SZX16	Any stereomicroscope would work. We used Leica stereomicroscope in previous studies1-3 without any issues. We also use the 1X objective exclusively for the dissection even though we have a 2X objective installed.
Sharpening stone		Fine Science Tools	29008-01	Use this to sharpen the tip of the forceps if necessary
Thermo plate		Tokai Hit	MATS-U55SZX2B	This is used to maintain the temperature of the tissue throughout dissection and minimize the influence of temperature fluctuation on gene expression. We also put the whole microscope in an environmentally controlled room at 28°C during dissection in previous studies1-3 with good success.
Trizol, 100 mL		Invitrogen	15596-026
tungsten wire, 0.015 inch diameter		World Precision Instruments	TGW1510
Wooden Applicator		Puritan	807	This is used for holding the chemically-etched tungsten needle.